Partea 1: Oligozaharida 2/-fucozilactoza din lapte uman induce neuroprotecția împotriva accidentului vascular cerebral hemoragic intracerebral

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2, JongWon Yoon 2 și Seong-Jin Yu1,*

1Centrul de Cercetare Neuropsihiatrică, National Health Research Institutes, Zhunan 35053, Taiwan;

pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);

baee@nhri.edu.tw (E.-KB)

2Advanced Protein Technologies Corporation, Suwon-si 16229, Coreea; yhsong@aptech.biz (DA);

jongwon.yoon91@gmail.com (JY)

Corespondență: b7508@nhri.edu.tw; Tel.: plus 886-37206166 (ext. 36710)

Abstract:

Hemoragia intracerebrală (ICH) apare atunci când vasele de sânge ale creierului se rup, provocând inflamație și moarte celulară. 2-Fucosilactoza (2FL), o oligozaharidă din laptele uman, are efecte antiapoptotice și antiinflamatorii puternice. Scopul acestui studiu a fost de a examina efectul protector al 2FL în modelele celulare și de rozătoare ale ICH. Hemin a fost adăugat la o corticală primară de șobolanneuronaleși cocultura microglia BV2 pentru a simula ICH in vitro. Imunoreactivitățile IBA1 și MAP2 au fost utilizate pentru a determina inflamația șineuronalesupravieţuire. Hemina a crescut semnificativ IBA1, în timp ce a redus imunoreactivitatea MAP2. 2FL a antagonizat semnificativ ambele răspunsuri. Efectul protector al 2FL a fost apoi examinat într-un model ICH de șobolan. Administrarea intracerebrală a colagenazei de tip VII a redus activitatea locomotorie în câmp deschis. Post-tratamentul timpuriu cu 2FL a îmbunătățit semnificativ activitatea locomotorie. Țesuturile cerebrale au fost colectate pentru imunohistochimie și analiză qRT-PCR. 2FL a redus imunoreactivitatea IBA1 și CD4 în striatul lezionat. 2FL a reglat în jos expresia markerilor de stres ER (PERK și CHOP), în timp ce a reglat în creștere markerii macrofagilor M2 (CD206 și TGF) în creierul lezionat. Luate împreună, datele noastre sprijină faptul că 2FL are unneuroprotectorefect împotriva ICH prin inhibareaneuroinflamațieși stresul ER. 2FL poate avea implicații clinice pentru tratamentul ICH.

Cuvinte cheie: 2-fucosilactoză; accident vascular cerebral hemoragic intracerebral; inflamație; reticulul endoplasmatic

efectele extractului de cistanche: tratați neuro-boli

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 2

1. Introducere

Hemoragia intracerebrală (ICH) este o majorăneurologicetulburare asociată cu un risc ridicat de deces la adulți [1,2]. ICH constituie 10-15% din toate cazurile de accident vascular cerebral acut [3]. Câteva studii epidemiologice au susținut diferențele de gen la pacienții cu ICH [4] sau boli cerebrovasculare [5]. O mică parte dintre pacienții cu ICH dezvoltă sindrom lacunar hemoragic [6]. Tratamentul actual pentru ICH se concentrează pe controlul sângerării, eliminarea cheagului de sânge și ameliorarea presiunii intracraniene cauzate de sângerare. Nu există o terapie farmacologică eficientă pentru ICH.

Inflamația joacă un rol critic în ICH indusăneurodegenerare. După apariția ICH, celulele sanguine intră în parenchimul cerebral, activează microglia și inițiază producerea de citokine proinflamatorii [7,8]. Hemin, un produs secundar al hemoglobinei, cauzeazăneuronalemoartea și induce apoptoza și inflamația [9,10]. Mai multe studii au susținut eficacitatea tratamentului antiinflamator la modelele animale de ICH [11,12]. Am demonstrat recent că post-tratamentul timpuriu cu un antagonist CXCR4 CX807 a inhibat inflamația și a îmbunătățit funcția comportamentală la șobolanii ICH experimentali [13]. Aceste date sugerează că terapia antiinflamatoare poate reduce afectarea creierului

după ICH.

Laptele matern uman conține nutriție și câteva ingrediente bioactive critice [14], de exemplu, oligozaharide din laptele uman (HMO) [15]. 2′-Fucosilactoza (2FL) este o oligozaharidă majoră din laptele uman. Livrarea orală a 2FL a fost îmbunătățitămemorieși învățarea la șobolani [16,17]. În plus, 2FL a suprimat expresia CD14 indusă de lipopolizaharide și inflamația în enterocitele umane [18]. Am raportat recent că 2FL a fost atenuatneuroinflamațieîntr-un creier care suferă de un accident vascular cerebral ischemic [19]. Aceste date sugerează că 2FL este un agent antiinflamator puternic și, prin urmare, poate fi util pentru tratamentul ICH.

Scopul acestui studiu a fost de a examina acțiunile protectoare neuronale ale 2FL în modelele celulare și animale ale ICH. Heminul a fost folosit pentru a simula ICH în cultura celulară [20]. Am demonstrat că 2FL a antagonizat activarea microgliei mediată de hemină. Colagenaza de tip VII a fost utilizată pentru a genera ICH focală la șobolanii adulți [13]. Am descoperit că 2FL a atenuat în mod semnificativ activarea microglia indusă de ICH, infiltrarea CD4 plus limfocite și stresul ER în creierul lezionat și a îmbunătățit funcția comportamentală. Datele noastre susțin că 2FL are unneuroprotectorefect împotriva ICH.

efectele extractului de cistanche

2. Rezultate

2.1. Neurodegenerarea mediată de hemină redusă 2FL în neuronii corticali primari și cocultura microgliei BV2

Efectul protector al 2FL a fost examinat mai întâi într-un model celular al unei hemoragii cerebrale. Corticală primarăneuronaleși coculturile de microglia BV2 au fost tratate cu hemină (10 uM) timp de 48 de ore (vezi cronologia în Figura 1E). Hemin s-a atenuatneuronalemarkerul MAP2 (Figura 1A), în timp ce a crescut markerul microglia IBA1 (Figura 1B). Aceste răspunsuri au fost ambele antagonizate de 2FL (1 uM, Figura 1A, B). Imunoreactivitățile MAP2 și IBA1 au fost analizate în continuare prin măsurarea densității pixelilor unor markeri specifici. După cum se vede în Figura 1C, D, hemina a redus semnificativ imunoreactivitatea MAP2 (Map2-ir) și a crescut IBA1-ir (p <0.00 1,="" anova="" unidirecțional,="" n="6" în="" fiecare="" grup).="" aceste="" răspunsuri="" au="" fost="" antagonizate="" în="" mod="" semnificativ="" de="" 2fl="" (map2:="" p="">< 0,001,="" f2,14="115.863;" iba1:="" p="">< 0,001,="" f2,="" 15="134.644," anova="">

F

Figura 1. Theneuroprotectorefectul 2FL într-o corticală primarăneuronși cocultura microglia BV2. (A) Fotomicrografiile reprezentative demonstrează că hemina a redus imunoreactivitatea MAP2 (-ir). Administrarea concomitentă cu 2FL a antagonizat pierderea MAP-ir mediată de hemină. (B) Hemin a crescut IBA1-ir. Coadministrarea cu 2FL a redus IBA1-ir. (C,D) Densitatea pixelilor MAP2-ir sau IBA{{10}}ir a fost analizată utilizând software-ul NIS Elements AR 5.11. (C) 2FL a antagonizat semnificativ pierderea MAP2-ir mediată de hemină. (D) 2FL a atenuat semnificativ activitatea IBA1 indusă de hemină. (E) Cronologia experimentului. * p < 0,05.="" bară="" de="" scară="100">

beneficiul extractului de cistanche

2.2. Post-tratament cu activitate locomotorie îmbunătățită 2FL la șobolanii ICH

Efectul protector al 2FL a fost apoi examinat într-un model animal de ICH. Un total de 14 șobolani masculi adulți au primit stereotactic o doză mică (0,5 unități/uL × 1 uL) de colagenază de tip VII pentru a induce hemoragie cerebrală în striatul drept. 2FL (400 mg/kg/zi, ip, n=7) sau vehicul (soluție salină, ip, n=7) ​​a fost administrat zilnic timp de 5 zile, începând cu 1 zi după accident vascular cerebral (vă rugăm să consultați cronologia din Figura 2G). Apoi, la 2 ore după ultima injecție cu 2FL sau vehicul în ziua 5, animalele au fost plasate individual în camere de activitate în infraroșu timp de 30 de minute. Comportamentul locomotor în câmp deschis a fost examinat timp de 30 de minute. Am descoperit că 2FL a crescut semnificativ activitatea verticală (VACTV, Figura 2A), distanța totală parcursă (TOTDIST, Figura 2B), timpul vertical (VTIME, Figura 2C), activitatea orizontală (HACTV, Figura 2D), timpul de mișcare (MOVTME, Figura 2E). ), și numărul mișcării (MOVNO, Figura 2F). Statisticile detaliate (ANOVA în două sensuri plus teste post-hoc Newman-Keuls (NK)) sunt enumerate în Tabelul 1.

Figura 2. Post-tratamentul cu 2FL îmbunătățește funcțiile neuronale la șobolanii ICH. Șobolanii adulți au fost tratați cu colagenază de tip VII pe D0 (G, cronologie). 2FL sau vehiculul a fost administrat sistemic zilnic timp de 5 zile. Comportamentul locomotor a fost examinat pe D5. 2FL a îmbunătățit semnificativ (A) activitatea verticală, (B) distanța totală parcursă, (C) timpul vertical, (D) activitatea orizontală, (E) timpul de mișcare și (F) mișcarea

număr. n {{0}} în fiecare grup. * p < 0.05,="" anova="" în="" două="" sensuri;="" #="" p="">< 0,05,="" test="" nk="">

Tabelul 1. Diferențe semnificative în comportamentele locomotorii între ICH plus veh și ICH plus 2FL.

2.3. Post-tratament precoce cu activare microglială redusă 2FL în regiunea peri-lezionată

Opt șobolani ICH (2FL, n=4; Veh, n=4) au fost eutanasiați și perfuzați pentru imunohistochimia IBA1 după testul comportamental din ziua 5. IBA1-ir tipic este demonstrat în Figura 3 IBA1-ir a fost îmbunătățită în zona peri-lezionată din striat (Figura 3B), în comparație cu situsurile corespunzătoare din striatul nelezionat contralateral (Figura 3A) la șobolanii cu accident vascular cerebral care au primit veh. La o mărire ridicată, celulele microgliale deramificate sau ameboide au fost găsite în zona lezionată (Figura 3B, insert), în timp ce microglia în repaus care prezintă o morfologie ramificată au fost găsite în striatul nelezionat (Figura 3A, insert). Tratamentul 2FL a redus IBA1-ir și a restabilit parțial ramificația morfologică a microgliei (Figura 3C, insert). IBA1-ir a fost cuantificat și mediat în trei secțiuni consecutive ale creierului cu o comisură anterioară vizualizată la toate animalele. 2FL a redus semnificativ IBA1-sau în creierul ICH (Figura 3D, p <0.001, f2,12="50.357," anova="">

Figura 3. 2FL post-tratament timpuriu a redus activarea microglială în striatul lezionat. Animalele au primit vehicul sau 2FL după injectarea de colagenază din zilele 1 până la 5. Animalele au fost sacrificate în ziua 5. S-a găsit imunoreactivitate IBA1 îmbunătățită cu morfologie deramificată în striatul lezionat (B vs. A). Tratamentul cu 2FL a redus imunoreactivitatea IBA (C vs. B). (D) 2FL a redus semnificativ imunoreactivitatea IBA1 în creierul lezionat. * p < 0.05,="" anova="" unidirecțional="" plus="" testul="">

2.4. 2FL CD4 atenuat plus infiltrarea limfocitelor în creierul lezionat

Administrarea de colagenază a crescut CD4 plus infiltrarea limfocitelor în striatul lezionat (Figura 4B). Aproape nu au fost găsite celule CD4 în striatul nelezionat (Figura 4A). Infiltrarea celulelor CD4 în striatul lezionat a fost atenuată prin tratamentul 2FL (Figura 4C vs. Figura 4B; p <0.001, f2,6="173.485," anova="" unidirecțional,="" figura="">

Figura 4. Post-tratamentul cu 2FL a redus CD4 plus infiltrarea limfocitelor în creierul lezionat. Fotomicrografiile reprezentative demonstrează imunoreactivitatea CD4 în (A) striatul nelezionat și (B) striatul lezionat de la un vehicul care primește șobolan la mărire scăzută (calibrare=50 um) și înaltă (inserție, calibrare=10 um), precum și (C) striatul lezionat de la un șobolan care a primit 2FL. (D) 2FL a redus semnificativ CD{{10}}ir în creierul lezionat (* p < 0,001,="">

mod ANOVA).

2.5. 2FL a modificat diferențial expresia markerilor inflamatori M1 și M2 în creierul ICH

Țesuturile striate au fost colectate de la opt șobolani (veh, n {{0}}; 2FL, n=4) în ziua 5. Expresia markerilor inflamatori M1/M2 a fost examinată prin qRT-PCR. ICH a crescut semnificativ expresia markerului M1 CD86 (Figura 5A, p=0.005) și a markerilor M2 CD206 și TGF (Figura 5B, C, p {= 0.005). 2FL nu a modificat expresia CD86 (Figura 5A, p=0.356, ANOVA bidirecțional). Cu toate acestea, a reglat în mod semnificativ expresia CD206 (Figura 5B) și TGF în partea lezionată (p <0,05, test="">

beneficiul extractului de cistanche

2.6. 2FL a modificat expresia stresului ER și a markerilor apoptotici în creierul ICH

Expresia stresului ER și a markerilor apoptotici a fost examinată la opt șobolani (veh, n=4; 2FL, n=4). 2FL a redus semnificativ expresia PERK (Figura 6A, p=0.016), IRE1 (Figura 6B, p=0.018), CHOP (Figura 6C, p=0.032) și SigmaR1 (Figura 6D, p=0.017) în striatul lezionat. 2FL nu a modificat expresia BIP (Figura 6E, p=0.841) și ATF6 (Figura 6F, p=0.403). În plus, expresia caspazei 3 a fost redusă semnificativ de 2FL (Figura 6G, p=0.029, t-test).

Figura 5. 2FL a suprareglat expresia markerilor M2 în creierul ICH. ICH a crescut semnificativ expresia (A) markerului M1 CD86 și a markerilor M2 (B) CD206 și (C) TGF (# p=0.005, bidirecțional ANOVA). (A) 2FL a reglat în mod semnificativ expresia (B) CD206 și (C) TGF, dar nu (A) CD86, în striatul lezionat (* p < 0,05,="" testul="">

Figura 6. 2FL a suprimat expresia stresului ER și a markerilor apoptotici. Expresia (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 și (G) caspaze3 a fost inhibată semnificativ de 2FL în creierul hemoragic. Expresia (E) BIP și (F) ATF6 nu a fost modificată de 2FL. * p < 0.05.="" er,="" reticul="" endoplasmatic;="" perk,="" protein="" kinaza="" r-like="" er="" kinaza;="" ire1,="" enzima="" 1="" care="" necesită="" inozitol;="" chop,="" proteină="" omoloagă="" a="" proteinei="" de="" legare="" a="" intensificatorului="" ccaat;="" sigmar1,="" receptor="" sigma="" 1;="" atf6,="" care="" activează="" factorul="" de="" transcripție="">

supliment cistanche