Partea 2: echinacozidul induce moartea celulelor canceroase apoptotice prin inhibarea enzimei de dezinfectare a bazinului de nucleotide MTh1

echinacozidul induce moartea celulelor canceroase apoptotice prin inhibarea enzimei de dezinfectare a bazinului de nucleotide MTh1

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche echinacozidareanti-cancerșianti-apoptoticefecte

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 3

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 1

Rezultate

Identificarea echinacozidei ca inhibitor MTh 1

Pentru a căuta compuși naturali capabili să inhibe MTH1, am folosit reacția enzimatică catalizată de MTH1-ca un randament ridicat în testul de screening vitro. Pe lângă nucleotidele purinice oxidate, MTH1 poate hidroliza și trifosfatul de deoxiguanozină normal pentru a genera monofosfat și pirofosfat de deoxiguanozină. În prezența excesului de pirofosfatază anorganică, toți pirofosfații sunt transformați în fosfați anorganici, care pot fi cuantificați folosind un test de absorbție pe bază de verde de malachit,41 permițând astfel măsurarea indirectă a activității MTH1.32 Pentru a testa sistemul de analiză, am măsurat mai întâi efectul (S)-crizotinib, un compus cu potență dovedită ca inhibitor MTH1.33 Rezultatul a arătat că (S)-crizotinib a inhibat într-adevăr puternic MTH1 (Figura 1A) cu un IC50 de 500 nM, care a fost de șapte ori mai mare decât cel raportat de Huber et al (72 nM).33 Acest lucru sa datorat probabil diferențelor dintre metodele de detectare sau sursele de substanțe chimice și enzime. Am adoptat o abordare cromogenică mai puțin sensibilă, în timp ce Huber și colab. au folosit o metodă bioluminiscentă foarte sensibilă.33 Ținând cont de acest lucru, am analizat 12 compuși naturali disponibili comercial (Tabelul S1), fiecare dintre care este un ingredient major al plantelor tradiționale cu potențial antitumoral. activitate.Echinacozidul, un compus purificat din planta medicinală parazită Cistanche salsa (Figura 1C), a inhibat semnificativ reacția (Figura 1B), cu un IC50 de 7,01±2,13 μM (Figura 1D). Adăugarea de 50 de ori mai multă pirofosfatază nu a avut niciun impact asupra rezultatului, în timp ce adăugarea de cinci ori mai multă proteină MTH1 a scăzut semnificativ gradul de inhibiție, sugerând căEchinacozidula inhibat în mod specific activitatea MTH1 în testul enzimatic in vitro.

Echinacozidul a inhibat MTh 1 celular pentru a crește 8-oxog intracelular

Apoi, am întrebat dacăEchinacozidulpoate inhiba activitatea intracelulară MTH1. Inhibarea MTH1 celulară va duce la creșterea 8-oxoG intracelular. S-a demonstrat că avidina se leagă de 8-oxoG cu specificitate ridicată;42, prin urmare, am folosit colorarea imunofluorescentă cu avidină conjugată cu Cy{3-pentru a compara nivelurile intracelulare de 8-oxoG din diferite linii de celule canceroase înainte și dupăEchinacozidultratament. Osteosarcomul uman MG{{{0}}, hepatocarcinomul SK-HEP{-1, cancerul de sân MCF{-7 și celulele cancerului colorectal SW480 au fost tratate cu 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM sau 80 μM Echinacoside timp de 5 ore, 12 ore sau 24 de ore. Colorarea cu Cy3-avidină conjugată a arătat că tratamentul cu 60 μM de echinacozidă timp de 24 de ore a crescut clar și semnificativ nivelul de 8-oxoG (substanță reactivă cu Cy{3-avidină) în aceste celule canceroase ( Figura 2A și B). Concentrație mai mare (80 μM) deEchinacozidula dus la o colorare celulară 8-oxoG mai puternică (Figura 2B), sugerând o relație doză-răspuns. S-au obţinut rezultate similare

prin colorare imunofluorescentă cu un anticorp monoclonal anti-8-oxoG de șoarece (Figura S1A).43 Concentrația deEchinacozidul(60 μM) necesar pentru o creștere semnificativă a 8-oxoG celular a fost mult mai mare decât IC50 (7,01 μM) din testul in vitro. Acest lucru sa datorat probabil diferenței de sensibilitate a celor două teste. Colorarea imunofluorescentă este mult mai puțin sensibilă decât testul enzimatic in vitro; în plus, numărul de molecule inhibitoare care pot ajunge și interacționa cu MTH1 celular este influențat de procese biologice complexe; în plus, în testul in vitro, dGTP mai puțin favorit este utilizat ca substrat și, prin urmare, poate fi mai ușor (luați mai puțini inhibitori) să inhibați MTH1, rezultând o IC50 mai mică în testul in vitro.

Theanticancerșiantioxidantefecte aleechinacoziddinCistanchedeserticola

8-oxoG celular este generat de ROS, care este antagonizat de antioxidanți. Astfel, o creștere a ROS celulare sau suprimarea activității antioxidanților ar duce, de asemenea, la o creștere a nivelului de 8-oxoG celular.Echinacozidulîn sine este un antioxidant puternic44,45 și, prin urmare, ar trebui să sporească mai degrabă decât să suprima activitatea antioxidanților. Pentru a examina dacă nivelul ROS celular a fost modificat deEchinacozidultratament, aceleași celule canceroase au fost tratate cu 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM sau 80 μM Echinacoside timp de 5 ore, 12 ore sau 24 de ore și apoi analizate prin citometrie în flux după colorarea cu fluorescent sonda 2′,7′-diacetat de diclorofluoresceină. Rezultatele au arătat că niciunul dintre aceste tratamente nu a schimbat nivelurile celulare de ROS (Figura 2C și D). Astfel, nivelul crescut de 8-oxoG celular a rezultat cel mai probabil din inhibarea MTH1 de către Echinacoside.

echinacozida provocat leziuni extinse ADN-ului, în special în celulele canceroase. Încorporarea 8-oxoG în ADN va stimula BER și MMR, care generează rupturi și goluri ADN monocatenar (SSB).16,17 În mod normal, aceste rupturi și goluri sunt sigilate de mecanisme de reparare care implică umplerea golurilor și ligarea de către ADN polimeraze și ligaze.46,47 Cu toate acestea, creșterile rapide ale SSB celular pot satura capacitatea de reparare celulară, ducând la formarea a numeroase ruperi de ADN dublu catenar (DSB)18 și semnalizare DDR. Pentru a examina dacăEchinacozidul-creșterea indusă a 8-oxoG celular a cauzat daune ADN-ului, am examinat unul dintre markerii timpurii ai deteriorării ADN-ului, 53BP1, care se leagă de situsurile DSB ca cel mai timpuriu răspuns celular la DSB.48 MG-63, Liniile de celule canceroase SK-HEP-1, MCF-7 și SW480 și liniile de celule noncanceroase ficat uman normal L-O2,49 rinichi embrionar uman HEK 293 și fibroblast de șoarece NIH/ 3T3 au fost tratați cu 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM sau 80 μM Echinacoside timp de 5 ore, 12 ore sau 24 de ore. Imunocolorarea fluorescentă a arătat că tratamentul cu 60 μM Echinacoside timp de 24 de ore a crescut în mod specific numărul de celule cu cinci sau mai multe focare nucleare 53BP1 puternic colorate în toate tipurile de cancer, dar nu în niciuna dintre liniile celulare noncanceroase (Figura 2E și F). O creștere semnificativă a numărului de celule 53BP1 plus a fost observată încă de la 5 ore după inițierea tratamentului cu Echinacozid (Figura 2F). O concentrație mai mare (80 μM) de echinacozidă sau un timp mai lung de tratament (12 ore și 24 de ore) a dus la creșteri mai mari atât a numărului de celule 53BP1 plus (Figura 2F), cât și a numărului de focare celulare 53BP1. Împreună, aceste rezultate sugerează că inhibarea MTH1 de către Echinacoside a cauzat acumularea de 8-oxoG și leziuni extinse ale ADN-ului în cancer, dar nu și în celulele noncanceroase.

echinacozidul a suprimat proliferarea celulelor canceroase

În celulele ciclabile, rupturile nereparate ale catenei de ADN vor cauza colapsul furcilor de replicare a ADN-ului, care va duce apoi la blocarea proliferării celulare prin inducerea opririi ciclului celular și a apoptozei.50 Pentru a verifica efecteleEchinacozidulprivind creșterea și proliferarea celulelor, am analizat mai întâi creșterea celulelor canceroase MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 și SW480 tratate cu echinacozidă printr-un test de formare a coloniilor. Rezultatele au arătat că celulele canceroase tratate cu 60 μM sau 80 μMEchinacozidulau format mult mai puține colonii, iar coloniile care s-au format au fost mult mai mici (Figura 3A și B), indicând un potențial de creștere foarte suprimat. Apoi, am analizat proliferarea acestor celule canceroase, împreună cu celulele noncanceroase L-O2, HEK 293 și NIH/3T3 printr-un test MTT. Rezultatele au arătat că echinacozidul a inhibat în mod dependent de doză proliferarea cancerului, dar nu și a celulelor noncanceroase (Figura 3C). Studiul în timp al celulelor canceroase tratate cu 60 μM echinacozid a arătat că, după 5 ore, nu a existat nicio diferență semnificativă între grupurile netratate și cele de tratament, dar după 12 ore, proliferarea celulelor canceroase a fost inhibată semnificativ cu 60 μM.Echinacozidul(Figura 3D).

etapele ciclului celular prin citometrie în flux a relevat faptul căEchinacozidultratamentul a redus în funcție de doză procentul de celule în ambele faze S și G2/M, în timp ce procentul de celule în faza G1 a crescut (Figura 4C și D). După tratamentul cu 80 μM echinacozid al celulelor MG-63 timp de 24 de ore, celulele din faza G2/M au scăzut de la 15% la aproape zero, iar celulele din faza S au scăzut de la 37% la 17% , în timp ce celulele din faza G0/1 au crescut de la 43% la 80% (Figura 4E). Aceste rezultate indică faptul că tratamentul cuEchinacozidula indus oprirea ciclului celular și a blocat celulele canceroase în faza G1.

Echinacozidul a indus apoptoza în celulele canceroase

În conformitate cu observațiile privind proliferarea celulară, analiza Western blot a arătat că tratamentul cu 60 μM și 80 μMEchinacozidultimp de 24 de ore a crescut nivelurile de caspază activă-3 și proteinele poli (ADP-riboză) polimerază scindate în celulele canceroase (Figura 5A și B), sugerând inducerea apoptozei dependente de caspază. Apoi am examinat mai mulți markeri celulari ai apoptozei. În primul rând, morfologia nucleară aEchinacozidulcelulele canceroase tratate a fost evidențiată prin colorarea cu colorant ADN DAPI, care a arătat că un tratament de 24 de ore cu 60 μM și 80 μMEchinacozidula crescut numărul de semne distinctive ale apoptozei, inclusiv picnoza și cromatina condensată (nuclei mai strălucitori) (Figura 5C). În al doilea rând, ADN-ul extras din celulele canceroase tratate în mod similar a fost analizat prin electroforeză pe gel de agaroză, care a evidențiat un model tipic de scară apoptotică (Figura S1B). În cele din urmă, caspaza activă celulară-3 a fost detectată prin colorare imunofluorescentă, care a evidențiat semnale puternice activate de caspază-3 înEchinacozidul-celule canceroase tratate (Figura S1C).

Apoi, procentul de celule apoptotice a fost măsurat prin colorare dublă cu anexină V-FITC și PI și citometrie în flux. Analiza celulelor tratate cu 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM sau 160 μMEchinacozidultimp de 2 ore, 5 ore, 12 ore sau 24 de ore au arătat că concentrații de 60 μM sau mai mari deEchinacozidula indus apoptoză semnificativă în celulele canceroase MG-63, SK-HEP{-1, MCF{-7 și SW480 (Figura 6A), dar nu și în L-O2 noncancer, HEK 293 și Celulele NIH/3T3 (Figura S2). După tratamentul celulelor MG-63 cu 60 μM, 80 μM sau 160 μMEchinacozidultimp de 24 de ore, procentul de celule apoptotice a crescut de la 8,89% la 33,72%, 39,01% și, respectiv, 48,12% (Figura 6A). Studiul pe parcursul timpului a arătat că, după 5 ore, nu a existat nicio diferență semnificativă între grupurile netratate și cele de tratament, dar apoptoză semnificativă a fost observată după tratamentul cu 60 μM sau concentrații mai mari de Echinacoside timp de 12 ore (Figurile 6B și S3).

În cele din urmă, măsurarea potențialului membranei mitocondriale cu colorantul fluorescent JC-1 a arătat în mod clar o pierdere proeminentă a potențialului membranei mitocondriale după tratamentul cu 60 μMEchinacozidultimp de 12 ore (Figura 6C), dar nu după 5 ore, indicând activarea căii de apoptoză intrinsecă în urma leziunilor ADN cauzate de 8-oxodG crescut.

Theanti-cancerși efectele antiinflamatorii alecistanche echinacozid

Discuţie

Echinacoziduleste un compus natural izolat din plantele medicinale Cistanche și echinacea.51,52 S-a demonstrat că posedă proprietăți versatile de promovare a sănătății și de prevenire a bolilor, inclusiv protecție neuronală, hepatoprotecție, antiinflamație, antioboseală, antisenescență, antidiabet și activități antitumorale. 53–58 Cea mai cunoscută și acceptată bioactivitate aEchinacoziduleste acțiunea sa antioxidantă și de captare a ROS;44,45, cu toate acestea, s-a dovedit, de asemenea, că provoacă leziuni oxidative ADN-ului în celulele canceroase, mecanismele care stau la baza rămânând neclare. test, am constatat căEchinacozidula inhibat eficient reacția enzimatică catalizată de MTH1-. Creșterea cantității de enzimă MTH1 a scăzut gradul de inhibare, în timp ce creșterea cantității de pirofosfatază anorganică nu a afectat inhibarea, indicând faptul că echinacozidul a inhibat în mod specific activitatea MTH1 în testul in vitro. Tratamentul diferitelor linii de celule canceroase umane cu echinacozid a determinat o creștere semnificativă a nivelului celular 8-oxoG fără a modifica nivelul ROS celular. Având în vedere că echinacozidul în sine este un antioxidant puternic, aceste rezultate au sugerat că nivelul crescut de 8-oxoG intracelular a fost probabil rezultatul inhibării MTH1 celulare de către echinacozid.

Tratament cuEchinacozidula cauzat daune extinse ADN și o reglare semnificativă a blocantului G1/S-CDK p21, care au fost urmate de moartea celulelor apoptotice marcate și de suprimarea proliferării celulare în mod specific în cancer, dar nu și în celulele noncanceroase. În plus, o pierdere proeminentă a potențialului membranei mitocondriale după

Echinacozidultratamentul a indicat activarea căii intrinseci a apoptozei.Echinacozidul-leziunile ADN-ului induse și reglarea în sus a p21 au fost observate în decurs de 5 ore de la tratament, în timp ce apoptoza celulelor canceroase, perturbarea potențialului membranei mitocondriale și inhibarea creșterii au fost observate la 12 ore după inițierea tratamentului. Aceste date susțin că apoptoza celulelor canceroase și inhibarea creșterii au fost rezultatele leziunilor extinse ale ADN-ului cauzate de inhibarea MTH1. Studii recente au arătat că o reducere a dimensiunii pool-ului celular de dNTP ar putea induce, de asemenea, stres de replicare a ADN-ului și leziuni ale ADN-ului59,60. posibilitatea unei dimensiuni reduse a pool-ului de dNTP și Bcl2, o proteină care reduce dimensiunea pool-ului de dNTP,60 a fost scăzută semnificativ în celulele canceroase SW480 tratate cu echinacozidă; parțial responsabil pentru daunele ADN-ului și efectele celulare cauzate de Echinacoside.

Rezervorul de dNTP este o țintă critică a ROS, iar dNTP-urile oxidate sunt surse importante de leziuni oxidative ale ADN-ului.3,10 SSB-urile și DSB-urile ADN asociate reparației pot duce la senescență celulară și apoptoză, care sunt implicate în îmbătrânire și un grad ridicat de intratumorală. eterogenitate și rate ridicate de mutație în celulele canceroase. În schimb, inhibarea MTH1 vizează un fenotip care distinge majoritatea celulelor canceroase de celulele normale și, prin urmare, reprezintă o nouă strategie anticanceroasă care nu este limitată de adaptările genetice. În mod interesant, antagoniști de molecule mici ai proteinei antiapoptoză Bcl266,67 și agonişti ai proapoptozei Bax68 au fost dezvoltați și s-au dovedit a fi agenți anti-cancer noi promițători. Având în vedere mecanismele lor complementare de acțiune, combinarea inhibitorilor MTH1 și a substanțelor chimice care promovează apoptoza ar crea o nouă generație interesantă de medicamente anticancer.

Pentru prima dată, am demonstrat o nouă funcție pentru Echinacoside ca compus natural anticancer. În testul in vitro, Echinacoside a inhibat MTH1 cu un IC50 de 7,01 μM. Această valoare IC50 este mai mare decât cea a inhibitorilor MTH1 raportați până acum.32,33,69 Folosind (S)-crizotinib ca control pozitiv, am arătat că testul nostru este de șapte ori mai puțin sensibil decât cel utilizat de Huber și colab.33. , IC50 real al echinacozidului este probabil să fie mai mic. Cu toate acestea, pentru a-l dezvolta ca agent terapeutic, eficacitatea moleculei naturale de echinacozidă va trebui probabil îmbunătățită. Fiind un produs natural care a fost folosit ca medicament pe bază de plante pentru o lungă perioadă de timp, echinacozidul ar putea servi ca o schelă chimică bună pentru dezvoltarea inhibitorilor MTH1 eficienți și probabil siguri.37,70 Având în vedere că produsele naturale au reprezentat o sursă bogată de noi schele chimice. pentru proiectarea rațională a medicamentelor bazată pe structură,70 abordări similare cu cele folosite aici,

împreună cu interesele vaste în produsele naturale pentru descoperirea medicamentelor, vor fi utile în găsirea unor noi medicamente eficiente, sigure și bazate pe ținte.

Cistancheechinacozidareanti-cancerși efecte de stimulare a sistemului imunitar