Partea 2 Echinacozidul crește cantitatea de spermatozoizi la șobolani prin țintirea receptorilor de androgeni hipotalamici
Mar 10, 2022
Pentru mai multe informații, vă rugăm contactați:Joanna.jia@wecistanche.com
Discuţie
Înregistrările etnofarmacologice și studiul nostru anterior13 au confirmat acest lucruCistanche tubulosaextractele au crescut eficient nivelul hormonilor sexuali și au îmbunătățit calitatea spermei.ECHca unul dintre compușii principali înCistanche tubulosa19,20, poate crește numărul de spermatozoizi și crește secreția de LH și T (Fig. 1). În acest studiu, am demonstrat căECHa fost distribuit la hipotalamus în locul testiculelor sugerând un efect indirect al ECH asupra testiculelor. Într-adevăr, ECH a inhibat direct activitatea AR hipotalamică, translocarea AR în nucleu și expresia genelor legate de axa HPG și, de asemenea, a oferit protecție împotriva daunelor reproductive induse de BPA.
În studiile privind producția de gonadotrofine umane, nivelurile hormonilor sexuali sunt strâns reglementate de axa HPG și de o buclă de feedback negativ21. Și anume, secreția de T este crescută semnificativ ca răspuns la creșterile constante și susținute ale nivelurilor de LH din sânge, ca răspuns la o lipsă de feedback androgenic negativ la nivelul hipofizarului și hipotalamusului. In acest studiu,ECHa crescut secreția de LH în encefal plus hipofizar și producția de testosteron în testicul și nivelurile de ARNm ale LHR și Gnrhr în encefal plus hipofizar (Fig. 1 și Fig. 4), sugerând căECHpoate afecta feedback-ul negativ al axei HPG. Nu este surprinzător, AR în sine joacă un rol important în reglarea feedback-ului nivelurilor T și LH22,23. Paradigma masculină a axei HPG este centrată pe testosteron care oferă reprimare a feedback-ului negativ atât la nivelul hipotalamusului, cât și al glandei pituitare24,25. Studiile anterioare au folosit Foxg1-Cre pentru a elimina genele de interes în hipofiza, dar nu și în hipotalamus pentru a determina importanța relativă a celor două regiuni. Rezultatele au demonstrat că semnalizarea AR în hipofizarul șoarecelui mascul este dispensabilă în ceea ce privește reglarea dependentă de testosteron a secreției de LH26. Din acest motiv, am ales să ne concentrăm pe AR hipotalamic pentru studii suplimentare.
Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe
Ca receptor de hormoni nucleari steroizi, activitatea AR este reglată de ligand steroidian T, a cărui legare inițiază translocarea nucleară și funcția de reglare transcripțională a AR27. În acest studiu, am arătat căECHtratamentul a inhibat translocarea AR din citoplasmă în nucleele din hipotalamus (Fig. 3). Mai mult, studiul PK a arătat căECHpoate pătrunde semnificativ mai degrabă în hipotalamus decât în testicule, ceea ce sugerează că mai mult ECH traversează bariera hematoencefalică, posibil prin endocitoză, mai degrabă decât bariera testiculară. În plus, am demonstrat prin ELISA indirect capacitatea de combinare a ECH și AR sugerând că ECH se poate lega direct de AR. Acest lucru a fost susținut și de rezultatele testului de andocare a moleculelor care au indicat că există locuri presupuse de legare pentru ECH la Met-894 și Val-713 în buzunarul AR (Fig. 5D). Acest lucru susține constatările altora că AR participă la reglarea unei bucle de alimentare negative și că o reducere a interacțiunilor AR-T în creier are ca rezultat creșterea secreției de LH23,28,29.
Steroidogeneza este un proces strâns controlat, esențial pentru dezvoltarea spermatogenezei, cu implicarea proteinei steroidogene (StAR)30 și a enzimelor steroidogene precum CYP11A1, CYP17A1, 3 -hidroxisteroid dehidrogenaza (HSD3) și 17 -hidroxisteroid. dehidrogenaza (HSD17) care transformă colesterolul în testosteron31. Am arătat că nivelurile de ARNm ale genelor care codifică aceste enzime au crescut semnificativ cuECHtratament, în timp ce expresia ARNm StAR nu sa schimbat. Acest lucru sugerează căECHnu a avut nici un efect asupra transferului de colesterol în membrana interioară a mitocondriilor, în timp ce poate juca un rol în promovarea conversiei colesterolului în testosteron. Atunci se poate trage concluzia căECHtratamentul crește semnificativ numărul de spermatozoizi prin creșterea sintezei și secreției de testosteron.
Pentru a investiga efectul protector alECHîn cazul leziunilor spermei, bisfenolul A (BPA), un perturbator endocrin exogen tipic, a fost folosit ca model de afectare a reproducerii masculine la șoareci32.ECHtratamentul a recuperat efectiv numărul de spermatozoizi, motilitatea spermatozoizilor, nivelurile de T și LH diminuate de BPA (Fig. 6A, B), sugerând că ECH poate atenua leziunile spermatozoizilor.
În comparație cu substanțele chimice sintetizate artificial pentru terapia de substituție hormonală,ECHeste un compus natural non-hormonal care afectează feedback-ul negativ pe axa HPG, crescând astfel secreția de LH, T și calitatea spermei. Această cale mecanicistă poate proteja sistemul reproducător masculin și, prin urmareECHpoate fi considerat ca un potențial agent natural de protecție a reproducerii. Cu toate acestea, reglementările hormonale sunt complexe și adesea duc la efecte sistemice. După cum se indică în Fig. 7, ECH a crescut secrețiile de T și LH și a inhibat activarea AR, ceea ce poate duce, de asemenea, la consecințe asupra altor căi de sănătate sau asociate bolii, cum ar fi osteoporoza33 și depresia la bărbați34, prin urmare, efectele cuprinzătoare ale ECH ar trebui să fie mai departe. investigat.
Luate împreună, rezultatele noastre indică acest lucruECHse leagă de AR din hipotalamus și inhibă transferul AR din citoplasmă la nucleu. Datele noastre sugerează că ECH se leagă de site-urile din buzunarul AR la aminoacizii Met-894 și Val-713. Acest lucru poate explica creșterea nivelurilor de T și AR ca răspuns sistemic la echilibrarea nivelurilor hormonale prin promovarea secreției de LH și o creștere ulterioară a producției de T și a numărului de spermatozoizi (Fig. 8).
Metode
Declarație de etică.
Acest studiu a fost realizat cu respectarea strictă a Ghidurilor pentru animale experimentale stabilite de Ministerul Științei și Tehnologiei (Beijing, China). Toate protocoalele experimentale au fost revizuite și aprobate de Comitetul de etică al Institutului de Tehnologie Anyang.
Animale experimentale.
Șoarecii Kunming în consangvinizare în vârstă de patru săptămâni (22 g-25 g) au fost obținuți de la centrul de animale al celei de-a patra universități medicale militare (Xi'an, China). Animalele au fost ținute în condiții controlate la o temperatură de 22 de grade ± 2 grade, 70 la sută ± 4 la sută umiditate cu ciclu de 12 ore lumină-întuneric și acces liber la hrană și apă.
Tratamentul experimental.
Experimentul 1. Șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în șase grupuri, șapte șoareci în fiecare grup (n=7).ECH(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, China) a fost administrat folosind un tub intragastric și s-a administrat propionat de testosteron (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, China) prin injecție intramusculară o dată pe zi, timp de 14 zile, conform următorului design experimental: Grupul de control: soluție salină normală (10mL/kg), grupul ECH(L) (5mg/kg), grupul ECH(M) (20mg/kg),ECH(H) grup (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) și enzalutamidă (inhibitor AR, o dată pe zi la două zile, timp de 14 zile; 20 mg/kg; CAS: 915087-33-1; Aladdin, Shanghai, China).
După 2 săptămâni de tratamente, șoarecii au fost anesteziați cu dietil eter pentru a colecta probe de sânge pentru analize ale nivelurilor hormonale. Soarecii au fost apoi disecati pentru a separa hipotalamusul, encefalul plus hipofiza, testiculul si cauda epididimului. Probele de cauda epididymis au fost puse în soluție salină normală cu 5% BSA pentru evaluarea calității spermei, iar hipotalamusul, encefalul plus pituitara și testiculele au fost congelate în azot lichid și depozitate la -80 de grade pentru investigații ulterioare.
Experimentul 2. Șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în 10 grupuri, cinci animale per grup.ECH(20mg/kg) a fost administrat oral și șoarecii din fiecare grup au fost anesteziați cu dietil eter la momentele de timp 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h, și 12 ore după administrare pentru recoltarea probei. Plasma a fost colectată și inima a fost expusă. Perfuzia de soluție salină normală în ventriculii stângi a fost condusă de un aparat de perfuzie până când ficatul și plămânii au fost albite. Au fost colectate zece hipotalame și testicule pentru a determina concentrațiile tisulare de ECH.
Experimentul 3. Șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în 4 grupuri, șapte în fiecare grup.ECHși BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, China) au fost administrate folosind un tub intragastric o dată pe zi, timp de 6 săptămâni, conform următorului design experimental: grup normal (ulei de porumb, 10 ml/kg, bw/zi) , grup model: grup BPA (BPA 200 mg/kg, bw/d, ulei de porumb) și grup experimental: grup BPA plus ECH (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg). După 42 de zile de tratament, șoarecii au fost anesteziați cu dietil eter și probele de sânge au fost colectate pentru analize ale nivelului hormonal. Testiculul și cauda epididimul au fost separate și colectate. Epididimul cauda a fost folosit pentru evaluarea calității spermei, iar testiculul a fost congelat în azot lichid și depozitat la -80 de grade pentru investigații ulterioare.
Determinarea calității spermei. Prepararea suspensiei de spermatozoizi. Epididimidele Cauda au fost tocate în 5 ml de soluție salină normală cu 5% BSA și incubate timp de 5 minute la 37 de grade pentru a permite conținutului lor să se răspândească în mediu. Numărul de spermatozoizi: Conform metodei descrise de Yokoi (2003), suspensia de spermă diluată (1:10; v/v; suspensie de spermă/10 procente metanol) a fost transferată în fiecare cameră de numărare a unui hemocitometru și a fost lăsată să stea timp de 5 minute. și apoi numărat la un microscop cu lumină (Nikon, Instruments Inc., Japonia) la mărire X200. Viabilitatea spermei: Un total de 20μL de suspensie de spermă a fost amestecat cu un volum egal de colorant de eozină-nigrosin timp de 2 minute; spermatozoizii necolorați au fost numărați la un microscop cu lumină la o mărire de 200x. Motilitatea spermatozoizilor: Un total de 10μL de suspensie de spermă au fost puse pe o lamă de sticlă și au fost înregistrate ca fiind mobile sau imobili la microscop cu lumină la o mărire de 200x.
Determinarea nivelului hormonal. Nivelurile de testosteron (T) și LH au fost cuantificate în ser, encefal plus pituitar și omogenate testiculare folosind kituri de radioimunotest (RIA) (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Beijing, China). Pe scurt, anticorpul anti-testosteron sau anti-LH IgG (100 μL) și anticorpul anti-șoarece conjugat cu 125-I s-au adăugat la probe sau standardul (100 μL) și s-au amestecat pe un rocker peste noapte la 4 grade. După spălare de trei ori cu PBS-Tween 20 (500 μL), amestecurile au fost centrifugate (3500 rpm/min) la 4 grade timp de 15 minute. Valorile CPM ale precipitatelor au fost evaluate cu un instrument de radioimunotest (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Beijing, China) și concentrațiile de T și LH au fost calculate conform formulei unui standard curba. Coeficientul de variație Te T și LH este de 2,8% și 3,2% în grupurile de eșantion și, respectiv, 2,1% și 2,8% în grupurile standard.
Determinarea expresiilor genelor prin PCR cantitativă în timp real. ARN-ul total a fost izolat din țesuturile testiculare și encefal înghețate plus hipofizar folosind un kit ARN ARN total simplu (Tiangen, Beijing, China). PCR cantitativă în timp real (q RT-PCR) a fost efectuată pentru aplicarea ADNc utilizând 2xSYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, China). Procedura PCR a constat din 95 de grade timp de 30 de secunde urmate de 35 de cicluri de 95 de grade timp de 15 secunde, 58 de grade timp de 30 de secunde și 72 de grade timp de 30 de secunde. Analiza curbei de topire a fost efectuată pe produsele PCR pentru a verifica specificitatea primerului și puritatea produsului. S-a efectuat o curbă de disociere pentru fiecare placă pentru a confirma producția unui singur produs. A fost calculată abundența relativă a fiecărui ARNm. Primerii PCR utilizați pentru studiu sunt prezentați în Tabelul 2.
Western blot. Pentru analiza expresiei AR, extracția și izolarea proteinei citoplasmatice și nucleare au fost efectuate folosind un kit de extracție a proteinelor citoplasmatice și nucleare (Beyotime, Nanjing, China) conform instrucțiunilor producătorului. Concentrațiile de proteine citoplasmatice și nucleare au fost evaluate folosind un kit de testare a proteinelor Bradford (Beyotime, Jiangsu, China). Probele de proteine (80 ug) au fost rulate pe un gel SDS-PAGE 12% și 5% și transferate pe membrane PVDF. După blocare, membranele au fost incubate cu anticorpi anti-AR IgG (1:1,000; Bioss; Beijing China) și anticorpi policlonali anti-GAPDH de șoarece (1:1,{000; Wuhan Boster). Biologic
Technology, Wuhan, China) sau anticorpi policlonali de șoarece anti-Lamin b1 timp de 2 ore. Membrana a fost spălată de trei ori cu TBST și incubată cu un anticorp IgG anti-șoarece de iepure conjugat cu HRP (1:5,000; Bioss; Beijing China). Semnalul a fost vizualizat folosind ChemiDoc Imaging System (Tanon-3,500, Shanghai, China).
Test de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).
Sângele a fost colectat în tuburi de sticlă heparinizată. Plasma a fost separată prin centrifugare imediată la 6,000 rpm timp de 10 min și depozitată la -20 de grade pentru experimente suplimentare. Probele de hipotalamus și testicul din fiecare punct de timp au fost reunite și omogenizate cu metanol. După centrifugare la 10,000rpm la 4 grade timp de 10 min, supernatantul a fost concentrat cu N2 și reziduul a fost dizolvat în 50μL de metanol și filtrat printr-un filtru de 0,45 μm. Zece μL din proba de lichid filtrat au fost injectați în sistemul HPLC pentru analiză. Curba standard a constat din probe care conțineau 50, 100, 250, 500 și 750 ng/mL de ECH (Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, China). Probele de control al calității plasmatice cu 75 ng/mL (scăzut), 150 ng/mL (medie) și 300 ng/mL (mare) de ECH au fost pregătite în consecință pentru a măsura acuratețea și precizia metodei.
Cromatografia a fost efectuată cu un sistem HPLC (D2{{10}}00 Elite series, Hitachi, Japan) cuplat la un detector UV (L{-2400, Hitachi, Japonia). Separarea a fost efectuată pe o coloană Termo-C18 (250 mm × 4,6 mm id, particule de 4,6 μm) menținută la 25 de grade. Faza mobilă a fost un gradient preparat din acid fosforic 0,1 procente conţinând 0,04 procente trimetilamină (componenta A) şi metanol (componenta B). Gradientul liniar a fost următorul: 70–90 la sută A peste 0-2 min, 60–70 la sută A peste 2–6 minute, 55–60 la sută B peste 6–8 minute și apoi a revenit la 90 la sută A la 8 min imediat. Debitul a fost de 0,8 ml/min. Detectorul UV a fost operat la 332 nm. Zona de vârf a fost evaluată ca măsură analitică.
Studii farmacocinetice la șoareci. Pătrunderea ECH în hipotalamus și testicul a fost supusă analizei farmacocinetice cu software-ul Drug and Statistics (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee din China). Parametrii farmacocinetici au fost determinați folosind metoda necompartimentală bazată pe teoria momentului statistic. Parametrii farmacocinetici preliminari, inclusiv timpul până la constanta de vârf (Tmax), concentrația de vârf (Cmax), constanta vitezei de eliminare (Ke), timpul de înjumătățire prin eliminare (T0,5), aria de sub curbă (AUC{ {4}}–12), volumul de distribuție aparent (Vc) și clearance-ul (CL) au fost obținute pentru analize ulterioare. Raporturile creier/plasmă au fost calculate pe baza valorilor AUC0-t pentru plasmă și creier.
Sinteza și identificarea ECH-Ovalbuminei (ECH-OVA). Un total de 9,8 mg de ECH și 1,0 mg de anhidridă de butandiol au fost dizolvate în 2 ml de piridină, amestecate timp de 12 ore cu agitare la temperatura camerei. Amestecul a fost concentrat cu N2 şi reziduul a fost combinat cu 10,8 mg de N-hidroxisuccinimidă (NHS) şi 19,3 mg de diciclohexilcarbodiimidă (DCC) şi dizolvat în 4 mLN, N-dimetilformamidă (DMF) timp de 12 ore cu agitare la temperatura camerei. După centrifugare la 2,000 g timp de 5 minute la 4 grade, supernatantul a fost adăugat la 5 ml de PBS în care s-au dizolvat 14,4 mg de ovalbumină (OVA). Noul amestec a fost agitat timp de 24 de ore la 4 grade. Soluția de reacție a fost apoi dializată împotriva PBS timp de trei zile. Prezența ECH-OVA a fost confirmată prin spectre UV (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) la o lungime de undă cuprinsă între 190 și 400 nm, precum și prin denaturarea PAGE.
ELISA indirectă (iELISA). O placă de microtitrare a fost acoperită cu ECH-OVA (2 ug/100 μL) și incubată peste noapte la 4 grade. Placa a fost spălată de trei ori cu PBST și de două ori cu PBS și s-a adăugat 5% PBSM (PBS care conține 5% lapte degresat) pentru a bloca locurile nelegate la 37 de grade timp de 2 ore. După ce plăcile au fost spălate cu PBST și PBS, godeurile au fost împărțite în 4 grupuri; grup experimental, 1 ug AR proteină totală/100μL; grup pozitiv, anticorp anti-OVA de iepure (1:1,000); grup negativ, 1 ug albumină serică bovină; şi un grup martor care conţine PBS. După incubare timp de 1,5 ore, plăcile au fost spălate și s-au adăugat 100 μL/godeu de IgG conjugată cu HRP de iepure (1:1,000) la grupul pozitiv, s-au adăugat 100 μL/godeu de anti-AR ( 1:1,000) celorlalte grupuri. După incubare timp de 1,5 ore, pe plăci a fost adăugată diluție de IgG conjugată cu HRP de iepure (1:5,000). După incubare la 37 de grade timp de 1 oră, plăcile au fost spălate de trei ori cu PBST și de două ori cu PBS. S-a adăugat apoi TMB şi s-a incubat timp de 10 minute la întuneric la temperatura camerei şi s-a adăugat H2S04 2M pentru a opri reacţia. Absorbanța a fost citită la o lungime de undă de 450 nm.
Andocare moleculară. A fost efectuat un studiu de andocare moleculară pentru a investiga modul de legare a compusului ECH la receptorul de androgen uman (AR) folosind Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Structura tridimensională (3D) a AR (PDB ID: 2YHD) a fost descărcată de la Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). Structura 3D a ECH a fost obținută de software-ul ChemBioDraw Ultra 14.0 și ChemBio 3D Ultra 14.0. Pachetul AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) a fost folosit pentru a genera fișierele de intrare de andocare. Grila de căutare a AR a fost identificată ca centru x: 36,141, centru y: 8,513 și centru z: 21,304 cu dimensiuni dimensiune x: 15, dimensiune y: 15 și dimensiune z: 15. Valoarea exhaustivității a fost setată la 20. Pentru Vina andocare, parametrii impliciti au fost utilizați dacă nu a fost menționat. Poza cu cel mai bun punctaj, după cum este judecată de scorul de andocare Vina, a fost aleasă și analizată vizual folosind software-ul PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org). Analiza datelor si metode statistice.
Analiza datelor si metode statistice. Datele au fost analizate folosind software-ul statistic SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). A fost utilizată o ANOVA unidirecțională pentru comparație între grupuri. Au fost determinate testele de comparație ale lui Tukey ale diferențelor semnificative între grupuri. Rezultatele au fost exprimate ca medie ± abatere standard (SD) folosind software-ul Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Sofware, Inc, California, SUA).
Aprobarea etică și acordul de participare. Aprobarea etică pentru acest studiu a fost obținută de la Comitetul de etică al Institutului de Tehnologie Anyang
