Partea 1: Stabilirea modelului experimental concomitent al osteoporozei combinat cu boala Alzheimer la șobolan și efectele duale ale echinacozidei și acteozidei din Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRACT
Relevanță etnofarmacologică: Cistanche tubulosaeste un medicament tradițional chinezesc prețios, care a fost utilizat pe scară largă în tratamentul osteoporozei șiBoala Alzheimer.Echinacosideși acteosidul sunt principalii constituenți activi din Cistanche tubulosa care au activități farmacologice cu valoare de cercetare. Acesta a fost raportat că echinacoside șiacteosidar putea îmbunătăți capacitatea de învățare și memorie, promova proliferarea și diferențierea osteoblastelor. Scopul studiului: Echinacoside și acteoside dinCistanche tubulosaau prezentat activități semnificative de anti-osteoporoză și boala anti-Alzheimer, în timp ce aceste efecte nu au fost studiate concomitent într-un model de șobolan. Scopul acestui studiu a fost de a stabili și verifica modelul de osteoporoză combinat cuBoala Alzheimerla șobolani și pentru a investiga efectele duble aleechinacozidăși acteoside pe acest model concurent.
Materiale și metode:Trei grupuri model de ovariectomie (OVX), chirurgie falsă cu D-galactoză și AlCl3 (D), ovariectomie cu D-galactoză și AlCl3 (OVX + D) au fost stabilite în același timp. Șobolanii din grupurile de tratament medicamentos au fost ovariectomizați. În timp ce efectuează injectarea intraperitoneală de D-galactoză și administrarea intragastrică a AlCl3 la șobolanii din grupurile de tratament medicamentos, șobolanii au fost administrați pe cale oralăechinacozidă(90 mg/kg/d),acteosid(90 mg/kg/d) și, respectiv, ale medicamentelor martor pozitive ale valeratului de estradiol (0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d). După tratamentul medicamentos de 8 săptămâni, a fost efectuat pentru prima dată testul Morris Water Maze (MWM) timp de 6 zile. Șobolanii au fost apoi sacrificați pentru a recolta sângele, uteri, femora, tibiae și țesuturile creierului. Serul a fost folosit pentru teste biochimice. Uterele au fost folosite pentru histomorfometrie. Femora dreapta au fost folosite pentru Micro-CTși, respectiv, histomorfometria. Tibia potrivită a fost utilizată pentru testul biomecanic. Hipocampul colectat pe cutia de gheață a fost folosit pentru teste biochimice. Creierul 41 colectat prin perfuzie a fost folosit pentru histomorfometrie.
Rezultatele:În comparație cu grupul Sham, grupul OVX + D ar putea reduce semnificativ capacitatea de învățare și memorie prin provocarea de daune oxidative, afectarea neuronilor din hipocampus și afectarea hidrolizei și sintezei acetilcolinei. Între timp, activitățile BALP și TRAP în grupul OVX +D au crescut semnificativ (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinacozidășiacteosid, caracteristicile patologice tipice ale osteoporozei șiBoala Alzheimerau fost ameliorate.
Concluziile:Modelul osteoporozei combinat cuBoala Alzheimerla șobolani a fost fezabilă și stabilită cu succes.Echinacosideși acteoside au arătat, de asemenea, unele efecte semnificative asupra acestui model concurent și ar putea fi potențiali 56 de candidați dinCistanche tubulosacu efecte duble pentru studii ulterioare.
Cuvinte cheie:osteoporoza; Boala Alzheimer; efecte duale; echinacoside; acteosid; Cistanche tubulosa
Cistanche pierdut imperiul ierburi ameliorează boala Alzheimer
1. Introducere
Osteoporoza este o boală osoasă degenerativă caracterizată printr-o pierdere progresivă a masei osoase și distrugerea microarhitecturii, care poate crește riscul de fractură de fragilitate (Rachner et al., 2011).Boala Alzheimer(AD) este o boală neurodegenerativă comună la vârstnici, care se caracterizează prin declin mental continuu, tulburări cognitive și pierderea capacității de viață independentă în clinică (Reitz 76 et al., 2011). Formarea plăcii senile induse de depunerea β-amiloidă, încurcăturile neurofibrilare cauzate de hiperfosforilarea tau și degenerarea neuronală în creier sunt caracteristicile patologice tipice ale AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Superficial, OP și AD sunt boli complet independente, cu patologie și caracteristici clinice diferite. Cu toate acestea, OP și AD sunt adesea observate să apară în co-apar în practica clinică (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Prevalența ambelor boli a crescut odată cu vârsta, în special la femeile aflate în postmenopauză (Li et al., 2017; Stern, 2012). Din ce în ce mai multe dovezi au indicat că persoanele diagnosticate cu AD au un risc crescut de OP (Zhou et al., 2014).
Este necesar să se studieze și să se clarifice relațiile dintre osteoporoză șiBoala Alzheimerin vitro și in vivo. Înainte ca studiile să fie efectuate in vivo, este important să se selecteze modelele animale aplicabile de osteoporoză sau boala Alzheimer. Modelul osteoporozei ar putea fi stabilit prin mai multe tipuri de metode, cum ar fi administrarea intragastrică a acidului retinoic, chirurgia ovariectomiei și injectarea intramusculară a glucocorticoizilor (Wei et al., 2007; Komori, 2015). În special, modelul osteoporozei postmenopauză indus de ovariectomie la șobolani a fost clasic șia fost utilizat pe scară largă în majoritatea studiilor (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Boala Alzheimer sporadică este principalul tip de boală Alzheimer. Animalulmodele de sporadiceBoala Alzheimerar putea fi induse prin diferite metode, cum ar fiinjectarea de D-galactoză sauβ-administrarea amiloida, intragastrica a AlCl3,și așa mai departe(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). În plus,model de conjuncție a bolii Alzheimer induse de intraperitoneal pe termen lunginjectarea de D-galactoză combinată cu ovariectomie, de asemenea, a fost studiat foarte mult (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). Pentru a dezvălui relevanța osteoporozei șiBoala Alzheimer, este necesar să se stabilească modelul de osteoporoză combinatecu boala Alzheimer pentru a studia mecanismele comune ale medicamentelor peosteoporoza siAlzheimer diseAse.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight este o plantă parazitară, care este distribuită în principal în deșerturile din nord-vestul Chinei. Tulpinile suculente uscate deCistanche tubulosa(CT) sunt folosite ca un medicament tonic celebru numit Cistanches Herba cu numele său chinezesc de Roucongrong în Farmacopeea chineză (2015). Acesta a fost onorat ca"Ginseng din deserturi" și este utilizat pe scară largă pentru tratamentele de talie și genunchi dureri, sterilitate feminină, și constipație în medicina tradițională chineză (Jiang și Tu, 2009). Principalii constituenți activi ai CT sunt glicozidele feniletanoide (PHG), echinacozidele (ECH) șiacteosid(ACT) sunt compușii reprezentativi din PHG (Morikawa et al., 2014). În special, ECH și ACT sunt de obicei selectate ca markeri pentru controlul calității în CT datorită conținutului lor ridicat și a diferitelor activități farmacologice, cum ar fi efectele neuroprotecției, protecția oaselor,
antioxidanți, anti-imbatranire, și îmbunătățirea capacității de învățare și memorie (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Cu toate acestea, efectele ECH și ACT asupra osteoporozeicombinate cuBoala Alzheimernu fuseseră încă studiate împreună într-un model de șobolan.Astfel, scopul acestui studiu a fost de a stabili un model de șobolan de osteoporoză combinatcu boala Alzheimer și de a explora efecteleechinacozidăși acteoside pe acestmodel concurent, astfel încât să furnizeze dovezi experimentale pentru studierea ulterioară amecanismul molecular al echinacozidei sau actozidelor în următoarele cercetări.
cistanche pharma specialepentruD.HR
2. Materiale și metode
2.1. Animale
Optzeci de șobolani Wistar de sex feminin în vârstă de 8 săptămâni (Număr certificat: SCXK 2018-0006), cântărind 180 ~ 200 g, au fost achiziționați de la SINO-Britanic SIPPR / BK Lab. Animal Ltd (Shanghai, China) și crescuți în Centrul Experimental al Animalelor Farmaceutice din China Pharmaceutical University.
2.2. Produse chimice și reactivi
Hidratul de cloral, penicilina G sodiu, D-galactoza, clorura de aluminiu hexahidrat, valerat de estradiol, donepezil HCl au fost achiziționate de la Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China).Echinacoside(HPLC 94%) a fost obținut de la Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China).Acteosid(HPLC 98%) a fost achiziționat de la Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China). Fosfataza alcalină specifică oaselor (BALP), fosfataza acidă rezistentă la tartrat (TRAP), superoxid dismutaza (SOD), malonaldehida (MDA), acetylcholinesterase (AChE) și testul imunosorbant legat de enzime colină acetiltransferază (ChAT) (ELISA) au fost achiziționate de la Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Fixativul universal al țesuturilor a fost obținut dinChengdu Wecistanche Bio-Technology Co, Ltd. (Chengdu, China).
echinacozidă
2.3. Modele și tratamente animale
Toate experimentele pe animale au fost autorizate și supravegheate de comitetul de etică animală al Universității Farmaceutice din China. Șobolanii au fost întreținuți cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore într-o cameră cu temperatură controlată (22±2°C) și hrăniți cu furaje standard și apă de la robinet.
După adaptarea de o săptămână, modelul osteoporozei a fost atins prin efectuarea unei intervenții chirurgicale de ovariectomie (franceză et al., 2008). După terminarea operației, penicilina G sodic a fost presărată pe sutura plăgii pentru o singură dată pentru a preveni infecția. Șobolanii au fost apoi hrăniți în mod normal timp de trei săptămâni. Conform referinței (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), modelul deBoala Alzheimerar putea fi indusă prin injectarea intraperitoneală pe termen lung de D-galactoză combinată cu ovariectomie sau administrarea intragastrică pe termen lung a AlCl3. Pentru a studia fezabilitatea modelului de osteoporoză combinat cu boala Alzheimer, în acest studiu au fost stabilite trei grupuri model de ovariectomie (grupa OVX), ovariectomie falsă cu injecție intraperitoneală de 150 mg/kg/d D-galactoză și administrare intragastrică de 30 mg/kg/d AlCl3 (grupa D), ovariectomie cu injecție intraperitoneală de 150 mg/kg/d D-galactoză și administrare intragastrică de 30 mg/kg/d AlCl3 (grup OVX+D).
Prin urmare, șobolanii au fost împărțiți aleatoriu în opt grupe (n = 9 pentru fiecare grup) după 3 săptămâni și tratați oral cu medicamente timp de 8 săptămâni: grupul Sham; Grupul OVX; Grupul D; Grupul OVX+D; grupul de tratament cu valerat de estradiol (grupul EV, OVX+D+0,6 mg/kg/d valerat de estradiol); grupul de tratament donepezil HCl (grupul DPZ, OVX+D+0,8 mg/kg/d donepezil HCl);echinacozidăgrupa de tratament (grupa ECH, OVX+D+90 mg/kg/d echinacozidă);acteosidgrupa de tratament (grupul ACT, OVX+D+90 mg/kg/d acteosidă). În conformitate cu principiul de conversie a dozei echivalente om-șobolan și doza din referințele aferente (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), dozele de grupuri de tratament medicamentos în acest studiu au fost adoptate.
Greutatea corporală a fiecărui șobolan a fost măsurată în fiecare săptămână. După întregul tratament cu medicamente care au durat 8 săptămâni, a fost efectuat pentru prima dată testul Morris Water Maze (MWM) timp de 6 zile. După aceea, 6 șobolani din fiecare grup au fost sacrificați pentru a recolta materialele. Șobolanii au fost anesteziați cu injecție intraperitoneală de 3,0 ml/kg 10% hidrat de cloral, iar sângele a fost colectat de la abdominalii aortei. Sângele a fost plasat la temperatura camerei pentru a se coagula și centrifugat la 3500 r/min timp de 10 min. Serul a fost recoltat într-un tub de centrifugare de 1,5 ml (NEST Biotechnology) și depozitat la -80 °C până când este utilizat pentru teste biochimice. Uteri, femora, tibiae, și țesuturile creierului au fost apoi colectate. Uterele au fost folosite pentru histomorfometrie. Femora dreapta au fost folosite pentru Micro-CT și histomorfometrie, respectiv. Tibia potrivită a fost utilizată pentru testul biomecanic. Hipocampul colectat pe cutia de gheață a fost folosit pentru teste biochimice. După aceea, ceilalți trei șobolani din fiecare grup au fost perfuzați din inimă cu soluție salină și fixativ universal de țesut pentru a recolta creierul pentru histomorfometrie.
2.4. Încercarea labirintului de apă Morris (MWM)
Șobolanii au fost supuși învățării de referință spațiale și testării memoriei în testul MWM după 8 săptămâni de intervenție. Testul MWM a fost efectuat după metodele raportate anterior (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Pe scurt, 5 zile consecutive cu patru încercări pe zi, șobolanii au fost instruiți să folosească o varietate de indicii vizuale situate pe peretele piscinei pentru a găsi o platformă ascunsă scufundată (diametru 11 cm, înălțime 29 cm) într-o piscină circulară (diametru 130 cm, înălțime 50 cm) umplută cu apă netoxică colorată cu cerneală de carbon. Piscina a fost împărțită imaginar în patru cadrane, iar patru poziții de start au fost situate la intersecțiile cadranelor. Platforma a fost amplasată în centrul unuia dintre cadrane, iar poziția a fost constantă în timpul încercărilor. În fiecare proces, șobolanii au fost plasați aleatoriu în locații selectate, cu fața spre peretele piscinei. Fiecare proces a fost încheiat atunci când șobolanul a ajuns la platformă sau după 60 de s, iar timpul scurs a fost înregistrat ca latență de evacuare. Șobolanul care nu a reușit să ajungă pe platformă a fost ghidat pe ea. După fiecare încercare pe platformă ascunsă, șobolanul a rămas pe platformă timp de 10 s. Timpul mediu de latență de patru teste pe zi a fost calculat ca rezultat al antrenamentului. În ziua 6, toți șobolanii au fost supuși unui proces de sondă în care au înotat timp de 60 de s în piscină fără platformă. Timpii de trecere la locul platformei și timpul de deplasare în cadranul țintă au fost înregistrate ca rezultate finale. Șobolanii au fost monitorizați de o cameră montată în tavan direct deasupra piscinei, și toate studiile au fost înregistrate și analizate folosind programul MORRIS MAZE care furnizate de Beijing zhongshidichuang știință și tehnologie de dezvoltare Co, Ltd. (Beijing, China)
2.5. Testul biochimic prin ELISA
Conform instrucțiunilor producătorului din kiturile ELISA, activitatea fosfatazei alcaline specifice osului (BALP), activitatea fosfatazei acide rezistente la tartrat (TRAP), activitatea superoxid dismutazei (SOD) și conținutul de malondialdehidă (MDA) în ser au fost testate de cititorul de microplate multi-mode BioTek Synergy 2 (BioTek, SUA). Țesuturile hipocampului din fiecare grupă au fost spălate cu PBS (0,01 M, pH 7,4) pentru a îndepărta sângele sau impuritățile rămase pe suprafața țesutului. Țesuturile hipocampului de pe o parte au fost cântărite și apoi tăiate în bucăți cât mai mici posibil. Țesuturile hipocampului au fost omogenizate în funcție de raportul de 1: 9 (greutatea țesutului: volumul PBS). Omogenatul a fost centrifugat la 4°C, 3000 r/min timp de 15 min. Supernatantul a fost colectat și diluat pentru a măsura concentrația de proteine prin metoda BCA. Acetilcolinesterazei (AChE) activitate, coliná acetiltransferaza (ChAT) activitate, superoxid dismutaza (SOD) activitate, și malondialdehidă (MDA) conținutul în țesutul hipocampus au fost apoi testate prin metode ELISA.
2.6. Histomorfometria hipocampului
Țesuturile cerebrale (n=3/grup) au fost fixate în fixativ universal al țesuturilor. Probele de țesut cerebral au fost apoi spălate, deshidratate cu etanol gradient, încorporate cu ceară de parafină și feliate în secțiuni coronale de 5 μm. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină (HE). După aceea, secțiunile coronale ale țesuturilor cerebrale au fost fotografiate de un microscop de fluorescență inversat (Nikon, Japonia). Modificările morfologice ale CA1, CA2, CA3 și DG în hipocampus au fost observate în special.
2.7. Histomorfometria uterină și morfometria
Uterii selectati (n=3/grup) au fost fixati in fixativ tisular universal. Probele de țesut din uter au fost apoi spălate, deshidratate cu etanol gradient, încorporate cu ceară de parafină și feliate în secțiuni transversale de 5 μm. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină (HE). Secțiunile transversale ale uterului au fost observate și fotografiate. Cinci câmpuri vizuale au fost selectate aleatoriu, diametrul secțiunii transversale uterine și grosimea epiteliului mucoasei uterine au fost apoi măsurate cu ajutorul software-ului Image-Pro Plus 6.0. De asemenea, au fost numărate și numărul glandelor uterine din lamina proprie.
2.8. Micro-CT
Femora din dreapta selectată (n=3/grup) a fost scanată într-o poziție cu distanța obiectului față de sursa de 121 mm și distanța camerei până la sursa de 171 mm folosind o tomografie computerizată skyscan de 1176 micro raze X (Micro-CT) scaner (Bruker, Germania). Placa de creștere distală a fost selectată ca suprafață de referință. Cu o distanță de 1 mm sub suprafața de referință, o regiune cu grosimea de 1,8 mm a fost selectată ca volum de interes (VOI, 100 de straturi). Imaginile în tonuri de gri rezultate au avut o dimensiune a pixelilor de 17,76 μm de la reconstrucția osoasă (65 kV, 385 μA). O metodă semiautomată de conturare a fost folosită pentru a selecta trabeculele din os cortical. Metode directe de măsurare 3D au fost utilizate pentru a evalua procentul de volum osos (BV / TV), densitatea suprafeței osoase (BS / TV), separarea trabeculară (Tb. Sp), numărul trabecular (Tb. N), grosimea trabeculară (Tb. Th), indicele modelului de structură (SMI), factorul de model trabecular (Tb. Pd) și densitatea minerală osoasă medie (DMO medie) pentru același VOI folosindCTProgramul analizorului (Bruker, Germania). Vizualizarea 3D a VOI folosind un algoritm de randare adaptiv a fost făcută cu software-ul CTvol (Bruker, Germania).
extract de plante cistanche
2.9. Histomorfometria osoasă
Femora dreaptă selectată (n = 3 / grup) au fost fixate în fixativ universal de țesut și apoi decalcificate într-o soluție de 10% EDTA-2Na timp de 3 săptămâni. Probele decalcificate au fost spălate, deshidratate cu etanol gradient, încorporate cu ceară de parafină și feliate în secțiuni longitudinale de 5 μm. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină (HE). Secțiunile longitudinale ale femora au fost fotografiate. S-au observat structurile țesutului osos din fiecare grup, în special structurile osoase trabeculare.
2.10. Testul biomecanic
Tibia dreaptă (n=4/grup) selectată aleatoriu a fost evaluată pentru testul de îndoire în trei puncte folosind o mașină universală de testare (SHIMADZU, Japonia). Diametrele acestor probe au fost măsurate prin etrier vernier în intervalul 2,16-2,38 mm (d). Proba a fost apoi plasată pe două bare transversale de susținere cu o distanță de 25 mm (L) între cele două șine, iar curbura fiziologică a specimenului a fost în sus. Tija de încărcare a încărcăturii a fost amplasată în centrul eșantionului și a scăzut la o viteză constantă de 1,5 mm/min până când eșantionul a fost rupt. Datele privind forța (F) și deplasarea au fost înregistrate automat într-un computer care a fost interconectat cu mașina de testare, iar curba sarcină-deformare a fost trasată simultan. Valorile sarcinii maxime (N) și absorbției energiei (mJ) au fost înregistrate de software-ul de testare a materialelor TRAPEZIUM X în același timp. Valorile stresului maxim (MPa) au fost calculate conform următoarei formule: Stres (σ) = moment de îndoire (M) / Factor de secțiune (Z) = (8×L×F) / (π×d3 )
2.11. Analiza statistică
Rezultatele grupurilor model au fost comparate cu grupul Sham, iar cele ale grupurilor tratate cu medicamente au fost comparate cu grupul OVX+D. Datele au fost analizate folosind ANOVA unidirecțională, urmată de testul de comparație multiplu al lui Bonferroni folosind software-ul Graph Pad Prism 5.0. Datele au fost exprimate ca medie ± SD, iar valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic.
myricetinșicistanche
