Partea 1|Hiperactivitatea glicogenului sintaz kinaza 3b în celulele exfoliate urinare prezice progresia bolii de rinichi diabetici

Xianhui Liang, și colab

1Centrul de purificare a sângelui, Institutul de Nefrologie, primul spital afiliat al Universității Zhengzhou, Zhengzhou, China; 2 Departamentul de Medicină, Divizia de Boli de Rinichi și Hipertensiune, Spitalul Rhode Island, Școala de Medicină a Universității Brown, Providence, RhodeIsland, SUA; și 3 Departamentul de Medicină, Divizia de Nefrologie, Universitatea din Toledo, Colegiul de Medicină, Toledo, Ohio, SUA

Pentru mai multe informații, vă rugăm contactați:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa previne bolile de rinichi, faceți clic aici pentru a obține mostra

Dovezile în creștere indică glicogen sintaza kinaza (GSK) 3b ca un jucător cheie în diverseboli de rinichi. Cu toate acestea, ca traductor pivot al căii de semnalizare a insulinei, rolul GSK3b în diabeticirinichi boalarămâne incert. La șoarecii DB/DB, expresia renală a GSK3b total și activat a fost din ce în ce mai crescută. Aceasta a precedat dezvoltarea diabetuluirinichi boalasi corelat cu progresia semnelor dediabeticrinichileziuni, inclusiv albuminurie și acumulare de matrice extracelulară în glomeruli și tubulointerstițiali. In vitro, expunerea podocitelor glomerulare, a celulelor mezangiale și a celulelor tubulare renale la un mediu diabetic a indus supraexprimarea și hiperactivitatea GSK3, care par esențiale și suficiente pentru a provocadiabeticleziuni celulare în celulele rinichilor, deoarece efectul citopatic al mediului diabetic a fost atenuat de distrugerea GSK3b, dar a fost imitat de expresia ectopică a GSK3b constitutiv activ chiar și în mediul normal. Incoerență, probele de biopsie renală obținute de la pacienți cu diferite stadii de nefropatie diabetică au evidențiat o expresie amplificată a GSK3b total și activat în glomeruli și tubii renali, asociată cu severitatea nefropatiei diabetice. Mai mult, în cohortele retrospective de pacienți cu diabet de tip 2 care au fost urmăriți timp de peste cinci ani, activitatea relativă a GSK3b în celulele exfoliate urinare acumulate a reprezentat un factor de risc independent pentru dezvoltarea sau progresia insuficienței renale. În plus, analiza curbei caracteristice de funcționare a receptorului a demonstrat că activitatea GSK3b în celulele exfoliate urinare a furnizat o putere mult mai bună decât albuminuria în discriminarea pacienților diabetici cu insuficiență renală progresivă de cei cu funcție renală stabilă. Astfel, expresia renală și activitatea GSK3b sunt amplificate în nefropatia diabetică experimentală și clinică. Prin urmare, GSK3b în celulele exfoliate urinare poate servi ca un biomarker nou pentru prezicerea diabetuluirinichiboalaprogresie.

Boală renală diabetică(DKD) continuă să fie o cauză principală a insuficienței renale în stadiu terminal în Statele Unite și în alte țări dezvoltate.1,2 Cu toate acestea, nu toți pacientii cu diabet zaharat dezvoltă nefropatie diabetică (DN), așa cum evidențiază o serie de boli de lungă durată. studii epidemiologice de urmărire pe termen lung.3 Motivul acestui rezultat eterogen nu este pe deplin înțeles, dar aparent multifactorial, implicând diverși factori cauzali, inclusiv genetica, mediile, preexistenterinichiboala, și severitatea diabetului zaharat.4,5 Controlul slab al glicemiei a fost un factor de risc bine cunoscut pentru albuminurie și DN. Cu toate acestea, o parte semnificativă a pacienților dezvoltă în continuare DN în ciuda controlului glicemic strâns.6 În practica clinică, este necesar să se adopte un biomarker sensibil și precis pentru stratificarea pacienților diabetici cu risc de a evolua spre insuficiență renală. De ani de zile, albuminuria a fost considerată un marker surogat al complicațiilor renale diabetice.7,8 Cu toate acestea, un număr tot mai mare de dovezi sugerează că albuminuria poate să nu fie exactă.9,10 A fost observată o discordanță semnificativă între albuminurie și insuficiența renală în DN. 11,12 Conform datelor din Marea Britanie Prospective Diabetes Study,13 dintre acei pacienți care au dezvoltat insuficiență renală, 61% nu au avut albuminurie în prealabil și 39% nu au dezvoltat albuminurie în timpul studiului. De asemenea, dintre acei pacienți care au dezvoltat albuminurie, doar 24 la sută au dezvoltat ulterior insuficiență renală în timpul studiului. Cu alte cuvinte, pentru pacienții cu microalbuminurie sau macroalbuminurie, majoritatea predominantă ar putea să nu dezvolte insuficiență renală. Aceste date provoacă astfel paradigma clasică a albuminuriei care precedă întotdeauna insuficiența renală în timpul progresiei DKD. Ca atare, este imperativ să se identifice noi biomarkeri.

pentru prezicerea DN sau pentru diagnosticarea precoce a DN. În ultimul deceniu, au fost testate o serie de molecule noi.14–16 Dintre acestea, glicogen sintaza kinaza 3 (GSK3) a apărut ca un candidat atractiv. GSK3 este o serină/treonin-protein kinază extrem de conservată, exprimată omniprezent, care a fost inițial caracterizată a fi un traductor cheie al cascadei de semnalizare a insulinei și guvernează glicogeneza. Interesul pentru GSK3 a crescut foarte mult odată cu realizarea că acesta acționează și ca punct de convergență pentru căile multiple de semnalizare celulară implicate îninflamaţie, imunomodulare, embriogeneză, leziuni tisulare, reparare și regenerare.17–19 GSK3 există ca 2 izoforme: GSK3a și GSK3b. În diferite țesuturi ale organelor, cele 2 izoforme sunt exprimate diferențial. În cortexul renal, izoforma b este predominant exprimată și localizată în glomeruli și celulele tubulare proximale.20,21 Hiperactivitatea renală a GSK3b a fost asociată cu o gamă diversă de boli renale, inclusiv glo-neuropatii proteinurice și boli renale cronice progresive.22 , ca traductor cheie al căii de semnalizare a insulinei, rolul GSK3b în patogeneza DN este încă necunoscut. Rămâne de delimitat dacă dereglarea GSK3b în rinichi este implicată în DN. Pentru a aborda această problemă, prezentul studiu a examinat profilurile de expresie ale GSK3b total și activat în specimene de rinichi procurate din modele murine dB/dB de DN non-insulino-dependent și în țesuturile de biopsie renală de la pacienți cu stadii diferite de DN de tip 2. În plus, în cohortele retrospective de pacienți cu diabet zaharat de tip 2, nivelurile de expresie ale GSK3b total și activat au fost măsurate în celulele exfoliate urinare, care au fost prelevate ca o biopsie de rinichi lichidă pe bază de urină. Am examinat relația dintre nivelurile de expresie ale GSK3b sau forma sa activată în celulele exfoliate urinare de bază și dezvoltarea sau progresia insuficienței renale la pacienții diabetici.

REZULTATE

GSK3b este supraexprimat și hiperactiv în celulele parenchimatoase renale la șoarecii db/db, asociat cu progresia albuminuriei și leziuni renale diabetice

Șoarecii db/db cu deficit de receptor de leptină sunt modele bine stabilite pentru diabetul zaharat de tip 2 și DN. Începând cu vârsta de 10 săptămâni, șoarecii db/db dezvoltă spontan semne timpurii deleziuni renale, caracterizată prin albuminurie progresivă și acumulare de matrice în glomeruli.23 În schimb, șoarecii de control de vârstă (db/m) au glicemie normală și nu există dovezi vizibile deboală de rinichi. Într-un experiment care a început la vârsta de 10 săptămâni, expresia renală a GSK3b total (Figura 1) și activat (Figura 2) (fosforilat la Y216 [p-GSK3B]) la șoarecii db/db față de șoarecii de control db/m a fost crescută progresiv ( Figura 1b și 2b). Acesta a fost localizat în principal la podocite și celulele mezangiale din glomeruli (Figura 1a) și la celulele epiteliale tubulare din tubulointerstițial (Figura 2a), așa cum se arată prin colorarea imunohistochimică. Descoperirile morfologice au fost coroborate prin analiza imunoblot a omogenaților întregi de rinichi (Figura 1c și 2c). Analiza de regresie a demonstrat că intensitatea colorării a GSK3b total (Figura 1d) și activat (Figura 2d) în glomeruli s-a corelat pozitiv cu excreția urinară a albuminuriei la șoarecii db/db la vârste diferite. Chiar și în stadiul incipient al diabetului la șoarecii db/db, cum ar fi la vârsta de 10 sau 14 săptămâni, activitatea GSK3b a fost vizibil crescută în rinichi, așa cum se reflectă printr-o inducere semnificativă a p-GSK3b (Figura 2). Se pare că hiperactivitatea GSK3b în rinichii șoarecilor db/db în stadiul incipient a fost în mare parte atribuită modificărilor post-translaționale, cum ar fi fosforilarea la Y216, dar într-o etapă ulterioară, s-a datorat în principal expresiei crescute a GSK3b total.

Progresia DN prezintă o acumulare crescândă a matricei extracelulare atât în ​​glomeruli cât și în interstițial. Într-adevăr, așa cum se arată prin colorarea imunohistochimică fluorescentă FL, rinichii de șoarece db/db au demonstrat o expresie crescută progresivă a fibronectinei atât în ​​glomeruli, cât și în interstițial (Figura 3a). Acest lucru a fost coroborat în continuare prin analiza imunoblot a omogenaților de rinichi pentru fibronectină și colagen IV (Figura 3b și c). În plus, expresia GSK3b total și activat a corelat pozitiv cu cea a fibronectinei înțesuturi renale(Figura 3d).

Pentru a determina în continuare dacă activarea îmbunătățită a GSK3b precede dezvoltarea DKD, șoarecii db/db și db/m au fost urmăriți într-un experiment separat, începând cu vârsta de 4 săptămâni în timpul etapei de prediabet. În săptămâna 7, șoarecii db/db au demonstrat hiperglicemie evidentă (Figura suplimentară S1A), sugerând diabet, dar fără semne de DKD, așa cum se arată în albuminuria normală (Figura suplimentară S1B). De remarcat, chiar și într-un stadiu atât de timpuriu al diabetului, expresia renală a GSK3b și p-GSK3b, precum și activitatea relativă a GSK3b exprimată ca raport p-GSK3b/GSK3b, au crescut în mod variabil, măsurat prin analiza imunoblot a țesuturilor biopsiei renale. urmată de densitometrie (Figura suplimentară S1C și D). În plus, analiza de regresie liniară a demonstrat că activitatea renală GSK3b în săptămâna 7 s-a corelat pozitiv cu dezvoltarea albuminuriei și DKD în săptămâna 13 (Figura suplimentară S1E). Mai mult decât atât, analiza curbei caracteristicii de funcționare a receptorului (ROC) a demonstrat că activitatea renală GSK3b la șoarecii db/db la vârsta de 7 săptămâni, când nu existau semne de DKD, a oferit o acuratețe și o putere excelente în prezicerea dezvoltării albuminuriei și a DKD (Figura suplimentară). S1F).

Expunerea celulelor renale la un mediu diabetic cauzează supraexprimarea și hiperactivitatea GSK3b, ducând la modificări citopatice diabetice

Pentru a determina dacă starea diabetică îmbunătățește direct activarea GSK3b încelule de rinichi, culturi in vitro de diverse linii celulare de rinichi, inclusiv podocite murine, celule mezangiale și celule epiteliale tubulare, au fost utilizate și expuse la un mediu diabetic care constă din glucoză ambientală ridicată și factor de creștere transformant (TGF) b1. Expunerea podocitelor la mediul diabetic a dus la leziuni izbitoare ale podocitelor, marcate de o pierdere a sinaptopodinei proteinei marker a podocitelor. Acest lucru a fost concordat cu inducerea proeminentă a GSK3b total și activat, așa cum se arată prin colorarea imunocitochimică fluorescentă FL (Figura 4a și b) și confirmată prin analiza imunoblot.

(Figura 4c și d). În celulele mezangiale cultivate, expresia totală (Figura 5a) și activată (Figura 5b) GSK3b a fost de asemenea crescută după expunerea la mediul diabetic, în paralel cu exprimarea crescută a moleculelor matricei extracelulare, cum ar fi fibronectina (Figura 5). În mod similar, celulele epiteliale tubulare renale cultivate au supraexprimat GSK3b total și activat după tratamentul în mediu diabetic, iar acest lucru a fost însoțit de disfuncția și dediferențierea celulelor tubulare, marcate de expresia diminuată și perturbată a moleculelor de joncțiune strânsă epitelială, cum ar fi zonula occludens{6}} ( -1) (Figura 6a–d). În schimb, ca control al osmolalității, tratamentul cu manitol al tuturor celulelor renale a dus la un efect care nu este diferit de cel transmis de mediul normal care conține glucoză ambientală normală. Diabetul uman implică nu numai hiperglicemie, ci și rezistență la insulină. Deși este imposibil să se separe complet hiperglicemia de rezistența la insulină la modelele animale sau la pacienți, modelele in vitro au fost valorificate pentru a examina efectul izolat al glucozei ridicate față de rezistența la insulină. Pentru a imita starea de rezistență la insulină, izoforma b a receptorului de insulină a fost doborâtă în podocite cultivate, celule mezangiale și celule tubulare renale (Figura suplimentară S2A-C), iar acest lucru a amplificat expresia și activitatea GSK3b chiar și în cazul normal. mediu, așa cum arată analiza imunoblot și densitometrie. Această acțiune a fost întărită după expunerea la mediul diabetic, denotând un efect sinergic al rezistenței la insulină și al glucozei ridicate asupra activării GSK3b.

Hiperactivitatea GSK3b este esențială și suficientă pentru leziunile și disfuncția celulelor renale provocate de mediul diabetic

Pentru a explora dacă hiperactivitatea GSK3b este implicată în modificările citopatice ale celulelor renale, activitatea GSK3b înrinichi de culturăcelulele au fost manipulate artificial prin interferența ARN

(ARNi) sau supraexpresia genei. Așa cum se arată în Figura 7a, ARNi care utilizează ARN-ul mic, care interferează abia afectează efectul citopatic al mediului diabetic în toate celulele renale. În schimb, tăcere GSK3b a abrogat substanțial suprimarea sinaptopodinei instigată de mediul diabetic în podocite, inducerea fibronectinei în celulele mezangiale și perturbarea ZO-1 în celulele tubulare renale, sugerând că GSK3b este probabil esențial pentru declanșarea modificărilor citopatice legate de diabet în celule de rinichi. Pentru a discerne dacă supraexprimarea și hiperactivitatea GSK3b sunt suficiente pentru efectele citopatice induse de mediul diabetic, celulele au fost transfectate tranzitoriu fie cu un vector gol, fie cu un vector care codifică mutantul activ constitutiv al GSK3b (S9A). Deși transfecția vectorului gol abia a exercitat niciun efect, supraexprimarea ectopică a S9A a dus la pierderea expresiei sinaptopodinei în podocite, producția crescută de fibronectină în celulele mezangiale și expresia redusă a ZO-1 în celulele tubulare renale chiar și în mediul normal (Figura 7b), care amintește de efectul citopatic al mediului diabetic.

Progresia DN-ului uman coincide cu supraexprimarea și hiperactivitatea GSK3b în glomeruli și tubuli renali

Pentru a valida în continuare dacă descoperirile de mai sus în modelele de cultură animală și celulară sunt aplicabile și DN-ului clinic, țesuturile de biopsie renală arhivate de la subiecți normali și pacienți cu diferite stadii de DN au fost procesate pentru colorarea imunohistochimică cu peroxidază pentru GSK3b și p-GSK3b. Caracteristicile subiecților de control și ale pacienților sunt rezumate în tabelul suplimentar S1. După cum se arată în Figura 8a, renal

expresia GSK3b totală și activată a fost din ce în ce mai crescută odată cu progresia DN, gradată în funcție de clasificarea patologică bazată pe colorația periodică acid-Schiff. Acest lucru este în concordanță cu datele Nephroseq, care demonstrează, de asemenea, o expresie semnificativ crescută a GSK3b în țesuturile de biopsie renală de la pacienții cu DN (Figura suplimentară S3). Expresia crescută a GSK3b total și activat a fost localizată predominant la podocite și celulele mezangiale din glomeruli și la celulele epiteliale tubulare renale din tubulointerstițial (Figura 8a), în acord cu constatările la șoarecii db/db. Rezultatele morfologice au fost coroborate în continuare prin analiza morfometrică computerizată, care a relevat o asociere pozitivă între nivelurile de expresie ale GSK3b total (Figura 8b) sau activat (Figura 8c) și severitatea DN.

GSK3b este hiperactiv în celulele exfoliate urinare colectate de la pacienții diabetici și prezice progresia insuficienței renale, atât în ​​condiții fiziologice, cât și în condiții de boală, turnover-ul și eliminarea celulelor epiteliale renale, cum ar fi podocitele glomerulare și celulele epiteliale tubulare, au loc în mod constant, ceea ce duce la excreția continuă. a celulelor parenchimatoase renale în urină. Celulele exfoliate urinare au fost valorificate cu succes ca biopsie renală lichidă neinvazivă pe bază de urină, în scopuri de cercetare și diagnostic. șoarecii chiar și în stadiul incipient înainte de manifestarea albuminuriei, ne-am întrebat dacă măsurarea GSK3b în celulele exfoliate urinare ar putea fi valorificată pentru a prezice

dezvoltarea sau progresia DKD umană. În acest scop, am folosit biobanca de diabet și am efectuat un studiu de cohortă retrospectiv. În total, 127 de pacienți cu diabet zaharat de tip 2, care au fost urmăriți la primul spital afiliat al Universității Zhengzhou din 2010 cu mostre de urină fracționată, au fost examinați pentru includerea în acest studiu. Dintre acești pacienți, 67 au fost excluși, cu 10 pierduți la urmărire, 52 având disfuncție renală sau proteinurie evidentă la debutul bolii și 5 ulterior diagnosticați ca alte boli de rinichi prin biopsie sau imagistică renală. În cele din urmă, 60 de pacienți au fost înrolați în acest studiu de cohortă retrospectiv (Figura 9). Caracteristicile demografice și clinice ale acestor pacienți la momentul inițial sunt rezumate în Tabelul 1. Niciunul dintre pacienți nu a avut disfuncție renală sau proteinurie evidentă la momentul inițial și niciunul nu a început terapia de dializă în perioada de urmărire. În funcție de amploarea albuminuriei, pacienții au fost clasificați în 2 subgrupe: loturi de normoalbuminurie și grupuri de microalbuminurie. Cu excepția nivelurilor de excreție urinară de albumină (UAE), cele 2 subgrupuri de pacienți nu au fost diferite statistic la momentul inițial în toți ceilalți parametri clinici, biochimici și fiziologici, inclusiv durata diabetului, nivelul hemoglobinei glicate, funcția rinichilor, tensiunea arterială și tratamentele prescrise. . După 5 ani de urmărire, 29 din cei 60 de pacienți au demonstrat progresia insuficienței renale, care a fost definită fie ca o reducere de 25 la sută a ratei estimate de filtrare glomerulară (eGFR) sau progresia statusului albuminuriei, așa cum este indicată de escaladarea severității. de albuminurie de-a lungul diferitelor stadii clinice ale DN, adică normoalbuminurie, microalbuminurie, microalbuminurie sau proteinurie evidentă. În schimb, restul de 31 de pacienți nu au prezentat semne de progresie a bolii renale (Figura 9). Datele inițiale ale pacienților au fost stratificate în funcție de stadiul de progresie a insuficienței renale după o urmărire de 5 ani (Tabelul 2). Pacienții cu progresie a insuficienței renale, în comparație cu cei fără progresie, au prezentat o reducere semnificativă a eGFR și o creștere marcată a EAU. Pentru a determina dacă GSK3b a fost supraexprimat sau supraactivat în celulele renale și

măsurată pentru a evalua sensibilitatea și specificitatea activității GSK3b în celulele exfoliate urinare în raport cu albuminuria inițială pentru a prezice progresia insuficienței renale. După cum se arată în Figura 11, activitatea relativă a GSK3b în celulele exfoliate urinare, exprimată ca raport p-GSK3b/GSK3b, a demonstrat o acuratețe și o putere excelente în discriminarea pacienților cu insuficiență renală progresivă de cei cu funcție renală stabilă, cu zona sub ROC. curba fiind 0,844 (interval de încredere de 95 la sută, 0,747–0,941; P ¼ 0.001 ), care a fost mult mai bună decât aria de sub curba ROC pentru linia de bază Ln(UAE) ({{20}},75{0; interval de încredere de 95 la sută, 0,626–0,874). Limita care a maximizat indicele Youden a fost 1,24 pentru raportul p-GSK3b/GSK3b și 76 mg/24 h pentru Emiratele Arabe Unite. La aceste limite, sensibilitatea și specificitatea au fost de 69% și 87,1% pentru raportul p-GSK3b/GSK3b și 69% și 77,4% pentru Ln(UAE). Mai mult, combinația dintre raportul p-GSK3b/GSK3b cu nivelul total de GSK3b din celulele exfoliate urinare a îmbunătățit semnificativ puterea de discriminare, aria de sub curba ROC fiind de 0,971 (interval de încredere 95%, 0,931–1).{{48} }). Aceste rezultate sugerează că măsurătorile activității GSK3b în celulele exfoliate urinare pot oferi o acuratețe mult mai bună decât EAU în prezicerea progresiei insuficienței renale la pacienții diabetici.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 h). Celulele exfoliate urinare stocate la momentul inițial au fost extrase și examinate prin analiză imunoblot pentru GSK3b și p-GSK3b (Figura suplimentară S4A și B). Activitatea GSK3b a fost estimată prin rapoartele densitometrice ale p-GSK3b la GSK3b total pentru fiecare probă în raport cu valoarea probelor de control (Figura suplimentară S4C).

Printre diversele variabile clinice/biochimice, activitatea GSK3b (raportul p-GSK3b/GSK3b) în celulele exfoliate urinare inițiale s-a observat a fi semnificativ mai mare la pacienții care au dezvoltat DKD decât la cei care nu au dezvoltat (Tabelul suplimentar S3). Mai mult, analiza curbei ROC sugerează că activitatea relativă a GSK3b (raportul p-GSK3b/GSK3b) în celulele exfoliate urinare a oferit o acuratețe și o putere excelente în prezicerea dezvoltării DKD la pacienții diabetici în stadiu incipient (Figura suplimentară S4D).