Partea 1: Sortilină carbamilata asociată cu calcificarea cardiovasculară la pacienții cu boală cronică de rinichi

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Partea 1: Sortilină carbamilata asociată cu calcificarea cardiovasculară la pacienții cu boală renală cronică

Cuvinte cheie: boală cronică de rinichi, cardiovasculare, rinichi

Declarație translativă

Pacienții cuboală cronică de rinichisunt foarte susceptibile la dezvoltarecardiovascularboala.Boala cronică de rinichi-specificcardiovascularfactorii de risc sunt până acum în principal necunoscuți. Demonstrăm că sortilina circulantă este modificată post-translațional prin carbamilare la pacienții cu reducererinichifuncţie. Carbamilarea sortilinei duce la o afinitate mai mare de legare la interleukină-6 și promovează calcificarea arterială ex vivo. Mai mult, sortilina carbamilată este un factor de risc pentru prezența și progresia calcificării arterei coronare. Rezultatele noastre indică sortilina carbamilată ca o potențială țintă terapeutică pentru împiedicarecardiovascularcalcificarea la pacientii cuboală cronică de rinichi.

Introducere

Sortilin, un receptor de sortare intracelular, a fost identificat ca acardiovascularfactor de risc în populația generală. Pacienții cucronicrinichiboalasunt foarte susceptibile la dezvoltarea complicațiilor cardiovasculare, cum ar fi calcificarea. Cu toate acestea, specificcronicrinichiboala-modificări ale proteinelor posttranslaționale induse ale sortilinei și legătura lor cucardiovascularcalcificarea rămân necunoscute. Pentru a investiga acest lucru, am examinat două independentecronicrinichiboalacohorte pentru carbamilarea sortilinei circulante și au detectat reziduuri de lizină de sortilină carbamilate crescute în domeniul extracelular al sortilinei curinichideclinul funcției utilizând spectrometria de masă țintită. Analiza structurii a prezis legarea alterată a ligandului de către sortilina carbamilată, care a fost verificată prin studii de legare folosind măsurarea rezonanței plasmonilor de suprafață, arătând o afinitate crescută a interleukinei 6 față de sortilina carbamilată in vitro. În plus, sortilina carbamilată a crescut calcificarea vasculară in vitro și ex vivo, care a fost accelerată de interleukina 6. Imagistica prin spectrometrie de masă a arterelor calcificate umane a evidențiat sortilină carbamilată in situ. La pacientii cucronicrinichiboala, carbamilarea sortilinei a fost asociată cu calcificarea arterei coronare, independent de vârstă șirinichifuncţie. Mai mult, pacienții cu sortilină carbamilată au prezentat o progresie semnificativ mai rapidă a calcificării arterei coronare decât pacienții fără carbamilare a sortilinei. Astfel, sortilina carbamilată poate fi un factor de risc pentrucardiovascularcalcificarea și poate contribui la creștereacardiovascularcomplicatii la pacientii cucronicrinichiboala.

Cistanchepoate evitacronicrinichiboala.

Aproximativ 1 din 10 persoane din întreaga lume are experiențăcronicrinichiboala.1 Deterioratrinichifuncţia este un factor de risc major independent pentrucardiovascularmorbiditatea şi mortalitatea şi mortalitatea de orice cauză.1,2 De fapt, pacienţii cucronicrinichiboalasunt mult mai probabil să moară din cauzacardiovascularevenimentelor decât să dezvolte boală Q14 renală în stadiu terminal care necesită dializă.3 Depunerea în exces de minerale calcifice în țesutul vascular observatăcronicrinichiboalapacienții contribuie în principal la creștereacardiovascularrisc.4cronicrinichiboalafacilitează modificarea post-translațională (PTM) a proteinelor.5 PTM-urile, la rândul lor, au fost legate decardiovascularcalcificarea6, sugerând că o mai bună înțelegere a PTM-urilor încronicrinichiboala-procesele de calcificare induse ar putea dezvălui noi ținte terapeutice. Cu toate acestea, până acum specificcronicrinichiboala-modificări proteice asociate legate decardiovascularcalcificarea este necunoscută.

Sortilin este un membru exprimat omniprezent al familiei de proteine ​​de sortare a 10 proteinelor vacuolare a receptorilor de sortare intracelular.7 Este o proteină transmembranară de tip I cu o singură trecere, cu diferite roluri în sortarea proteinelor, traficul și semnalizarea celulară. Ca receptor de endocitoză, sortilina poate declanșa internalizarea liganzilor de pe suprafața celulei prin endocitoză și poate sorta liganzii între compartimentele intracelulare, cum ar fi rețeaua trans-Golgi, endozomul, lizozomul și calea secretorie.8 Dovezile preclinice in vivo sugerează un rol important al sortilina în patogeneza tulburărilor vasculare și metabolice prin contribuții la inflamația și calcificarea peretelui arterial, metabolismul dereglat al lipoproteinelor și diabetul zaharat de tip 2, toatecardiovascularrisk factors.7 In human vascular smooth muscle cells (hSMCs), intracellular sortilin regulates the loading of the procalcific protein tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) into extracellular vesicles, thereby conferring the calcification potential that contributes to microcalcification formation.9 The ectodomain of plasma membrane-bound sortilin can be shed and secreted into the circulation.7 In a community-dwelling cohort of men aged >50 de ani, am raportat o asociere a nivelurilor ridicate de sortiline serice cu calcificarea aortică șicardiovascularevenimente, sugerând sortilin ca acardiovascularfactor de risc în populaţia generală.10 Un rol al sortilinei încronicrinichiboala, o populație de pacienți cu o creștere marcată acardiovascularcalcificare, continuă să sfideze elucidarea. Cele mai multe studii s-au concentrat mai degrabă pe funcția sortilinei celulare decât pe explorarea funcției biologice a formei solubile circulante.7 Prin urmare, obținerea unei mai bune înțelegeri a relației mecaniciste dintre sortilina circulantă și impactul reglator al PTM încronicrinichiboalava lărgi cunoștințele despre sortilină încardiovascularcalcifiere.

Acest studiu interoghează ipoteza conform căreia PTM-ul sortilinei circulante este implicat în dezvoltareacardiovascularcalcificarea la pacientii cucronicrinichiboala.

beneficiul Cistanche: tratarea bolilor de rinichi

METODE

Cardiovascularși Rezultatul renal încronicrinichiboala2–4 Pacienți – Cohorta de evaluare Homburg a patra (CARE FOR Home).

Studiul CARE FOR Home a fost descris anterior în detaliu.11 Pentru analiză a fost utilizat un subgrup de 97 de pacienți.

Dan-NICAD 1 cohorta

The study design of the Danish study of noninvasive testing in coronary artery disease (Dan-NICAD 1) trial has been described previously.12 For the analysis, we identified a subset of 97 enrolled patients with estimated glomerular filtration rate (eGFR) >60 ml/min și potrivirea frecvenței efectuate în funcție de vârstă, sex, indice de masă corporală, starea de fumat, diabet zaharat șicardiovascularboala. Identificarea a fost efectuată în orb pentru nivelurile de sortilină.CardiovascularCohorta de evaluare aprofundată (CARVIDA) CARVIDA este un substudiu al GermanieiCronicRinichiBoalaStudiul.13 Au fost utilizate numai eșantioane de pacienți CARVIDA incluși în studiul din Aachen, Germania (n=78). Imagistica tomografică computerizată a fost efectuată pe un scaner CT cu sursă dublă (SOMATOM Definition Flash sau Force; Siemens), așa cum s-a descris anterior.14 Cu un timp mediu de urmărire de 4,4 ani, 41 din 78 de pacienți au fost de acord sau au fost disponibili pentru o a doua tomografie computerizată. scanați în timpul celei de-a doua vizite CARVIDA în 2019/ Q15 2020.

analize statistice

Datele studiului experimental sunt prezentate ca SD medie; n indică numărul de experimente independente sau numărul de pacienți. Normalitatea a fost testată folosind testul Shapiro-Wilk, iar diagrama cuantile și heterogenitatea varianței au fost testate folosind testul Brown-Forsythe. A fost efectuat un test t Student cu coadă 2-pereche sau nepereche cu varianțe egale sau inegale pentru a compara 2 grupuri. Pentru comparație între 3 grupuri de tratament, s-a efectuat analiza 1- sau 2-modal a varianței, urmată de Tukey post-hoc, pentru date cu distribuție normală și varianță egală. Datele cu distribuție neregulată au fost evaluate prin testul Kruskal-Wallis urmat de testul post-hoc Dunn. Datele cu varianțe inegale au fost testate prin analiza varianței Welch, urmată de testul post-hoc Dunnett T3.

În studiile clinice, datele continue sunt prezentate ca SD medie atunci când sunt distribuite în mod normal sau ca interval median și intercuartil pentru variabilele cu distribuție anormală. Datele categorice sunt prezentate sub formă de procente. Testul c2 Pearson/Fisher a fost folosit pentru a studia asocierea dintre variabilele categorice și testul t Student nepereche sau testul U Mann-Whitney pentru variabile continue. Diferențele dintre cele 3 grupuri au fost comparate folosind o analiză 1-modal a varianței, urmată de testul post-hoc Sidak. Cel mai mic pătrat înseamnă că un număr ajustat multivariat de reziduuri de sortilină carbamilată a fost calculat folosind modele liniare generalizate, așa cum s-a descris anterior.

Volumul de calcificare a arterei coronare (CAC) a fost transformat în log (adică, logaritmul natural, ln; ln[CAC plus 1]) pentru a reduce asimetria. Corelația bivariată a fost evaluată folosind Eta (1 variabilă nominală și 1 variabilă metrică) sau coeficienții de corelație Pearson (dacă ambele variabile au fost metrice). Modificarea volumului CAC pe an a fost calculată după cum urmează: [(Urmărirea CAC – Linia de bază CAC) / timpul de urmărire în luni] * 12. Analiza variației cu modificarea volumului CAC ca variabilă dependentă și termen cu efect fix pentru carbamilare (da vs. nu) a fost utilizat pentru analiza progresiei CAC. În plus, acest model a fost ajustat prin utilizarea analizei covarianței pentru covariabilele CAC la momentul inițial Q18 și pentru variabile. P < 0.05="" a="" fost="" considerat="" semnificativ="" statistic.="" analizele="" statistice="" au="" fost="" efectuate="" folosind="" graphpad="" prism="" (prism="" software="" inc.,="" versiunea="" 9)="" sau="" spss="" (versiunea="">

Cistanchese poate îmbunătățirinichifuncţii şicronicrinichiboala.

REZULTATE

Sortilina carbamilata creste curinichideclinul funcției

Inițial, am evaluat nivelurile serice de sortilină la pacienții cucronicrinichiboaladin studiul CARE FOR HOME11 și a constatat niveluri crescute de sortilină în comparație cu un grup de control potrivit cu valori normale.rinichifuncția din studiul Dan-NICAD 1 (Tabelul 1). Proteinele circulante sunt predispuse la PTM la pacientii cucronicrinichiboalaQ20 .5 Prin urmare, am efectuat o mapare detaliată a reziduurilor PTM ale sortilinei circulante la participanții la studiul CARE FOR Home și subiecții de control sănătoși (Tabel suplimentar S1) folosind MALDI-TOF/TOF MS. Comparativ cu subiectii de control,cronicrinichiboalapacienții aveau 8 dintre cele 30 de reziduuri de lizină care au fost predominant carbamilate în domeniul extracelular al sortilinei (Tabelul suplimentar S3 Q21 și Figura suplimentară S1). Spectre MS reprezentative de la un subiect de control și un pacient cucronicrinichiboalasunt ilustrate în figurile 1a și b. Specificitatea semnalului a fost susținută de spectrele MALDI-TOF/TOF-MS/MS (Figura suplimentară S2A). Cuantificarea a relevat acronicrinichiboalacreșterea în funcție de stadiu a numărului de reziduuri carbamilate (Figura 1c) și a intensității peptidelor de sortilină carbamilate (Figura 1d). Reziduul de lizină 205 a fost modificat în mod egal în totalitatecronicrinichiboalaetape, în timp ce reziduurile 95, 260 și 294 au fost mai des modificate în stadiu avansat.cronicrinichiboalaetape (Figura 1e).

Apoi, am evaluat asocierile dintre carbamilarea sortilinei și caracteristicile inițiale (Tabelul suplimentar S2) în studiul CARE FOR Home. Am observat o creștere dependentă de vârstă a reziduurilor de carbamilare a sortilinei (Tabelul 2). Funcția renală mai scăzută, bazată pe eGFR pe baza cistatinei c și creatininei serice (eGFRcys-area), și niveluri mai ridicate de uree și peptide natriuretice N-terminale pro-creier (NT-proBNP) au fost asociate cu reziduuri de sortilină carbamilate mai mari (Tabelul 2). Asociațiile au rămas semnificative după ajustarea pentru vârstă și sex (Tabelul 2).cronicrinichiboalapacienții tratați cu antagonist de aldosteron Q22 au prezentat o carbamilare redusă a sortilinei (Tabelul 2), în timp ce nu a existat nicio diferență în zona eGFRcys (nu, 50.{6 23,2 ml/min la 1,73 m2; da, 43.{{10}},9 ml/min per 1,73 m2; P=0,236) și uree (nu, 68.{6 40},1 mg/dl; da, 72.{{21} }},9 mg/dl; P=0,729) între pacienți cu sau fără antagoniști aldosteronului. Pe lângă uree, mieloperoxidaza poate media carbamilarea proteinelor încardiovascularboala.19 Cu toate acestea, nu am găsit nicio asociere între nivelurile totale și activitatea mieloperoxidazei și carbamilării sortilinei (Figurile suplimentare S3A și B).

tratamentul bolilor de rinichi:Cistanche

În plus, am evaluat prezența sortilinei carbamilate în arterele femurale umane folosind imagistica MS. Peptida carbamilata SEDYGK*NFK* (m/z 1172) a fost foarte prezentă în arterele femurale calcificate dincronicrinichiboalapacienți și absenți în arterele femurale necalcificate (Figura 1f). Spectrele MS/MS au susținut identificarea SEDYGK*NFK* (Figura suplimentară S2B). SEDYGK*NFK* este situat aproape de zonele calcificate din mediul tunicii (Figura 1g). În schimb, intensitatea semnalului de masă a peptidei SEDYGKNFK modificate non-post-translațional (m/z 1086) a fost mai mare în arterele de control (Figura 1f).

Luate împreună, în comparație cu controalele cu normalrinichifunctia, pacientii cucronicrinichiboalaau niveluri serice de sortilină mai ridicate și prezintă sortilină carbamilată post-translațională în circulație, care poate fi detectată și în sistemul vascular.

Sortilina carbamilată promovează calcificarea celulelor musculare netede Având în vedere descoperirea noastră că sortilina carbamilată este localizată în zonele calcificate, am evaluat apoi efectul carbamilării sortilinei asupra calcificării vasculare in vitro și ex vivo. Pentru a determina relevanța funcțională a carbamilării sortilinei, am indus carbamilarea in vitro a sortilinei recombinate (SortCarb) cu uree și am detectat un model de reziduuri de carbamil-lizină similar cu cel detectat la oameni in vivo (Figura suplimentară S4A și Tabelul suplimentar S4). In vitro, carbamilarea nu a modificat integritatea proteinei SortCarb în comparație cu modificarea simulată de control (SortCo), așa cum a fost evaluată prin electroforeză pe gel și Western blot (Figura suplimentară S4B și C). Nici SortCo, nici SortCarb nu au prezentat efecte citotoxice asupra hSMC-urilor (Figura suplimentară S5A). SortCo și SortCarb au fost preluate în mod egal de hSMC-uri (Figura suplimentară S5B). În calcificarea hSMC-urilor, SortCarb a indus transcriptele proosteogene ALPL (+56 la sută; P=0.039) și RUNX2 Q23 (+25 la sută; P=0.014; Figura 2a și b; ), precum și activitatea fosfatazei alcaline nespecifice tisulare (+46 la sută; P=0,007; Figura 2c), în comparație cu SortCo. La nivel funcțional, SortCarb a crescut semnificativ calcificarea matricei (Figura 2d și e). În cele din urmă, într-un model de cultură de organe ex vivo, SortCarb a crescut calcificarea în inelele aortice de șobolan (Figura 2f și g).

beneficiul Cistanche: tratarea bolilor de rinichi

Pentru a continua, faceți clicAicipentru partea 2.