Partea 2: Echinacozidul protejează împotriva MPP plus apoptoza neuronală indusă prin reglementarea căii ROS/ATF3/CHOP

EchinacozidulProtejează împotriva apoptozei neuronale induse de MPP plus prin reglarea căii ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 1

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 3

Cistanche echinacosideare proprietăți antioxidante

Colorare prin imunofluorescență

1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH sau o combinație de MPP? și ECH. Celulele au fost apoi incubate într-un tampon de blocare (3% BSA în PBS) la temperatura camerei (RT) timp de 30 de minute. Apoi, anticorpii anti-ATF3, anti-CHOP sau anti-caspaza 3 scindată au fost diluați la 1:100 în tampon de blocare (1% BSA în PBS cu 0,3% Triton X-100) și incubați peste noapte la 4°C. După spălare de trei ori cu PBS, celulele au fost incubate cu Alexa 488-IgG anti-iepure de capră (Life Technologies, Carlsbad, CA) la RT pentru

1 h. Nucleii au fost colorați cu Hoechst 33342. Imaginile au fost capturate cu un microscop confocal (Leica SP8, Wetzlar, Germania).

Testul dUTP de etichetare Nick-End (TUNEL) mediat de deoxinucleotidil transferază terminală

Am colorat fiecare a 10-a secțiune coronală (total 14–15) prin SNc de la bregma -2.92 nm la -3.64 mm.

Patru secțiuni tipice prin SNc la același nivel în fiecare grup au fost utilizate pentru numărarea TH și TUNEL [10]. Testele TUNEL au fost efectuate pentru a analiza apoptoza în secțiuni de țesut cu un kit de detectare a morții celulare in situ (Roche, Rotkreuz, Elveția), urmând instrucțiunile producătorului. După marcarea ADN-ului, secțiunile au fost folosite pentru colorarea prin imunofluorescență cu anticorp anti-TH, iar imaginile au fost capturate cu un microscop confocal (Leica SP8, Wetzlar, Germania). După delimitarea SNc la o mărire mică (10 9 obiective) conform atlasului creierului de șoarece [20], celulele TH-pozitive și celulele dublu-pozitive TH/TUNEL au fost numărate la o mărire mai mare ({{7} } obiective) de către doi observatori orbi la tratament. S-a calculat raportul dintre celulele dublu pozitive TH/TUNEL și celulele TH pozitive.

Cistancheechinacozidul areantiinflamatorproprietăți

Analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca medie ± SD. ANOVA unidirecțională urmată de analiză post-hoc cu HSD Tukey și testul de comparații multiple Student-Newman-Keuls au fost efectuate în scopuri statistice. O valoare de P \ 0.05 a fost considerată semnificativă statistic.

Rezultate

ECH scade produsele ROS și atenuează

MPP1-Apoptoză indusă

S-a demonstrat că ECH protejează neuronii de apoptoză în modelele animale, precum și reduce nivelurile de citokine proinflamatorii din celulele neuroblastomului [12]. Cu toate acestea, rămâne neclar dacă ECH modulează direct apoptoza neuronală indusă de MPP?. Datele noastre au arătat că ECH nu a afectat proliferarea sau moartea celulelor SH-SY5Y (Fig. 1B), iar morfologia lor a rămas neschimbată (Fig. 1C). Interesant, după expunerea celulelor SH-SY5Y la MPP?, supraviețuirea a crescut într-o manieră dependentă de doză după tratamentul cu ECH (10-40 lg/mL) (Fig. 1B, C).

Studiile anterioare au arătat că MPP? inhibă în mod specific lanțul de transport de electroni în mitocondrii și este, de asemenea, asociat cu generarea de ROS [6, 21]. Folosind DCFH-DA ca sondă fluorescentă pentru a evalua modificările nivelurilor ROS, am constatat că ECH a suprimat în mod semnificativ generarea de ROS indusă de MPP-a (Fig. 2A). Microscopia confocală a arătat că scăderea produselor ROS au fost asociate cu nivelurile ECH (Fig. 2C). De asemenea, s-a demonstrat că ECH protejează membrana celulară împotriva ROS și scade nivelurile de MDA, produsul final al peroxidării lipidelor (Fig. 2B). Luat impreuna,

ECH promovează supraviețuirea celulară prin scăderea produselor ROS induse de MPPa în neuroni.

ECH suprimă expresia genelor induse de ROS/MPP1-și crește GDNF

Expresie în MPP1-Celule tratate

S-a demonstrat că produsele ROS stimulează răspunsul proteic desfășurat și induc expresia genelor legate de stres, inclusiv ATF3, ATF4 și CHOP [22]. ATF3 și CHOP joacă un rol deosebit de important în apoptoza neuronală indusă de stres [9, 23]. Expresia anormală a sinucleinei este, de asemenea, unul dintre markerii critici în patologia PD [2]. Folosind qRT-PCR, am analizat expresia ATF3, CHOP, SNCA și a factorului neurotrofic derivat din linia celulară glială (GDNF) în MPP? model de celule și a găsit că MPP? a îmbunătățit semnificativ expresia ATF3, CHOP și SNCA în comparație cu grupul de control PBS. ECH nu a afectat expresia acestor gene în celulele SH-SY5Y care nu au fost tratate cu MPPa. Cu toate acestea, ECH a abrogat expresia lor indusă de MPPa (Fig. 3). În plus, MPP? a suprimat în mod semnificativ expresia GDNF în celulele SH-SY5Y, dar ECH a inversat parțial acest fenomen (Fig. 3B).

ECH inhibă activarea MPP1-indusă de caspază-3 în celulele SH-SY5Y

Nivelurile ridicate de ATF3 și CHOP promovează în mod direct apoptoza neuronală [9, 23]. Datele noastre au arătat că ECH a inhibat expresia ATF3 și CHOP într-o manieră dependentă de doză (Fig. 4A). ECH a blocat, de asemenea, caspaza indusă de MPP?-3

activitate (Fig. 4A, B). Analiza de imunofluorescență a formei scindate a caspazei-3 a arătat în continuare că ECH a scăzut semnificativ expresia proteinei caspazei scindate-3 în celulele tratate cu MPPa (Fig. 4C).

ECH inversează MPP1-ATF3 indusă și acumularea CHOP în celulele SH-SY5Y

În urma expunerii la toxinele din mediu, proteinele ATF3 și CHOP se localizează în citoplasmă și nucleu [24, 25], iar acest lucru duce la apoptoză. Rezultatele noastre au sugerat că MPP? tratamentul a crescut expresia ATF3 și CHOP în nucleu, iar ECH a atenuat eficient acest proces (Fig. 5A, B). Analiza Western blot a arătat că MPP? niveluri semnificativ crescute ale ambelor proteine ​​din citoplasmă și nucleu. Interesant este că ECH a abrogat MPP? efecte și a suprimat acumularea de ATF3 și CHOP în nucleu (Fig. 5C–E).

ATF3 joacă un rol critic în apoptoza indusă de MPP1-în celulele SH-SY5Y

S-a demonstrat că ATF3 induce apoptoza în celulele SH-SY5Y [23], iar rezultatele studiului de față indică faptul că ECH suprimă în mod semnificativ ARNm ATF3 și expresia proteinei induse de MPP? în aceste celule. Cu toate acestea, rolul ATF3 în apoptoză și protecția ECH a supraviețuirii celulelor a rămas neclar. Așadar, am folosit ARN mic în ac de păr (shRNA) specific pentru ATF3 pentru a investiga acest lucru și nu am găsit nicio diferență de viabilitate între grupul de deblocare ATF3-și grupul de control în condiții normale (Fig. 6A). Cu toate acestea, suprimarea ATF3 sau tratamentul cu ECH au salvat în mod semnificativ modificările morfologice induse de MPP? (Fig. 6B). Celulele ATF3-knockdown au avut o viabilitate mai mare decât grupul de control după expunerea la MPP? (Fig. 6C). Nivelurile de proteine ​​ale CHOP și ale caspazei activate-3 au fost mai scăzute în celulele3-knockdown ATF decât

în celulele de control cu ​​shARN nespecific (Fig. 6C, D). Aceste date au indicat că ATF3 joacă un rol critic în apoptoza indusă de MPPa a celulelor neuroblastomului. Deci, aceste rezultate susțin ipoteza că ECH protejează celulele SH-SY5Y împotriva efectelor induse de MPPa prin reglarea în jos a căii ROS/ATF3/CHOP. În mod interesant, datele noastre au arătat că ECH a inhibat și creșterea indusă de MPP a nivelurilor p53 și PUMA (modulatorul p53-suprregulat al apoptozei) în celulele SH-SY5Y (Fig. 7).

Cistancheechinacozidare ca efect sporireaimunitate

ECH protejează neuronii DA împotriva apoptozei

Indus de MPP1 in Vitro sau de MPTP in Vivo

Pentru a confirma acțiunea ECH în PD, neuronii DA primari au fost tratați cu MPP? sau MPP? și ECH. Experimentele in vitro au dezvăluit că MPP? a redus semnificativ viabilitatea neuronilor DA și acest lucru a fost prevenit de ECH

(Fig. 8). Am evaluat în continuare apoptoza în neuronii DA din SNc după diferite tratamente la șoareci cu PD indusă de MPTP și martori. S-au găsit mai mulți neuroni TH-pozitivi în această zonă la control decât în ​​grupul MPTP (Fig. 9A). Testele TUNEL au arătat că NS și ECH nu au indus apoptoza în neuronii DA din SNc, dar MPTP a făcut-o și ECH a protejat neuronii împotriva acesteia (Figurile 9B, S2). Interesant, western blotting a lizatelor SNc din modelul de șoarece al PD a arătat că nivelurile de proteine ​​ATF3 și CHOP au fost, de asemenea, scăzute de ECH (Fig. 10).

Cistancheechinacozidare oefect anti-apoptotic