Partea 1: Compuși bioactivi din Ephedra Fragilis: optimizarea extracției, caracterizarea chimică, activitățile antioxidante și antiglicație

Pentru mai multe informatii. a lua legaturatina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Metodologia suprafeței de răspuns (RSM) cu un design Box-Behnken (BBD) a fost utilizată pentru a optimiza extracția compușilor bioactivi din Ephedra fragilis. Rezultatele au sugerat că extracția cu 61,93% etanol la 44,43 grade timp de 15,84 ore a fost cea mai bună soluție pentru această combinație de variabile. Extractul de etanol brut (CEE) obţinut în condiţii optime de extracţie a fost fracţionat secvenţial cu solvenţi cu polaritate crescândă. Conținutul de fenolic total (TP) și flavonoid total (TF), precum șiantioxidantși s-au măsurat activitățile antiglicație. Profilul de amprentă fitochimic al fracției cu cea mai mare activitate a fost caracterizat prin utilizarea RP-HPLC. Fracția de acetat de etil (EAF) a avut cel mai mare conținut de TP și TF și a prezentat cele mai puternice activități antioxidante și antiglicatoare. Rezultatele analizei de corelație Pearson au arătat că conținuturile de TP și TF au fost corelate în mod semnificativ cu activitățile antioxidante și antiglicative. În total, șase compuși au fost identificați în EAF de E. fragilis, inclusiv patru acizi fenolici și două flavonoide. În plus, analiza de andocare moleculară a arătat, de asemenea, posibila legătură între compușii bioactivi identificați și mecanismele lor de acțiune. Rezultatele noastre sugerează noi dovezi privind activitățile antioxidante și antiglicative ale compușilor bioactivi de E. fragilis care pot fi aplicate în tratamentul și prevenirea îmbătrânirii și a complicațiilor asociate cu glicația.

Cuvinte cheie: Ephedra fragilis; metodologia suprafeței de răspuns; Design Box-Behnken; compuși bioactivi; RP-HPLC; activitate antioxidantă și antiglicativă

Click aici pentru a afla mai multe produse

1. Introducere

Expunerea continuă la agresori din diverse surse poate duce la o creștere a inradicali liberiproducția în organismul uman, depășind capacitatea acestuia de a le regla și, în timp, contribuie la dezvoltarea mai multor boli asociate stresului oxidativ, inclusiv îmbătrânirea și diabetul[1]. Prin urmare,antioxidantiSuplimentarea poate ajuta la menținerea unui sistem biologic optim prin eliminarea concentrațiilor excesive de radicali liberi [2]. S-a demonstrat că radicalii liberi participă la procesul de glicare. Glicația, o reacție spontană neenzimatică între grupările amino disponibile ale reziduurilor de aminoacizi din proteine ​​și zaharurile reducătoare, are loc într-o măsură mai mare în timpul îmbătrânirii și hiperglicemiei, ducând la producerea și acumularea de produse finale de glicație avansată (AGE) 3]. Pe lângă faptul că interferează cu proteinele și le modifică funcționalitatea, AGE-urile pot de asemenea

se angajează cu receptorul pentru AGEs (RAGE), un receptor de suprafață cu celule multiligand de 45 KDa aparținând superfamiliei imunoglobulinelor [4] și activează mai multe căi de semnalizare intracelulară în aval, însoțite de o creștere a producției de radicali liberi care contribuie la complicațiile patologice legate de la diabet [5].

Este bine stabilit că antioxidanții și moleculele captatoare de radicali sunt buni protectori împotriva acestor procese [6]. Folosirea plantelor medicinale în prevenirea și contrabalansarea bolilor asociate stresului oxidativ este o tradiție medicală veche. Recent, multe studii au demonstrat că metaboliții secundari precum taninurile, acizii fenolici și flavonoizii cu potențial dublu antioxidant și antiglicativ sunt mai eficienți în tratarea diabetului zaharat [7]. Prin urmare, identificarea de noi surse de substanțe fitochimice care captează eficient radicalii liberi și reduc glicația non-enzimatică este de mare interes.

Ephedra fragilis este un membru al genului Ephedra (familia Ephedracea) care conține peste 60 de specii care cresc în condiții deșertice și semiaride în ambele emisfere de pe șase continente [8]. De mai bine de 5000 de ani, multe specii din genul Ephedra au fost utilizate în mod obișnuit în medicina tradițională chineză (MTC) pentru tratamentul mai multor boli; au existat mai multe studii care au raportat beneficiile lor multiple pentru sănătate, cum ar fi antiinflamatorii [9, anti-invazive, anti-angiogenice, [10], antimicrobiene, antiproliferative, pro-apoptotice [11], neuroprotectoare [12], hepatoprotectoare și anti -proprietăți oxidante [13]. Flavonoidele, alcaloizii, acizii fenolici și alți compuși din plantele Ephedra au fost considerați principalele componente fitochimice pentru aceste proprietăți farmacologice [14]. În industria farmaceutică, cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă (RP-HPLC) este utilizată pe scară largă ca metodă analitică pentru detectarea și identificarea compușilor chimici pe baza proprietăților lor hidrofobe diferite, deși puține studii sunt descrise în literatura de specialitate pentru analiza chimică a Specii Ephedra.

Procesul de extracție a acestor compuși bioactivi din diferite surse vegetale este primul pas important implicat în analiza lor calitativă și cantitativă [15]. Diferiți factori și anume. metoda de extracție, tipul și concentrația de solvent, temperatura, timpul și altele pot influența semnificativ compoziția și rata de extracție a acestor compuși [16]. Prin urmare, este necesară optimizarea proceselor de extracție pentru a obține un conținut ridicat de compuși activi din plante. Dezvoltată inițial în anii 1950 de Box și Wilson, metodologia de suprafață de răspuns (RSM) este în prezent instrumentul cel mai frecvent utilizat pentru a efectua, îmbunătăți și optimiza astfel de procese în care factorii independenți au un efect combinat asupra răspunsului dorit. Unul dintre modelele cel mai frecvent selectate în RSM de către cercetători este designul Box-Behnken (BBD), deoarece are nevoie de o încercare limitată și, prin urmare, reprezintă o alternativă care evită experimentele de lungă durată și reduce cheltuielile [17-19].

Până în prezent, în literatura de specialitate nu sunt disponibile studii privind optimizarea extracției compușilor bioactivi de E. fragilis. Prin urmare, acest studiu și-a propus să optimizeze extracția conținutului total de fenolici (TP) și flavonoizi (TF) din E.fragilis prin aplicarea unui BBD. Extractul de etanol brut (CEE) obţinut în condiţii optime de extracţie a fost fracţionat secvenţial cu solvenţi cu polaritate crescătoare, iar activităţile lor antioxidante şi antiglicatoare au fost investigate folosind diferite teste in vitro. În cele din urmă, am efectuat analize in silico pentru a înțelege în continuare mecanismele prin care compușii bioactivi din EAE, identificați prin cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă (RP-HPLC), se leagă la BSA și RAGE ca proteine ​​țintă.

2. Rezultate și discuții

2.1. Montarea modelelor

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{{0}}.05) pentru două răspunsuri indică adecvarea modelelor pentru predicția precisă a variației rezultatelor [20]. O precizie bună este descrisă ca un raport semnal-zgomot mai mare de 4, ceea ce este considerat de dorit [21]. Valorile preciziei adecvate sunt 29,4772 și 28,729 pentru conținutul TP și respectiv TF, demonstrând un semnal adecvat. Simultan, valorile mai mici ale coeficientului de variație (CV procente) (1,52 și 0,4246 procente pentru conținutul de TP și respectiv TF) indică o mai bună precizie și fiabilitate a valorilor experimentale. Pentru fiecare factor de răspuns, influența factorilor de extracție XI (concentrația de etanol), X2 (temperatura de extracție) și X3 (timpul de extracție) au fost examinate cu atenție (Tabelul 2). Semnificația fiecărui coeficient a fost testată folosind valorile F și p, având în vedere că o valoare F mai mare și o valoare p mai mică au condus întotdeauna la o corespondență mai semnificativă între diverse variabile independente [22]. Colectiv, aceste rezultate au indicat că modelele erau reproductibile și potrivite pentru optimizare.

2.2. Efectele variabilelor de extracție asupra conținutului TP

După cum este prezentat în Tabelul 2, rezultatele ANOVA au arătat efecte semnificative liniare (X și X2), pătratice (Xj, X5 și X) și interactive (X1X și X2X3) asupra conținutului de TP. Printre acestea, conținutul TP depinde în principal de X, X3 la p<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

Valoarea lipsei de potrivire a fost nesemnificativă (valoarea F =11.02, valoarea p{=0.0843), indicând faptul că modelul este bine întocmit cu predicție bună (R{ {9}}.9935; Adj R2=0.9818)(Tabelul 2).

Interacțiunile dintre concentrația de etanol și temperatura de extracție (XjX2) produc o valoare foarte semnificativă (p<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Aceste efecte s-ar putea datora faptului că compușii fenolici sunt molecule polare care apar în mod natural cu glucozidele, ceea ce îi face mai solubili în apă [23]. Deoarece extracția compușilor fenolici este puternic dependentă de polaritatea solventului, un amestec apă-alcool este mai eficient în extracția sa decât alcoolul singur [20]. În ceea ce privește principiul „like-disolves-like”, o scădere a concentrației de etanol duce la o creștere a polarității solventului, care ajută la dizolvarea TP[15]. Cu toate acestea, o concentrație mare de etanol poate influența viteza de extracție prin prevenirea dizolvării compușilor fenolici. De asemenea, o creștere a temperaturii de extracție a îmbunătățit recuperarea compușilor fenolici țintă prin înmuierea țesuturilor, a slăbit integritatea peretelui celular, a îmbunătățit transferul de masă și pătrunderea solventului în matricea plantei și a crescut atât solubilitatea, cât și viteza de difuzie; totuși, temperaturile prea ridicate pentru un timp prelungit de extracție pot crește șansele de degradare a acestora [23]. Mai mult, s-a descoperit că o perioadă lungă de extracție poate extinde expunerea la oxigen și la lumină, ceea ce în cele din urmă crește riscul formării de radicali liberi care pot fi eliminați de compușii fenolici [23]. Prin urmare, un timp de extracție prelungit nu a fost util pentru a maximiza randamentul extracției [24].

2.3.Efectele variabilelor de extracție asupra conținutului TF

După cum este evident din Tabelul 2, efectele liniare ale X și X3; efectele pătratice ale lui X și X; iar efectul de interacțiune al X1X2 și XjXg a demonstrat efecte semnificative asupra conținutului de TF. Dintre toți factorii semnificativi, TF depinde în principal de X3,X,X,X și X1X2 la p<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

Valoarea nesemnificativă a lipsei de potrivire (valoarea F=1.13; valoarea p{=0.5024) a sugerat că modelul propus s-a potrivit cu influența spațială a variabilelor la răspuns cu predicție (R2=0.9939; Adj R{2= 0.9830) (Tabelul 2).

Au fost generate diferite grafice de suprafață de răspuns 3D pentru conținutul TF și prezentate în Figura 1D-F. Efectul de interacțiune al concentrației de etanol și al temperaturii de extracție (X1X2) a arătat o influență semnificativă (p<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

În mod similar, interacțiunea dintre concentrația de etanol și timpul de extracție (XIX3) a arătat o corelație similară (Figura 1F). Randamentul extracției de TF a crescut treptat odată cu creșterea atât a concentrației de etanol (Xj) cât și a timpului de extracție (X3). Aproape de punctul de mijloc al diagramei de răspuns (61,89 la sută și, respectiv, 15,81 h pentru X și X3), randamentul TF a atins cel mai mare nivel, dar a scăzut lent după aceea. Acest fenomen se datorează cel mai probabil celei de-a doua legi a principiului difuziei a lui Fick, care dezvăluie că echilibrul final între concentrația soluției din matricea solidă și solvent va fi atins după o anumită durată, ceea ce duce la o decelerare a randamentului de extracție a compușilor țintă [26] .

2.4. Validarea condițiilor optimizate

Scopul optimizării a fost de a determina condițiile de extracție care să ofere simultan cele mai mari conținuturi de TP și TF. Pentru a realiza optimizarea a fost folosit software expert în proiectare. BBD a propus ca concentrația optimă de etanol, temperatura de extracție și timpul să fie de 61,93%, 44,43 grade și, respectiv, 15,84 ore, pentru extracția compușilor bioactivi de E. fragilis. În acest punct optim, conținutul estimat de TP și TF a fost de 15,335 mg GAE/g dw și, respectiv, 2,972 mg OE/g dw (Tabelul 3). Validarea capacității predictive a modelelor a fost efectuată experimental în condițiile optime obținute din RSM. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare în condițiile obținute, iar conținutul mediu de TP și TF a fost de 14,98±0.29GAE/g DW și, respectiv, 2,92±0.09 QE/g dw. Valorile experimentale ale răspunsurilor investigate au fost comparabile și în concordanță cu cele ale valorilor prezise, ​​ceea ce a confirmat că modelele au fost suficiente pentru a reflecta optimizarea așteptată.

2.5. Randamentul extracției și analiza fitochimică

Tabelul 4 a arătat randamentul de extracție a E.fragilis CEE și fracțiile sale. Rezultatele noastre au arătat că randamentul de extracție în diferite fracții diferă semnificativ de la 0,78 la 10,6 procente (g/w). După cum se arată în tabelul 4, CEE(1{{14} },6 la sută ) a avut cel mai mare randament procentual, urmat de WF (2,73 la sută ), WBF (2,04 la sută ), DMF (0,64 la sută ) și EAF (0,93 la sută ), în timp ce HF (0,78 la sută ), ) a avut cel mai mic randament procentual.

Conținutul de TP al E. fragilis CEE și al fracțiilor sale a fost determinat printr-o ecuație de regresie a curbei de calibrare (y {{0}}.009x-0.{{ 25}}154; R2=0.9973) și exprimat în miligrame de echivalenți de acid galic (GAE) per gram de greutate uscată (Tabelul 4). În general, EAF a avut cel mai mare conținut de TP (32,78±0,49 mg GAE/g DW) urmat succesiv de WBF, DMF și CEE (25,02±1,01,19,21±0,22 și 14,98±0,29 mg GAE/g DW), în timp ce, WF și HF au prezentat cele mai scăzute conținuturi (10,47±0,71 și, respectiv, 8,14±0,17 mg GAE/g DW). Conținutul de TF al E. fragilis CEE și fracțiile sale a fost evaluat prin test colorimetric cu clorură de aluminiu folosindquercetinăas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. În mod interesant, conținutul de TP și TF din EAF a fost de 2,18 și 3,{3}}ori mai mare decât cel al CEE, ceea ce sugerează că acetatul de etil poate fi solventul potrivit pentru a concentra mai mulți compuși fenolici și flavonoizi disponibili în timpul fracționării CEE. Datele noastre referitoare la conținutul TP și TF sunt în concordanță cu cele ale lui Yao și colab. [27] care raportează că EAF obținut din planta medicinală Pyrola asarifolia a avut cele mai ridicate niveluri de fenolici și flavonoide în comparație cu celelalte fracții (eter de petrol, n-butanol și apă). În studiul lor, Bhardwaj și colab. [28], de asemenea, a raportat rezultate similare atunci când s-au folosit mai mulți solvenți cu polaritate crescândă (n-hexan, cloroform, acetat de etil și n-butanol) în scindarea unei plante medicinale Codonopsis clematidea. Potrivit acestor autori, EAF are cel mai mare conținut de TP și TF, urmat la distanță de cele n-butanol, cloroform și hexan. Această variație semnificativă a randamentelor de extracție, compoziție și puritate a compușilor fenolici între fracții se datorează probabil diferențelor de polaritate a constituenților găsiți în materialele vegetale, structurii lor chimice, gradului lor de polimerizare și interacțiunii lor între ele [29]. ].

2.6. Activitate antioxidantă in vitro

2.6.1.DPPH"Activitate de captare

DPPH" este unul dintre puținii radicali liberi stabili care sunt utilizați pe scară largă pentru a investiga potențialul antioxidant al extractelor de plante [30]. Potențialul de captator al unui extract este frecvent asociat cu capacitatea sa de a elimina radicalii liberi stabili, care se datorează capacității sale de a dona hidrogen. .

A fost studiată capacitatea de captare a CEE/fracțiilor precum și a VC la diferite doze asupra radicalilor liberi DPPH*. Figura 2A arată că toate fracțiile au prezentat activitate evidentă de captare a DPPH-ului într-un mod dependent de doză, în intervalul de 0,1 până la 1 mg/mL. La o doză de 1 mg/mL, 64,32, 44,1{{22} },67,24,86,63,80,95,51,37 și 99,62% din radicalul DPPH" au fost stinși de CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF și, respectiv, VC. Cel mai scăzut IC50 pentru eliminarea DPPH" dintre toate fracțiile a fost afișat de EAF (0,116±{{3{0}}.015 mg/mL )procedat de WBF (0.175 ± 0.{03 mg/mL), CEE ({0.23 ± 0,065 mg/mL) și DMF (0,297 ±0,044 mg/mL).WF și HF au arătat valori IC50 comparativ mai mari (0,964±0,178 și respectiv 1,245±0,105 mg/mL).

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

Valoarea IC50 pentru captarea radicalilor DPPH a fost corelată semnificativ pozitiv atât cu conținutul de TP (r=0.963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· plus Activitate de eliminare

Testul de eliminare ABTS este utilizat pe scară largă ca indice pentru a informa și a investiga capacitatea antioxidantă a compușilor puri, precum și a extractelor naturale [32,33]. Decolorarea culorii albastru/verde a cromoforului ABTS* la 734 în prezența extractului de plantă poate indica o activitate antioxidantă.

După cum se arată în Figura 2B, curba de eliminare a CEE/fracțiilor pe ABTS* plus a prezentat o tendință ascendentă pe măsură ce concentrația a crescut. La 1 mg/mL, ratele de eliminare a CEE, HF, DMF, WBF, EAF, WF și VC au fost 80.31,40.54,88.76, 9{{2{ {22}}}}.11, 82,97, 67,36 și, respectiv, 94,90 procente. Dintre toate fracțiile, valoarea minimă a IC0 a fost indicată de EAF(0,11{{3{0}}±0.014 mg/ mL)procesat de DMF(0.196±0.{023 mg/mL),WBF ({0.277±0,031 mg/mL), CEE(0,429 ± 0,039 mg/mL) și WF (0,654± 0,043 mg/mL), în timp ce HF a afișat cea mai mare valoare ICs0 (1,314± 0,104 mg/mL). În mod colectiv, această constatare a fost în acord cu cea a lui Kaewseejan și Siriamornpun [29]. Comparația cu capacitatea de inhibiție a VC (0,025±0,005 mg/mL) a arătat că activitatea de captare a CEE și a fracțiilor sale a fost ușor slabă.

După cum este prezentat în Tabelul 5, o corelație foarte semnificativă a eliminării radicalilor ABTS cu conținutul de TP (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. Activitate de captare a H2O2

Fiind un contributor principal la stresul oxidativ, H2O2 difuzează ușor prin celule prin membrană ca moleculă mesager [34]. Luat împreună, H2O2 în sine nu este periculos [35], dar poate reacționa cu Fe2 prin reacția Fenton și dă naștere la radicalul hidroxil foarte reactiv (OH*)[36]. Astfel, este cel mai dăunător dintre ROS pentru biomolecule. Prin urmare, este necesar să se evalueze capacitatea CCE și diferitele sale fracțiuni de a elimina H2O2.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF și abilitățile de curățare corespunzătoare la 1,0 mg/mL au fost 84,56, 75,24, 67,17, 56,18, 50,19 și, respectiv, 34,95 la sută, care au fost mult mai mici decât cele ale VC (98,03 la sută).

Dintre toate fracțiile, EAF a arătat cea mai scăzută valoare IC50 (ICs{0= 0.{098±0,013 mg/mL) și a fost semnificativ mai mare decât cea a VC (0,024±0,006 mg/mL). Acest lucru se poate datora prezenței compușilor fenolici și flavonoizi înalți în EAF, despre care se știe că joacă un rol crucial ca antioxidanți în sistemele biologice. În studiul nostru recent, am demonstrat capacitatea EAF de la E.fragilis de a proteja Tetrahymena pyriformis împotriva daunelor oxidative induse de H2O2-[37].

Analiza noastră a datelor a arătat că, în ceea ce privește rezultatele DPPH" și ABTS* plus, a fost observată o corelație puternică pozitivă a valorii IC0 pentru eliminarea H2O2 cu atât conținutul de TP (r=0,926; p.<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Reducerea puterii

Puterea reducătoare a unui extract acționează ca un indicator al activității sale antioxidante potențiale [39, A40]. Potențialul antioxidant este estimat prin capacitatea antioxidanților de a reduce fierul (Fe3) din clorura ferică la feros (Fe2 plus ). În general, proprietățile reducătoare sunt atribuite prezenței în extractele de plante a reductonelor, care sunt recunoscute că își exercită acțiunea prin ruperea lanțului de radicali liberi prin donarea unui atom de hidrogen [41].

Figura 2D prezintă curba doză-răspuns pentru puterea de reducere a extractelor de E. fragilis. Se știe că cu cât absorbanța este mai mare la 700 nm, cu atât este mai mare capacitatea de reducere. În studiul actual, CEE și cele cinci fracții ale sale au prezentat o putere de reducere considerabilă într-o manieră dependentă de concentrație.

EAF a prezentat activitate antioxidantă maximă (EC{{0}}.136± 0.{{{10}}13 mg/mL) în comparație cu VC(EC{{{4} }}.083± 0.{005 mg/mL). Aceasta a fost urmată îndeaproape de WBF (EC{50=0.180 ± 0,028 mg/mL), DMF (EC50=0,319 ± 0,031 mg/mL), CEE (EC{50=0,334±0,029mg/mL) și WF (EC{{50=0.398±0,064 mg/mL) .HF a rămas în urmă, arătând o activitate minimă de reducere a puterii (EC5s0 =0,626±0,068 mg/mL) în comparație cu alte fracții. Aceste constatări sugerează că EAF poate conține diferiți compuși individuali care au o activitate eficientă și puternică de reducere a puterii. Oamenii de știință au descoperit că extractele de acetat de etil ar putea servi ca antioxidanți puternici [42].

S-a observat o corelație pozitivă între puterea de reducere și conținutul de TP și TF (r=0,975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Analiza fosfomolibdenului

TAC al CEE și fracțiile sale, precum și VC au fost evaluate utilizând testul fosfo-molibdenului și exprimate ca EC0, care este concentrația care furnizează 0,5 de absorbanță. Metoda sa bazat pe reducerea Mo(VI) la Mo(V) prin extracte pentru a forma un complex verde fosfat/Mo (V) la pH acid cu absorbție maximă la 695 nm [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF (pag<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

S-a observat o corelație foarte semnificativă între activitatea antioxidantă totală și conținutul de TP și conținutul de TF (r=0,978 pentru ambele;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. -Caroten-Linoleat Model System

În modelul -caroten-acid linoleic, moleculele foarte nesaturate de -caroten suferă o decolorare rapidă din cauza radicalilor liberi linoleați generați de oxidarea acidului linoleic [44]. Suplimentarea cu antioxidanți ar putea minimiza oxidarea -carotenului prin neutralizarea radicalilor liberi linoleați și astfel inhibând albirea -carotenului [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF a afișat valoarea minimă IC50 (IC{50=0.127 ± 0.{{1{0}}42 mg/mL) în comparație cu BHT (IC{{ {5}}.049 ± 0.001 mg/mL). WBF. CCE. DME. NOI. iar HF a afișat valori IC0 comparativ mai mari de 0,5±0,111 mg/mL, 0,998 ± 0,101 mg/mL, 1,073±0,084 mg/mL, 1,402±0,058 mg/mL și 2,209±0,081 mg/mL, respectiv.

O corelație semnificativă într-o manieră pozitivă a fost observată între eliminarea oxidării carotenului și atât conținutul de TP (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC și -caroten. Prin urmare, am arătat că activitățile antioxidante puternice ale CEE și ale fracțiilor sale au prezentat activități de captare mai mari, iar acest lucru se poate datora în mare măsură compoziției lor din acid fenolic și flavonoide, cum ar fi acidul galic, rutina și quercetina.