Partea 1: Cistanozidul Cistanche Herba ameliorează daunele reproductive masculine induse de hipoxie prin suprimarea stresului oxidativ
Mar 26, 2022
A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Abstract:Dovezile tot mai mari arată că hipoxia este o cauză a infertilității masculine, iar hipoxia poate fi legată de stresul oxidativ (OS). Cistanoside (Cis) este un compus glicozidic feniletanoid care poate fi extras din CistanchesHerba și posedă diferite funcții biologice. Acest studiu și-a propus să investigheze efectele protectoare ale Cis asupra daunelor reproductive induse de hipoxie și să exploreze mecanismele specifice subiacente. Au fost construite modele experimentale de hipoxie celulară și animală, iar efectele protectoare ale diferitelor subtipuri de Cis asupra sistemului reproducător masculin au fost evaluate atât in vitro, cât și in vivo. Rezultatele au indicat că hipoxia a redus semnificativ viabilitatea celulelor GC-1 prin oprirea ciclului celular și activarea apoptozei, care au fost asociate cu creșterea OS. Mai mult, Cis a arătat efecte antioxidante puternice atât in vitro, cât și in vivo, restabilind semnificativ activitățile enzimelor antioxidante. și scăderea nivelurilor speciilor reactive de oxigen (ROS) în timp ce crește viabilitatea celulară și scade apoptoza. Important, subtipurile Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C și Cis-H) studiate aici au arătat toate anumite efecte antioxidante, dintre care efectele Cis-B au fost cele mai semnificative. Acest studiu demonstrează că Cis atenuează semnificativ efectele nocive ale OS indus de hipoxie prin afectarea activităților enzimelor antioxidante în testicule și celulele GC-1.
Cuvinte cheie: Cistanozidă, hipoxie hipobară, infertilitate masculină, stres oxidativ, protecție a reproducerii
planta proaspata de cistanche
Introducere
În prezent, aproximativ 48,5 milioane (15 la sută) de cupluri de vârstă reproductivă din întreaga lume sunt afectate de infertilitate [1], dintre care 40-50 procente din cazuri sunt atribuite infertilității masculine [2], o afecțiune care este puternic asociată cu mediul și stilul de viață. factori. Dovezile sugerează că susceptibilitatea mamiantetistului la presiunea scăzută a oxigenului este un factor cauzator al unor forme de infertilitate masculină [3]. După cum sa demonstrat în studiile anterioare, spermatogeneza este afectată și redusă la expunerea la hipoxie hipobară [4-7].
Pentru a explora mecanismul de bază, studiile au arătat că expunerea la hipoxie hipobară crește producția de specii reactive de oxigen (ROS) [8, 9]. ROS joacă un rol important în sistemul reproducător masculin. La niveluri scăzute, acestea sunt necesare pentru capacitarea spermatozoizilor, reacția acrozomală și fuziunea spermatozoid-ovocit[10]. Cu toate acestea, ROS excesiv poate induce leziuni ale ADN-ului spermatozoid/mitocondrial și leziuni peroxidative ale membranei plasmatice, care, la rândul lor, sunt factori etiologici majori pentru riscul crescut de infertilitate masculină [11, 12]. Astfel, acumularea de ROS indusă de hipoxie ar putea fi una dintre cauzele infertilității masculine.
Cistanches Herba, o plantă medicinală parazită perenă, este larg răspândită în zonele aride [13]și utilizată pe scară largă datorită activităților sale farmacologice [14-17]. Printre toate conținuturile eficiente ale Cistanches Herba, PhG-urile au fost considerate ca principala componentă activă. Până în prezent, 34 de PhG au fost izolate din plantele Cistanches [13]. Cistanoside (Cis), PhG anactiv izolat din Cistanches Herba, a primit atenție pentru efectele sale antioxidante.
Având în vedere efectele antioxidante ale Cis și rolul ROS în infertilitatea masculină indusă de hipoxie, Cis este considerat un potențial candidat medicament pentru tratamentul infertilității masculine induse de hipoxie. Cu toate acestea, puține rapoarte au abordat efectele antioxidante ale Cis extras din Cistanches Herba în tratamentul infertilității masculine induse de hipoxie sau a căilor de semnalizare implicate. În acest studiu, au fost construite modele experimentale de hipoxie in vitro și in vivo și au fost evaluate componentele efectelor diferitelor Cis.
Cistanche are oefect de producție reproductivă.
Materiale și metode
Cultură celulară și reactiv
Linia celulară de spermatogonie de șoarece GC-1spg(GC{-1) a fost achiziționată de la American TypeCulture Collection (ATCC) și cultivată în DMEM (Invitrogen, SUA) suplimentat cu 10% ser fetalbovin, 1% L- glutamină (100 mM), penicilină (100 U/mL) și streptomicina (100 ug/mL) la 37 de grade într-un incubator umidificat cu 5% CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) a fost achiziționat de la Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China).
Test de viabilitate celulară
Viabilitatea celulară a fost testată prin testul kit{{0}}de numărare a celulelor (CCK-8). Pe scurt, celulele GC-1 au fost însămânțate în plăci de 96-godeuri la 1,5×103 per godeu și cultivate la 37 de grade timp de 24 de ore. Apoi, celulele au fost tratate cu diferite concentrații (20 la sută, 15 la sută, 10 la sută, 5 la sută) de oxigen sau diferite concentrații (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C). , Cis-H) pentru timpul necesar. Apoi, supernatantul a fost aruncat și viabilitatea celulelor a fost detectată folosind un kit CCK-8 (DojindoJapan). Absorbanța fiecărui godeu a fost măsurată la 450 nm folosind un cititor de microplăci (BioRad USA). În cele din urmă, viabilitățile celulare au fost calculate conform următoarei formule:
Viabilitatea celulară=(grup ODexperimental - grup ODblank)/(grup ODcontrol - grup ODblank) × 100 la sută .
Analiza Western blot
Celulele sau țesuturile recoltate au fost omogenizate în tampon RIPA pentru a extrage proteine (RIPA BeyotimeChina; Cocktail Roche Elveția). Supernatanții au fost colectați, iar concentrația de proteine a fost testată prin metoda BCA (Beyotime). Aproximativ 40 ug din proteinele extrase din fiecare probă au fost separate prin SDS-PAGE și electrotransferate pe membrană de filtru de nitroceluloză (NC) (BeyotimeChina). Membranele filtrului NC au fost blocate cu lapte degresat 5% timp de 1,5 ore și incubate cu anticorpi specifici (anti-PARP 1:1000, anti-Caspaze-3 1:1000, anti-Bcl{-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; toți anticorpii au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology, SUA) peste noapte la 4 grade. Apoi, toate membranele NC au fost incubate cu anticorpul secundar conjugat cu peroxidază de hrean timp de 1,5 ore la temperatura camerei și au fost fotografiate cu un sistem de imagistică (Tannon, China).
suplimente cu pudră de extract de cistanche
Detectarea ciclului celular
A fost efectuat un test de citometrie în flux (FCM) pentru a analiza ciclul celular. Celulele au fost tratate în diferite condiții timp de 72 de ore și recoltate. Celulele au fost apoi spălate cu PBS, fixate în etanol 75% și colorate cu iodură de propidiu (PI). Pentru fiecare probă, 1 x 104 celule au fost colectate și analizate prin citometrie în flux (FACSCalibur, BD Biosciences). Apoi, proporția celulelor de fază G1/S/G2 și indicele de proliferare [Fază (S plus G2)/Fază (G1 plus S plus G2) × 100 la sută] au fost calculate.
Colorare Ki-67
Celulele au fost cultivate într-un vas confocal și tratate cu hipoxie sau diferite subtipuri de Cis timp de 72 de ore. După fixarea tuturor celulelor cu 4% paraformaldehidă, acestea au fost incubate cu anticorpi anti-Ki-67 (1:200, Tehnologia de semnalizare celulară). Apoi, toate celulele au fost incubate cu un anticorp IgG anti-iepure conjugat CY-3-corespunzător (1:200, Boster, China) și soluție DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). Fluorescența a fost observată cu un microscop confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Japonia).
Detectarea ROS
FCM a fost introdus pentru a măsura nivelurile intracelulare de ROS folosind DCFH-DA. Celulele suspendate au fost însămânțate în 6-plăci de godeuri și supuse diferitelor tratamente. După 72 de ore de tratament, celulele au fost suspendate în DMEM fără ser cu 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Conținutul de ROS a fost apoi determinat prin sortarea celulelor activate de fluorescență pe un sistem de citometrie în flux Beckman Coulter cu o lungime de undă de excitație de 488 nm și lungime de undă de emisie de 525 nm [18].
Determinarea peroxidării lipidelor (LPO)
Testul substanțelor reactive la acid tiobarbituric (TBARS) a fost efectuat pentru a detecta LPO. Toate etapele operaționale au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile (Sigma USA). Concentrațiile au fost calculate utilizând un coeficient de extincție molar de 1,56 x 105/(M·cm), care a fost obținut utilizând malondialdehida ca standard. Rezultatele sunt exprimate ca nmol de echivalenți MDA/mg de proteină.
Determinarea activităților enzimatice
Activitățile enzimatice au fost testate folosind truse de testare, inclusiv glutation reductază (GR), glutation peroxidază (GPx) și superoxid dismutază (SOD). Toate etapele operaționale au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile furnizate (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China).
Animale și protocol experimental
Șobolanii Wistar masculi maturi (180-220 g, în vârstă de 8 ani) au fost obținuți de la centrul pentru animale al Universității de Medicină Militară a Patra, Xi'an, China. Permisiunea de utilizare a animalelor a fost obținută de la Comitetul de Etică al Universității (Numărul de referință : 20190506). Experimentul cu animale a fost realizat conform ghidurilor universitare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.
Toți șobolanii au fost lăsați să se adapteze timp de aproximativ o săptămână înainte de începerea experimentului. După aclimatizare, șobolanii au fost distribuiți aleatoriu în 6 grupuri cu 5 animale în fiecare grup. Șobolanii din grupul de control au fost crescuți la presiune normală (PO2: 20 la sută; presiunea aerului: 101,3 kPa), în timp ce șobolanii din grupurile model și tratate au fost crescuți într-o cameră de oxigen de joasă presiune (presiune internă de 61,6 kPa, echivalent cu o înălțime de 4000 de metri deasupra nivelului mării; PO2: 14,55 la sută) pentru a simula un mediu hipoxic la altitudine mare. Toți șobolanii au avut acces gratuit la hrană și apă în cuști de plastic la 22± 2 grade și condiții de umiditate cu un ciclu automat de 12-h lumină/întuneric. Șobolanii din modelul și grupurile tratate cu Cis au rămas sub condiții hipobarice, dar au fost transferați în condiții tonormobarice la fiecare 96 de ore, moment în care li s-a furnizat hrană și apă și cuștile au fost curățate. Durata tranziției de la hipobaric la hipobaric a fost de aproximativ 2 ore. Toate grupurile de tratament au fost tratate cu Cis corespunzător (8 mg/kg/zi) prin gavaj oral timp de 8 săptămâni, în timp ce șobolanii martor și model au fost tratați cu un volum egal de apă.
După 8 săptămâni, șobolanii au fost sacrificați sub anestezie. Testiculele, epididimul și veziculele seminale au fost separate și cântărite, iar indicele de organe a fost calculat conform următoarei formule: (greutatea organului/greutatea animalului) × 100 la sută. Ulterior, spermatozoizii din epididim au fost colectați și au fost testate motilitatea și activitatea acrosoenzimei. În mod similar, țesuturile testiculare au fost colectate pentru studii histopatologice și detectarea ROS, LPO și a enzimei antioxidante.
Evaluarea ratei spermatozoizilor vii
Epididimul a fost incizat cu foarfece chirurgicale, iar suspensia de spermatozoizi a fost preparată în soluție salină normală. Pentru a evalua rata de spermatozoizi vii, 5 μL de suspensie de spermă au fost amestecați cu grijă cu un volum egal de eozină-Ystain. Spermatozoizii au fost apoi numărați la microscop ușor. Ratele de spermatozoizi vii au fost evaluate prin calcularea atât a spermatozoizilor colorați (sperma mort), cât și a spermatozoizilor necolorați (sperma vii).
pulbere de Cistanche tubulosacreșteratele spermatozoizilor vii.
Pentru mai multe informații, vă rugăm să faceți clic aici.
Determinarea enzimei acrozomului spermatozoid
Testul activității enzimatice acrozomului spermatozoizilor a fost utilizat pentru a evalua acrosoenzimele spermatozoizilor [19]. Rezultatele din fiecare grup au fost calculate folosind următoarea formulă: Activitatea enzimei acrosom (μIU)=(ODExperimentgroup - ODBlank group)/(247,5 × 10) × 106.
analize statistice
Toate datele cantitative sunt exprimate ca medie ± SD și au fost analizate folosind software-ul SPSS 22.0. Testul t al Independent Student a fost folosit pentru a compara datele dintre două grupuri. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
