Partea 1: echinacozidul induce moartea celulelor canceroase apoptotice prin inhibarea enzimei de dezinfectare a bazinului de nucleotide MTh1

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com

Abstract:Inhibarea enzimei de igienizare a grupului de nucleotide MTH1 cauzează leziuni extinse ale ADN-ului oxidativ și apoptoză în celulele canceroase și, prin urmare, poate fi utilizată ca strategie anticanceroasă. Deoarece produsele naturale au reprezentat o sursă bogată de substanțe chimice medicinale, în studiul de față, am folosit reacția enzimatică catalizată de MTH1-ca un test de screening in vitro cu randament ridicat pentru a căuta compuși naturali capabili să inhibe MTH1.Echinacozidul, un compus derivat din plantele medicinaleCistancheși Echinacea, au inhibat eficient activitatea catalitică a MTH1 într-un test in vitro. Tratamentul diferitelor linii de celule canceroase umane cuEchinacozidula dus la o creștere semnificativă a nivelului celular de guanină oxidată (8-oxoguanină), în timp ce nivelul speciilor reactive celulare de oxigen a rămas neschimbat, indicând faptul căEchinacozidula inhibat, de asemenea, activitatea MTH1 celulară. În consecință, tratamentul cu Echinacozide a indus o creștere imediată și dramatică a markerilor de deteriorare a ADN-ului și reglarea în sus a inhibitorului G1/S-CDK p21, care au fost urmate de moartea celulară apoptotică marcată și oprirea ciclului celular în cancer, dar nu și în celulele noncanceroase. Luate împreună, aceste studii au identificat un compus natural ca inhibitor MTH1 și sugerează că produsele naturale pot fi o sursă importantă de agenți anticancerigen.

Cuvinte cheie: Echinacozidul, MTH1, 8-oxoG, deteriorarea ADN-ului, apoptoză, oprirea ciclului celular

Cistancheextract areanti-cancerbeneficii pentru sănătate

Click aici pentru partea 2

Introducere

Rezervorul de nucleozid trifosfat (NTP) și deoxinucleozid trifosfat (dNTP) celular și mitocondrial este o țintă semnificativă a diferitelor specii reactive de oxigen (ROS).1–3 Deoarece specificitatea ADN polimerazelor este mai puțin decât perfectă, dNTP-urile oxidate pot fi încorporat în ADN-ul nou sintetizat pentru a provoca aberații genetice dacă nu este fixat.6 De exemplu, baza oxidată majoră din rezervorul de nucleotide, 8-oxoguanina (8-oxoG), poate perechi baze cu citozină și adenina. Când este introdus în adenina opusă în timpul replicării ADN-ului, poate provoca transversia T: A=G: C,7 care este una dintre cele mai frecvente mutații găsite în cancerele umane.8,9 Deși majoritatea dNTP-urilor libere oxidate sunt eliminate de enzimele de igienizare a bazinului de nucleotide, studiile din trecut au relevat că bazinul de nucleotide este încă o sursă importantă de baze oxidate în moleculele de ADN și un contribuitor semnificativ la daunele oxidative ale ADN-ului.3,10 cea mai importantă enzimă pentru igienizarea nucleotidelor. Cu toate acestea, chiar și sub supravegherea enzimelor de igienizare a bazinului de nucleotide, o parte semnificativă a dNTP-urilor oxidate sunt încorporate în ADN, iar bazele din moleculele de ADN pot fi, de asemenea, oxidate direct de ROS.6 Celulele se bazează apoi pe strategii mai elaborate care implică diverse ADN glicozilaze, cum ar fi OGG1 și MUTYH, și procese de reparare a ADN-ului, inclusiv repararea prin excizie a bazelor (BER) și repararea nepotrivirii (MMR), pentru a fixa bazele problematice în moleculele de ADN.10,16,17 BER a nd MMR repara în mod normal numeroase baze oxidate în ADN pe zi și astfel joacă roluri importante în protejarea integrității și stabilității genomului.

În celulele care sunt supuse unui stres oxidativ crescut, încorporarea crescută a nucleotidelor oxidate în ADN poate copleși capacitatea de reparare celulară și poate declanșa răspunsul la deteriorarea ADN-ului (DDR).18 Semnalizarea DDR persistentă va duce la oprirea ciclului celular, senescența celulară prematură sauapoptoza, stabilind astfel o barieră pentru tumorigeneză.19 Cu toate acestea, deși celulele canceroase prezintă o tensiune oxidativă foarte crescută și generează o povară potențial letală de nucleotide oxidate,20 ele pot supraviețui senescenței asociate DDR sauapoptoza.21 Un număr mare de studii au arătat că MTH1, prin eliminarea eficientă a 8-oxodGTP și 2-OH-dATP periculos de abundentă din celulele tumorale, joacă un rol cheie în dezvoltarea cancerului.22 MTH1 a fost s-a dovedit a fi supraexprimat în diferite tipuri de cancer,23–25 și nivelurile de 8-oxoG, iar extinderea leziunilor oxidative de ADN a fost mai mică în tumori decât în ​​țesuturile normale din jur.26–28 Din punct de vedere funcțional, supraexprimarea MTH1 a redus semnificativ numărul de mutații ADN observate la fibroblastele embrionare de șoarece cu deficit de MMR10 și a permis celulelor să depășească senescența celulară prematură indusă de Ras oncogen și apoptoza;29 în timp ce suprimarea MTH1 a prevenit dezvoltarea cancerului la șoarecii cu deficit de OGG1-30 și a promovat DDR indus de ROS și senescența celulară în celulele transformate cu Ras.3,29,31 Astfel, deși MTH1 joacă un rol protector prin prevenirea mutațiilor induse de ROS în celulele sănătoase, aceste studii au descoperit că MTH1 este necesar în special pentru apariția și supraviețuirea a celulelor canceroase. Studiile recente au furnizat mai multe dovezi care susțin rolul MTH1 în dezvoltarea cancerului.31–34 Suprimarea MTH1 de către ARNi sau inhibitori de molecule mici în diferite linii de celule canceroase a dus la încorporarea semnificativ crescută a 8-oxo d G în ADN-ul genomic. , ceea ce duce la leziuni extinse ale ADN-ului, moartea celulelor apoptotice și supraviețuirea redusă a celulelor canceroase. Important, suprimarea MTH1 nu a afectat creșterea și supraviețuirea celulelor normale, probabil pentru că celulele normale au ROS mai scăzut și, prin urmare, sunt mai puțin dependente de MTH1 pentru supraviețuire.32,33 Aceste constatări sugerează că inhibarea MTH1 este o nouă strategie promițătoare de combatere a cancerului.

Produsele naturale au reprezentat o sursă bogată de compuși medicinali.35 Multe terapii moderne, inclusiv medicamentele anticancerigene, au fost derivate din preparate pe bază de plante sau botanice.36–39 Totuși, un număr mare de ierburi tradiționale s-a propus să posede diferite proprietăți terapeutice pentru a rămâne. să fie caracterizate, în mare parte din cauza dificultăților în controlul compoziției lor pentru a le defini fără ambiguitate eficacitatea și mecanismele de acțiune.40 Sunt necesare noi abordări care să permită detectarea compușilor activi și analiza mecanismelor moleculare. În acest sens, screening-ul in vitro cu randament ridicat, ghidat de țintă, poate fi esențial în găsirea compușilor medicinali definiți mecanic din resurse naturale. În studiul de față, am folosit reacția enzimatică catalizată de MTH1-ca un test in vitro de mare capacitate pentru a căuta compuși naturali care pot inhiba MTH1. În mod surprinzător, proiecția a dezvăluit astaEchinacozidul, un produs natural care este cel mai bine cunoscut pentru activitatea sa antioxidantă puternică, este capabil să inhibe MTH1.

Echinacozidulin cistanche cananti-apoptoză

Materiale și metode

Materiale

Compușii din plante naturale au fost achiziționați de la Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Republica Populară Chineză. Numele, numărul de catalog, numărul de înregistrare al Chemical Abstracts Service (CAS) și puritatea fiecărui compus sunt enumerate în Tabelul S1. Soluțiile stoc ale compușilor au fost preparate în 100% dimetil sulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA) și soluțiile de lucru au fost preparate în tampon de testare sau mediu complet de cultură celulară. Aceeași soluție fără compusul de testat, dar care conține aceeași cantitate de DMSO a fost utilizată ca vehicul martor. (S)-crizotinib a fost achiziționat de la Selleck Chemicals, Houston, TX, SUA.

screening in vitro

Testul enzimatic in vitro utilizat pentru a verifica compușii naturali din plante a urmat procedurile descrise de Gad și colab.32 Pe scurt, diluțiile în serie ale compușilor individuali au fost preparate în tamponul de testare constând din 100 mM Tris- acetat (pH 8.0), 4{0 mM NaCI, 10 mM acetat de Mg, 0,005 procente Tween 20 și 1 mM DTT. Apoi, s-au adăugat 0,5 nM recombinant humanMTH1 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) și 0,2 U/mL pirofosfataze anorganice (Thermo Fisher Scientific) și plăcile au fost incubate pe un agitator de farfurii timp de 1 oră la temperatura camerei. Volumul final de reacție a fost de 100 μL într-o placă de 96-godeuri. La sfârșitul reacției, s-a adăugat verde de malachit (J&K Scientific, Beijing, Republica Populară Chineză)41, iar plăcile au fost incubate la temperatura camerei timp de încă 15 minute. Absorbanța la 630 nm a fost măsurată cu un cititor de microplăci BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, SUA). Valorile concentrației inhibitoare (IC50) au fost determinate prin analiza de regresie neliniară utilizând software-ul GraphPad Prism.

cultură de celule

Osteosarcomul MG-63 uman, hepatocarcinomul SK-HEP{-1, cancerul de sân MCF7, cancerul colorectal SW480, rinichiul embrionar HEK293 și liniile celulare de fibroblaste NIH/3T3 de șoarece proveneau din Colecția Americană de Cultură de Tip și uman normal. Linia de celule hepatice L-O2 a fost achiziționată de la KenGen Biotech, Nanjing, Republica Populară Chineză. Aceste celule au fost menținute la 37 de grade într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2, urmând instrucțiunile date de furnizori. Nu a fost cerută nicio declarație de etică din partea consiliului de revizuire instituțional pentru utilizarea acestor linii celulare.

Măsurarea nivelurilor intracelulare de {{{0}}oxo intracelular 8-oxoG a fost măsurată prin colorarea cu avidină conjugată Cy{3-42. Un total de 1×104 celule au fost însămânțate pe o lamă rotundă în 12-plăci de godeuri. A doua zi, celulele au fost tratate cu 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM sau 80 μM Echinacoside timp de 5 ore, 12 ore sau 24 de ore și apoi au fost fixate cu gheață -metanol rece timp de 20 de minute, urmată de incubare în soluție salină tamponată cu Tris (TBS) cu 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) timp de 15 minute. Probele au fost blocate în TBS cu 0,1% Triton X-100 și 15% ser fetal bovin timp de 1 oră la temperatura camerei și apoi colorate cu Cy3-avidină conjugată (0,5 ug/mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, SUA) în soluție de blocare timp de 1 oră la 37 de grade. După spălarea în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) de 3 ori timp de 5 minute, lamelele au fost sigilate pe lame de sticlă pentru protecție împotriva insectelor Mediu de montare cu 4′,6-diamidino{-2-fenilindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA , STATELE UNITE ALE AMERICII). Imaginile au fost luate și analizate cu un microscop confocal Zeiss LCM 510.

Măsurarea ROS intracelular Nivelurile intracelulare de ROS au fost măsurate prin citometrie în flux utilizând un kit de analiză ROS pe bază de celule (Beyotime Biotechnology, Haimen, Republica Populară Chineză). Celulele crescute în plăci cu șase godeuri au fost tratate cu 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM sau 80 μM Echinacoside timp de 5 ore, 12 ore sau 24 de ore, spălate de două ori cu PBS și incubate cu 10 μM diacetat de diclorofluoresceină timp de 30 de minute la 37 de grade. Celulele au fost apoi tripsinizate și analizate cu citometrul de flux FACCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA). Nivelurile intracelulare de ROS au fost exprimate ca intensitatea medie a fluorescenței diclorodihidrofluoresceinei a celulelor. Cifrele afișate au fost medii a trei experimente independente.

Colorare imunofluorescentă

Celulele crescute pe lamele au fost tratate cu {{0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM sau 80 μM Echinacoside timp de 5 ore, 12 ore sau 24 de ore și apoi spălate o dată cu PBS, fixat cu 4% paraformaldehidă în PBS timp de 20 de minute și blocat în TBS cu 0,1% Triton X-100 și 15% ser fetal bovin timp de 1 oră la temperatura camerei. Celulele fixe au fost colorate timp de 2 ore la temperatura camerei cu un anticorp primar împotriva 8-oxoG (anti-8-oxoG monoclonal de șoarece, Abcam), 53BP1 (iepure anti{-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery). ( Anticorp secundar de capră Abcam) sau Cy3-conjugat anti-iepure (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, SUA) timp de 1 oră la temperatura camerei. După spălare în PBS de 3 ori timp de 5 minute, lamelele au fost sigilate pe lame de sticlă în mediu de montare VECTASHIELD cu DAPI (Vector Laboratories). Imaginile au fost realizate cu un microscop confocal Zeiss LCM 510.

test de formare a coloniilor

Cu o zi înainte de tratament, celulele au fost însămânțate într-o placă cu șase godeuri la o concentrație de 1×104 celule per godeu. Au fost apoi tratați cu 0 μM, 60 μM sau 80 μM Echinacoside timp de 7 zile. După spălare cu PBS, celulele au fost fixate cu metanol rece ca gheață și colorate cu soluție de cristal violet (Sigma-Aldrich) (0,5% în metanol 25%). Imaginile au fost fotografiate după uscarea plăcilor peste noapte. Cristalele de cristal violet au fost dizolvate prin adăugarea de 70% etanol, iar absorbanța la 595 nm a fost măsurată cu un cititor de microplăci BioRad 680. Datele au fost analizate folosind software-ul GraphPad Prism.

Testul MTT

Cu o zi înainte de tratament, celulele au fost însămânțate în plăci de 96-godeuri la o concentrație de 1×104 celule per godeu, urmată de tratament cu diluții în serie de echinacozidă timp de 24 de ore sau 48 de ore sau cu 60 μM de echinacozidă timp de 5 ore, 12 ore. , sau 24 de ore. Mediul a fost îndepărtat și celulele au fost spălate cu PBS și apoi, 20 μL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{15} La fiecare godeu sa adăugat soluţie de bromură de difenil tetrazoliu (MTT) (5 mg/ml în PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific). Plăcile au fost incubate la 37 de grade pentru încă 4 ore. La final, soluția MTT a fost îndepărtată și s-au adăugat 150 μL de DMSO în fiecare godeu. Plăcile au fost incubate pe un agitator de plăci timp de 10 minute, iar absorbanța la 570 nm a fost măsurată cu un cititor de microplăci BioRad 680. Fiecare experiment a fost efectuat de două ori în trei exemplare. Datele au fost analizate folosind software-ul GraphPad Prism. Valorile IC50 au fost determinate utilizând analiza de regresie neliniară.

analiza ciclului celular

Celulele din plăci cu șase godeuri au fost tratate cu 0 μM, 6{{10}} μM sau 80 μM Echinacoside timp de 24 de ore, recoltate cu tripsină (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA) , spălat de două ori cu PBS și apoi fixat cu etanol rece ca gheață (70 la sută) timp de 2 ore la -20 grade. Celulele fixate au fost spălate de două ori în PBS rece și resuspendate în 300 μL de PBS proaspăt preparat cu 0,1% Triton X-100, 0,2 mg/mL RNază A fără DNază (Sigma-Aldrich), 10 ug/mL iodură de propidiu ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Elveția). După incubare la 37 de grade în întuneric timp de 20 de minute, celulele au fost filtrate printr-o plasă de nailon Falcon (BD Biosciences), încărcate pe citometrul de flux FAC-SCalibur și analizate folosind software-ul ModFit (BD Biosciences).

Analiza fragmentării ADN-ului

Celulele crescute în plăci cu șase godeuri au fost tratate cu echinacozidă 0 μM, 60 μM sau 80 μM timp de 24 de ore și fixate în paraformaldehidă 4% rece ca gheață (Sigma-Aldrich) timp de 20 de minute. După spălare cu PBS, celulele au fost sigilate în mediu de montare VECTASHIELD cu DAPI (Vector Laboratories). Morfologia nucleară a fost fotografiată cu un microscop fluorescent Olympus. Pentru a detecta fragmentarea ADN-ului pe gelurile de agaroză, ADN-ul a fost extras folosind microkit-ul QIAamp DNA (Qiagen NV, Venlo, Olanda), iar electroforeza a fost efectuată pe geluri de agaroză 2% care conțineau 0,1 ug/mL bromură de etidio.

Analiza apoptozei prin citometrie în flux Celulele apoptotice au fost examinate utilizând un kit de detectare a apoptozei Annexin V-FITC (Bestbio, Shanghai, Republica Populară Chineză), urmând instrucțiunile producătorului. Celulele crescute în plăci de 96-godeuri au fost tratate cu 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM sau 160 μM echinacozidă timp de 2 ore, 5 ore, 12 ore sau 24 de ore, spălat de două ori cu PBS și apoi resuspendat într-un tampon de legare. Apoi, s-au adăugat secvențial 5 μL de anexină V-FITC și 5 μL de PI (Roche), iar celulele au fost incubate timp de 15 minute la întuneric la temperatura camerei. Celulele au fost încărcate pe citometrul de flux FACSCalibur (BD Biosciences), iar datele au fost analizate folosind software-ul Cell Quest (BD Biosciences).

Analiza Western blot

Celulele crescute în plăci cu șase godeuri au fost tratate cu echinacozidă 0 μM, 6{{1{0}} μM sau 80 μM timp de 5 ore, 12 ore sau 24 de ore, spălat de două ori cu PBS și îndepărtat placa folosind 100 μL de tampon de radioimunoprecipitare (150 mM NaCl, 1,0% IGEPAL CA-630, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% dodecil sulfat de sodiu şi 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) conţinând 1 mM fluorură de fenilmetan sulfonil. Probele au fost centrifugate la 12,000x g timp de 20 de minute la 4 grade. Concentrațiile de proteine ​​din supernatanți au fost determinate de reactivul Bradford (Dingguo, Changchun, Republica Populară Chineză). Probele au fost denaturate la 95 de grade timp de 10 minute și separate pe gel de electroforeză în gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 12%. După electroforeză, proteinele au fost transferate pe membrane de fluorură de poliviniliden (Millipore), urmate de blocare în soluție salină tamponată cu Tris cu Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 procente Tween 20) care conține 5 procente (g/v) lapte degresat timp de 1 oră la temperatura camerei. Petele au fost testate cu anticorpi primari împotriva p21 (Abcam), poli (ADP-riboză) polimerază (Bioss) sau caspază activată-3 (Bioss), urmate de anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Semnalele au fost dezvoltate folosind kitul de detectare Western blotting cu chemiluminescență îmbunătățită (Transgen Biotech, Changchun, Republica Populară Chineză). Experimentele au fost repetate de trei ori.

Echinacozidulin cistanche cananti-apoptozășiantioxidare

Măsurarea mitocondriale

potențial de membrană

Potențialul membranei mitocondriale a fost măsurat folosind colorantul JC{{0}} (Biotehnologie), urmând instrucțiunile producătorului. Celulele crescute în plăci cu șase godeuri au fost tratate cu 0 μM, 60 μM sau 80 μM Echinacoside timp de 5 ore, 12 ore sau 24 de ore, spălate de două ori în PBS și apoi incubate cu JC-1 timp de 20 de minute. Imaginile au fost realizate cu un microscop fluorescent Olympus.

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată folosind software-ul GraphPad Prism. Semnificația a fost calculată utilizând o analiză unidirecțională a varianței, iar P0.05 a fost considerat semnificativ statistic. Rezultatele au fost exprimate ca medie ± abatere standard.

Echinacozidulin cistanche cananti-apoptozăși îmbunătățirea imunității