Partea 2: Cartografierea interacțiunii epigenomice și transcriptomice în timpul formării și retragerii memoriei în ansamblul de engrame hipocampice

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 1

Programe transcripționale distincte ale ansamblurilor de engrame în timpul formării și rememorării memoriei

Pentru a elucida modul în care schimbările în accesibilitatea cromatinei și interacțiunile promotor-amplificator au afectat expresia genelor, am efectuat ARN-seq nuclear (nRNA-seq) din toate subpopulațiile neuronale. Analiza noastră a genei exprimate diferențial (DEG) a dezvăluit o cantitate scăzută de modificări în faza incipientă în comparație cu neuronii în stare bazală (Basal vs. Early, 88 DEGs, Fig. 5a, Tabelul suplimentar 8). Acest lucru a fost deosebit de neașteptat, având în vedere gradul extins de organizare a cromatinei observat la acest moment (Fig. 2a). În schimb, neuronii din faza târzie au prezentat un număr mai mare de DEG, în ciuda faptului că există mai multe similarități în accesibilitatea cromatinei în aceste momente (Fig. 5a). Pentru a valida descoperirile noastre transcripționale, am comparat rezultatele noastre cu datele publicate anterior ale celulelor granulare DG activate la 1 oră după expunerea nouă32, 24 ore după FS20 și după stimularea prelungită (6 ore) a neuronilor corticali cultivați la șoarece cu KCl33 (Date extinse Fig. 4a). ). Interesant, deși această comparație a evidențiat o suprapunere semnificativă între genele reglate în sus din setul nostru de date și la 1 oră după expunerea nouă32 (P=0.006) sau la 24 de ore după FS20 (P=0 .0005), am nu a observat nicio suprapunere semnificativă cu genele care au fost reglate în sus în celulele engramei reactivate și în celelalte seturi de date, confirmând peisajul transcripțional unic al celulelor engramei reactivate în timpul retragerii.

Apasa peCistanche beneficii și efecte secundare pentru memorie

Apoi, am profitat de abordarea computațională publicată anterior34, care măsoară modificările citirilor de ARN (exoni) și pre-ARNm (introni) mature. După cum era de așteptat, modificările exonice se corelează cu modificările transcripționale globale, măsurate prin DEseq2 (atât citirile exonilor, cât și ale intronului), în toatememoriefaze (Date extinse Fig. 4b). Cu toate acestea, măsurarea rapoartelor exon/intron indică faptul că transcrierile modificate (reglate în sus și în jos) în timpulmemorieconsolidarea (devreme vs. târzie) sunt conduse în principal de citirile intrronice, sugerând că acest profil transcripțional reflectă în cea mai mare parte transcrierile imature care necesită pași suplimentari de procesare a ARN (Date extinse Fig. 4c). În schimb, genele reglate în sus în timpul retragerii (Târzie vs. Reactivate) sunt conduse în principal din transcrierile exonice, reflectând astfel o stare mai matură a ARN (Date extinse Fig. 4c).

Pentru a reconcilia discrepanța dintre modificările observate de cromatina și starea transcripțională în fiecare subpopulație, am efectuat analiza de corelație a DAR și DEG, identificate în diferite momente de timp alememorieformare și rechemare. Pentru această analiză, DAR-urile din regiunile necodante (intergenice și intrronice) au fost mapate la promotorii lor respectivi, utilizând datele noastre pc-HiC. În general, am găsit o corelație scăzută (P=2.81 × 10−2) între accesibilitatea diferențială a cromatinei și modificările expresiei genice care apar în faza incipientă (Basal vs. Early, Extended Data Fig. 4d). Aceste rezultate au fost în conformitate cu lucrările anterioare21, raportând că modificările histonelor au o corelație mică cu modificările transcripționale în timpulmemorieachiziţie. În mod neașteptat, am observat o suprapunere și o asemănare mai puternică între modificările cromatinei care apar în timpulmemoriecodificare (Devreme) cu peisajul transcripțional alterat în timpul consolidării memoriei (Târzie) și neuronii engramei reactivați (P {{0}}.13 × 1{0−8, 2.42 × 10 −7, respectiv, date extinse Fig. 4d). Pentru a confirma în continuare această analiză, am efectuat o corelație Pearson între valorile log2FC din DAR și valorile log2FC ale DEG-urilor care au fost adnotate în acea regiune (regiunile intergenice au fost mapate prin setul de date pc-HiC, date extinse Fig. 4e, tabelul suplimentar 9) . Analiza noastră a dezvăluit că modificările timpurii ale cromatinei (Basal vs. Early, DARs) au fost corelate semnificativ cu reglarea în jos a genelor în faza târzie (Early vs. Late, Extended Data Fig. 4e, linia gri, r=- 0.14, p < 0.0001).="" mai="" mult,="" după="" analizarea="" deg-urilor="" la="" citirile="" intrronice="" și="" exonice,="" am="" observat="" că="" corelația="" a="" fost="" în="" mare="" măsură="" determinată="" de="" citirile="" intrronice="" (introni="" r="-0,21," p="">< 0,0001,="" exoni="" r="-0,09," p="" {{="" 29}}.02).="" în="" schimb,="" modificările="" timpurii="" ale="" cromatinei="" (basal="" vs.="" early,="" dar)="" au="" arătat="" o="" corelație="" pozitivă="" cu="" deg="" din="" celulele="" reactivate,="" care="" a="" fost="" determinată="" în="" principal="" de="" citirile="" exonice="" (introni="" r="-0,007," p="0.73" ,="" exonii="" r="0.11," p="0.04)." aceste="" date="" oferă="" dovezi="" suplimentare="" pentru="" un="" eveniment="" de="" amorsare="" și="" decalaj="" transcripțional,="" în="" care="" modificările="" cromatinei="" care="" apar="" în="" timpul="" fazei="" timpurii="" permit="" modificări="" transcripționale="" observate="" la="" un="" moment="" ulterior,="" în="" principal="" în="" celulele="" engramei="">

Memoriecodificarea, consolidarea și rechemarea este un proces dinamic care necesită mai multe valuri de transcripție întârziată a genelor12,32,33. Prin urmare, pentru a identifica diferite programe de transcripție în toatememoriefazele, am evaluat expresia fiecărei gene de la neuronii neactivați (bazali) până la timpuriu (activat timpuriu), târziu (activat-târziu) și neuronii care au fost reactivați în timpul retragerii (reactivat). Toate genele exprimate diferențiale (DEG, n=1095) care au îndeplinit criteriile de limită (valoarea p < 0.01,="" log2="" (modificarea="" ori)=""> 1) au fost grupate în mod imparțial (k-media) (Fig. 5b,c). Au fost identificate patru grupuri majore; i) 260 de gene

care au fost reglate în jos în faza târzie (clusterul Dw-târzie), ii) 207 gene care au fost reglate în sus în faza târzie (clusterul sus-tardiv), iii) 186 de gene care au fost reglate în sus în faza incipientă, și au fost susținute peste totmemoriefaze (cluster stabil) și iv) 438 gene

care au fost unic up-reglate în neuronii reactivați, în timpulmemorierecall (cluster de reactivare). Similar cu comparația noastră pe perechi, modificările transcripționale ale neuronilor activați-târzii s-au corelat mai mult cu citirile intrronice, iar peisajul transcripțional al neuronilor reactivați pare a fi mai matur și a prezentat o corelație mai mare cu citirile exonice (Date extinse Fig. 5a, b).

Apoi am efectuat o analiză a ontologiei genelor (GO) pentru fiecare cluster (Fig. 5d), pentru a identifica căi îmbogățite în diferitememoriefaze. Semnătura transcripțională a grupului târziu a fost îmbogățită pentru genele implicate în reglarea „funcției sinapsei inhibitoare”, care s-a dovedit a juca un rol în excitabilitatea neuronală35,36 (Fig. 5e). În grupul Up-late, am observat seturi de gene implicate în reglarea pozitivă sau negativă a transcripției, cum ar fi familia oncogenei fibrosarcomului musculoaponevrotic v-maf, proteina B (Mafb), familia melc degetul de zinc 2 (Snai2) și RE{{ 8}}factorul de transcripție de tăcere (Rest) (Fig. 5e). În mod interesant, am descoperit că 15% (32/207) din promotorul genei din clusterul Dw-tardi adăpostește fie Snai2 (valoarea p - 1 × 10−9) fie Rest (valoarea p - 1 × 10−3) locuri de legare. Această dinamică a regulatorilor transcripționali indică o posibilă interacțiune între clusterele Dw- și Up-late. În special, s-a constatat că într-un singur ansamblu neuronal distinct din punct de vedere funcțional existămemorieengrama, în care ansamblurile dependente de proteina 4 (Npas4) ale domeniului PAS neuronal al oncogenei osteosarcomului FBJ (Fos) suferă modificări sinaptice distincte după CFC și conduc comportamente ghidate de memorie în direcții opuse37. S-a demonstrat că intrările sinaptice excitatorii promoveazămemoriegeneralizarea şi cele inhibitorii favorizează discriminarea memoriei. Deși aceste ansambluri distincte nu au putut fi diferențiate în studiul curent, aceste observații ar putea explica expresia bidirecțională a regulatorilor transcripționali pozitivi sau negativi, precum și genele reglate în sus și în jos implicate în excitabilitatea neuronă.

Cistanche poate îmbunătăți memoria

Clusterul stabil a fost îmbogățit în mare parte pentru transcrierile implicate în remodelarea citoscheletică, axonală și dependentă de hipocampmemorie38, inclusiv neurofilamentele polipeptidice ușoare și grele (Neal, Neath) și miozină, polipeptida grea 10, non-musculară (Myh10) (Fig. 5d, e). Pentru a vizualiza și a urmări modificările legate de citoscheletul pe dendrite și coloane, reporterul loop-eYFP (dependent de TAM) a fost livrat de virusul adeno-asociat (AAV) în șoarecii DG ofArc-CreERT2 (Date extinse Fig. 6a). Datele noastre au arătat că neuronii activați-tarzi și reactivați găzduiesc un număr semnificativ mai mare de ciuperci și coloane subțiri (P< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 6b),="" with="" no="" significant="" changes="" in="" dendritic="" shaft="" diameter="" (p="0.6)," when="" compared="" to="" the="" activated="" -early="">

Semnătura transcripțională unică a neuronilor engramei reactivați (cluster de reactivare) a fost caracterizată în principal prin categorii de „transport/legare ARN” și „mecanisme de translație a proteinelor” (Fig. 5d). Acest program transcripțional include exprimarea crescută a membrilor familiei kinesinei 5a și c (Kif5a, Kif5c), inițierea translației eucariote (Eif) factor 3 subunitatea A, D (3a, 3d), factorul 4 subunitatea H (Eif4h), factorul 5 subunitatea A ( Eif5a) și proteina ribozomală (Rpl27a, Rpl35, Rpl36, Rps19, Rps24, Rosa) (Fig. 5d, e), care au fost raportate anterior că joacă un rol crucial în transportul ARNm la compartimentul sinaptic și controlul autonom al traducerii locale39 . Pentru a valida în continuare aceste constatări la nivel de translație, am măsurat expresia proteinei și localizarea a trei membri din familia Eif prin imunohistochimie (IHC). S-a raportat anterior că membrii Serval Eif sunt implicați în mod specific în traducerea în compartimentele sinaptice39, prin urmare, am analizat separat expresia proteinei pe soma și arborii dendrite ai neuronilor activați (Fig. 5f). Neuronii reactivați au avut o expresie mai mare a proteinelor Eif3e în somă, în comparație cu neuronii activați timpurii și tardivi (Date extinse Fig. 6c). În schimb, Eif4e a fost semnificativ mai abundent în arborele neuronilor reactivați, în comparație cu neuronii activați timpurii și tardivi (Ps<0.05, fig.="" 5f),="" providing="" further="" evidence="" for="" increased="" protein="" synthesis="" in="" those="" neurons.="" cistanche="" can="" improve="">memorie.

Mașinile de translație crescute facilitează modificări ale formei, mărimii și numărului coloanei vertebrale, rezultând o plasticitate sinaptică îmbunătățită39-41. În plus, coloanele cu diametre mai mari ale capului sunt mai susceptibile de a conține ribozomi pentru sinteza locală a proteinelor, densități postsinaptice mai mari, care ancorează mai mulți receptori de glutamat AMPA și fac aceste sinapse mai puternice funcțional41,42. În concordanță cu aceste rapoarte, neuronii reactivați au prezentat un număr mai mare de diametre ale capului mărite (51 la sută din toate coloanele ciupercilor), în comparație cu grupul Activat - târziu (18 la sută) (Date extinse Fig. 6d). Mai mult, am găsit o creștere semnificativă atât a nivelului de ARNm a receptorului glutamat 1, ionotrop, AMPA1 (Gria1) (Date extinse Fig. 6e), cât și a nivelurilor de proteină Gria1 numai în arborii dendritici ai neuronilor reactivați, în comparație cu activați - timpurii și - neuroni tardivi (Fig. 5g). În mod colectiv, aceste date susțin ipoteza că programe transcripționale separate temporal sunt sincronizate pentru a menține excitabilitatea neuronală, modificările structurale, translația proteinelor și plasticitatea sinaptică, pe toată durata de viață a ansamblului engramei.

Elementele de reglare cu efecte transcripționale opuse interacționează cu promotorii pe măsură ce memoria progresează de la codificare la reamintire

Apoi am întrebat cum interacțiunea promotor-amplificator pe distanță lungă și starea cromatinei ar putea duce la modificări coordonate ale expresiei genelor observate în fiecare dintre clusterele transcripționale. Pentru a realiza acest lucru, am măsurat accesibilitatea cromatinei peste amplificatori care interacționează cu promotorii, din fiecare grup transcripțional (Fig. 6a-c). În plus, scorul de interacțiune al acelor amplificatori a fost reprezentat împreună cu accesibilitatea cromatinei și expresia genică a acestora (Tabelul suplimentar 10).

Cistanche poate îmbunătăți memoria

În general, toate clusterele au arătat o creștere semnificativă a accesibilității cromatinei pe amplificatori. Foarte important, am constatat că accesibilitatea cromatinei a avut loc înainte de 3D - rearanjarea cromatinei și modificarea expresiei genelor, oferind un sprijin suplimentar pentru o întârziere transcripțională (Fig. 6a-c, Date extinse Fig. 7a, b). Mai exact, în clusterul Reactivare, analiza noastră a relevat un proces bifazic, în care faza timpurie amemorieformarea conduce la un eveniment de amorsare, în care amplificatorii devin mai accesibili, dar nu reușesc să arate modificările așteptate în expresia genelor. Reactivarea celulelor engramei a fost asociată cu reorganizarea interacțiunilor promotor-amplificator, în care amplificatorii amorsați au fost aduși în contact cu promotorii respectivi cu o frecvență mai mare și a fost observată o creștere transcripțională (Fig 6a-c). Cistanche se poate îmbunătățimemorie.

S-a sugerat anterior că interacțiunile promotor-amplificator sunt extrem de dinamice, iar interacțiunile cu potențiatori combinatori diferiți duc la o schimbare direcțională a expresiei genelor, în funcție de faptul dacă amplificatorul găzduiește un represor sau un activator14, 18. Cistanche se poate îmbunătăți.memorie.

Pentru a investiga în continuare acest lucru, am folosit cromul pentru a segrega în mod imparțial genomul în diferite stări definite de locațiile motive care leagă fie activatori transcripționali1 (răspunsul de creștere timpuriu 1 (Egr1), Ap1), represori transcripționali43,44 (gena de adenom pleiomorfă 1 (Plagl1). ), hipermetilat în cancerul 2 (Hic2), proteina de legare a metil CpG 2 (Mecp2), Snai2 și Rest) sau TF-uri care au un impact bidirecțional asupra transcripției și sunt implicate în arhitectura genomului 3D25,44,45 (factorul de legare a CCCTC ( CTCF), factorul de transcripție E2F 1 (E2f), Yy1). Aceasta a identificat trei stări combinatorii diferite ale situsurilor de legare a TF (represor puternic, activator bivalent și puternic, Fig. 6d, e). Interesant, grupul cu o reducere a expresiei genelor (Dw-tardi) a arătat o corelație în creștere progresivă de la codificare la regăsire cu amplificatori care găzduiesc represori transcripționali și motive bivalente (Fig. 6d, harta termică superioară; Date extinse Fig. 7c, d). Aceste date indică faptul că, în ciuda accesibilității cromatinei observate, genele sunt reglate în jos din cauza represiunii care iese din aceste elemente de reglementare. Cistanche se poate îmbunătățimemorie.

Spre deosebire de aceasta, în clusterul de reactivare, am observat o îmbogățire incrementală pentru amplificatori care adăpostesc activatori transcripționali împreună cu motive care ancorează structurile buclei (Date extinse Fig. 7c, d). Prin urmare, se pare că, după activitatea neuronală, mai mulți promotori pot utiliza o gamă largă de amplificatori diferiți pentru a stabili noi interacțiuni promotor-amplificator care pot coordona diferențial expresia genelor. În acest model, promotorii genelor reglate în jos interacționează cu amplificatori care găzduiesc represori transcripționali, în timp ce genele reglate în sus sunt rezultatul interacțiunilor promotor-amplificator care aduc activatorii transcripționali în contact strâns cu promotorii respectivi. Colectiv, datele noastre dezvăluie o reprogramare secvențială a accesibilității cromatinei, arhitecturii genomului 3D și interacțiunilor promotor-amplificator pe parcursul formării engramei (Date extinse Fig. 8).