Partea 2: Boala renală cronică proteinurică este asociată cu durata de viață alterată a celulelor roșii din sânge, deformabilitatea și metabolismul

Pentru partea 1, dați clicAICI.

Contact: emily.li@wecistanche.com

Leziunea renală indusă de doxorubicină modifică durata de viață, morfologia și proprietățile biofizice ale RBC murine

Douăzeci de zile după inducerea DIN, care coincide cu dezvoltarea redusăfunctia rinichilor(Figura 1b), colorantul fluorescent 5(6)-CFDA, SE,24, care este absorbit rapid în RBC, a fost injectat iv pentru a examina rata de eliminare a RBC la momentele de timp indicate in vivo. Histogramele reprezentative, prezentate în Figura 4a, indică îndepărtarea eritrocitelor marcate din circulație și înlocuirea cu eritrocite neetichetate. Pierderea crescută de eritrocite a fost deja evidentă la 3 zile după administrarea colorantului, iar eliminarea eritrocitare a fost semnificativ mai rapidă la șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN până în ziua 37. În ziua 41, z17% mai mulți eritrociți au fost îndepărtați din circulație la acești șoareci în comparație. cu șoareci sănătoși (Figura 4b).

Cistancheîmbunătăţifunctia rinichilorșibeneficiirinichi

Imaginile luate dintr-un frotiu de sânge au dezvăluit modificări morfologice ale RBC-urilor extrase de la șoareci 129S1/SvImJ cu șoareci DIN (Figura 4c) și Nphs2Dipod (Figura suplimentară S4A). La șoarecii sănătoși, eritrocitații prezintă o formă de disc biconcav. La șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN, am observat un număr crescut de stomatocite (stele roșii), celule lacrimogene (triunghi negru), schistocite (puncte negre) și celule microcitare (săgeată neagră) (Figura 4c). Șoarecii Nphs2Dipod au prezentat o proporție crescută de schistocite (puncte negre, Figura suplimentară S4A, imaginea inferioară, partea stângă), iar celulele au fost policromatice (Figura suplimentară S4A, imaginea inferioară, partea dreaptă).

Pentru a investiga în continuare modificările funcționale ale RBC, măsurătorile deformabilității în ziua 30 au fost efectuate folosind ektacitometrie.³²Deformabilitatea RBC a fost redusă semnificativ la șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN, precum și la șoarecii Nphs2Dipod, așa cum este indicat de un indice de alungire maximă redus (EImax) (Figura 4d și Figura suplimentară S4B). Tensiunea de forfecare pentru 50 procente (SS1/2) din EImax (Figura 4e) și, prin urmare, raportul SS1/2 EImax (Figura 4f) au fost semnificativ crescute la șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN, indicând RBC mai rigide. SS1/2 din EImax a fost similar la șoarecii Nphs2Dipod (Figura suplimentară S4C). Raportul SS1/2 EImax a avut tendința de a fi crescut la șoarecii Nphs2Dipod în comparație cu șoarecii sănătoși C57BL/6; diferența nu a atins totuși o semnificație statistică (P=0,06) (Figura suplimentară S4D).

Deoarece expunerea RBC la condiții extracelulare hipertonice in vitro imită mediul osmotic întâlnit în medula renală, un cosmos poate fi realizat în ziua 30 și au fost determinați mai mulți parametri osmosensibili, așa cum s-a descris anterior.³³ Omin reprezintă osmolalitatea la deformabilitatea minimă a RBC, dincolo de care RBC-urile s-ar liza cu o scădere suplimentară a osmolarității. Valorile Omin au fost mai mari la șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN și s-au deplasat la dreapta (Figura 5a și d). O tendință similară către un Omin mai mare a fost observată la șoarecii Nphs2Dipod (Figura suplimentară S4E). Valorile Ohyper, care reflectă starea de hidratare a celulelor, au fost semnificativ mai mari la șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN (Figura 5b), dar au fost similare la șoarecii Nphs2Dipod și la șoarecii de control respectivi (Figura suplimentară S4F). Deformabilitatea maximă (EImax) la izotonicitate este punctul în care celulele au atins elipticitatea maximă. EImax la izotonicitate a fost redus semnificativ la șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN (Figura 5c), dar nu a prezentat diferențe la șoarecii Nphs2Dipod în comparație cu șoarecii sănătoși C57BL/6 (Figura suplimentară S4G). În general, aceste rezultate indică o integritate și elasticitate reduse a membranei, dar și modificări de formă la șoarecii 129S1/SvImJ și Nphs2Dipod, precum și o fragilitate osmotică mai mare a RBC de la șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN.

RBC-urile sunt reprogramate metabolic în timpul bolii renale proteinurice la șoareci

Pentru a înțelege mai bine adaptările moleculare asociate cu modificările abundenței și morfologiei RBC în funcție de leziuni renale, RBC-urile de la șoareci 129S1 / SvImJ cu șoareci DIN și Nphs2Dipod au fost analizate prin metabolomică bazată pe spectrometrie de masă (Figura 6a și Figura suplimentară S5A). Folosind această abordare, nivelurile relative de 256 de metaboliți au fost determinate pentru șoarecii 129S1/SvImJ și șoarecii Nphs2Dipod. Pentru a analiza aceste date într-o manieră sistematică, au fost efectuate analize multivariate, inclusiv analiza discriminantă a celor mai mici pătrate parțiale și analiza grupării ierarhice. Interesant, analiza discriminantă a celor mai mici pătrate parțiale a metabolomilor RBC din ambele modele a dezvăluit modele de grupare similare.

În mod specific, deși probele din momentul inducției modelului s-au grupat împreună cu mostre sănătoase din toate momentele, mostrele de la șoareci nefrotici s-au grupat independent de probele de control sănătoase împreună cu componenta 1 (Figura 6b și Figura suplimentară S5B). În conformitate cu modelele de grupare evidente în cele 2 modele, analiza de grupare ierarhică a datelor metabolomice pentru fiecare model a evidențiat tendințe similare pentru metaboliții implicați în gestionarea stresului oxidativ, precum și nucleotidele, aminoacizii, acilcarnitinele și acizii grași (Figura 6c). și figuri suplimentare S5C, S6 și S7). De exemplu, nivelurile de alantoină, un catabolit purinic și marker al stresului oxidativ în eritrocite,³⁴ și glutationul redus s-au acumulat în mod semnificativ în timp în ambele modele de șoarece nefrotic, indicând generarea în curs de desfășurare a speciilor reactive de oxigen și activarea sistemului antioxidant de glutation (Figura 6d și Figura suplimentară S5D). De asemenea, nivelurile pantotenatului precursor al coenzimei A (CoA) s-au acumulat în timp (Figura 6e și Figura suplimentară S5E).

Modele similare au fost evidente în nivelurile acizilor grași liberi acid hexadecenoic (C16:1), acid octadecenoic (C18:1) și acid docosapentaenoic (C22:5), deși fiecare model avea modele temporale unice (Figura 6f și Figura suplimentară). S5F).

Pe lângă acizii grași, au răspuns și acilcarnitinele, inclusiv hidroxioctanoil-carnitina (AC C8-OH), hidroxidecanoil-carnitina (AC C10-OH) și dodecanoil-carnitina (AC C12:1). la inducerea nefropatiei proteinurice în ambele modele (Figura 6g și Figura suplimentară S5G).

Luate împreună, aceste constatări sugerează că la inducerea proteinelorboală de rinichiîn 2 modele similare de șoarece, nivelurile crescute de stres oxidativ pot afecta lanțurile de acil de pe lipidele membranei. Deoarece RBC sunt lipsiți de capacitatea de a sintetiza noi lipide, ele folosesc un sistem care depinde de îndepărtarea mediată de fosfolipază a lanțurilor de acil deteriorate și înlocuirea cu acizi grași nedeteriorați. Denumit ciclu Lands,35 acest sistem depinde de activarea lanțului acil prin conjugarea cu CoA, care stabilește un echilibru cu acilcarnitina pentru înlocuirea membranei36 (Figura 6h și Figura suplimentară S5H).

Pacienții cu BRC proteinurică cu anemie prezintă un deces crescut al eritrocitelor

To confirm that PS-exposing RBCs occur also in human CKD, as described earlier,37 we analyzed blood samples from 25 patients treated by our outpatient clinic. To match the mouse models that represent nephrotic syndrome with preserved GFR during the first 10 days, and then advanced CKD with reduced GFR from day 20 onwards (Figure 1 and Supplementary Figure S2), we analyzed 10 patients with primary nephrotic syndrome representing proteinuric CKD with preserved GFR (>60 ml/min per 1,73 m2) și 15 pacienți cu CKD cu proteinurie în intervalul nefrotic și RFG<60 ml/min="" per="" 1.73="">². Caracteristicile pacientului sunt prezentate în Tabelul 1. Anemia asociată bolii renale, așa cum este definită de concentrația de hemoglobină<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">

RBC-urile umane de la pacienții cu sindrom nefrotic primar și CKD avansată au prezentat modificări morfologice, așa cum s-a observat în modelele de șoarece (Figurile 4c și 7j-l și Figura suplimentară S4A). Deși morfologia RBC a fost normală la martori, pacienții anemici cu sindrom nefrotic primar și pacienții cu CKD avansat au avut un număr crescut de celule lacrimogene (triunghiuri negre) și echinocite (încrucișări negre) (Figura 7k și l). În plus, celulele țintă au apărut la pacienții nefrotici primari cu anemie și la pacienții cu CKD avansată (cruci roșii; Figura 7k și l). Toate grupurile de pacienți, inclusiv pacienții nefrotici primari fără anemie, au avut o proporție crescută de sferocite (săgeți albastre; Figura 7j-l). Pentru a analiza deformabilitatea eritrocitelor umane, a fost efectuată ektacitometrie. În comparație cu martorii sănătoși, deformabilitatea maximă (EImax) a fost redusă la pacienții cu CKD avansată (Figura 7h); EImax a avut tendința de a fi mai scăzut la pacienții cu sindrom nefrotic primar, fără a atinge semnificația statistică (Figura 7h). Parametrii SS1/2, Omin, Ohyper și EImax la izotonicitate nu au fost semnificativ diferiți între controalele sănătoase, pacienții nefrotici primari și pacienții cu CKD avansată (Figura suplimentară S8A-D).

Beneficii Cistancherinichi și ajută la CKD.

DISCUŢIE

Prezentul studiu dezvăluie mecanisme fiziopatologice noi care duc la anemie asociată bolii renale în 2 modele murine de proteinurie.boală de rinichicu afectare severăfunctia rinichilor. Studiul nostru demonstrează că, în aceste modele, anemia este rezultatul unei durate de viață reduse a RBC declanșată de expunerea la PS și clearance-ul fagocitar accelerat. În mod intrigant, anemia la acești șoareci s-a dezvoltat în ciuda eritropoiezei stimulate, sugerând că durata de viață redusă a RBC, prin creșterea morții celulelor RBC, ar putea fi o explicație alternativă pentru aceste descoperiri. Spre deosebire de pacienții cu CKD cu anemie (Figura 77), ambele modele de șoarece au fost caracterizate prin creșterea concentrației plasmatice de EPO. Acest lucru poate fi presupus prin păstrarea capacității de secreție de EPO la aceste modele care, probabil, economisesc celulele secretoare de EPO situate în interstițiul rinichiului. Secreția crescută de EPO în aceste modele, totuși, nu invalidează concluzia că moartea celulelor RBC este un jucător major în patogeneza anemiei asociate bolii renale. Dimpotrivă, stimularea eritropoiezei prin secreția crescută de EPO poate fi considerată ca un mecanism compensator la creșterea morții RBC induse deinsuficiență renalăîn aceste modele. În acest sens, eritropoieza extramedulară crescută cu volumul splinei crescut a fost observată recent într-un alt model de șoarece proteinuric cu anemie.³⁸

La pacienții cu BRC proteinurică și anemie concomitentă, am observat, de asemenea, un procent crescut de eritrocite care expun PS, împreună cu niveluri mai mari de specii reactive de oxigen și ceramidă. Acest lucru sugerează că moartea accelerată a RBC ar putea fi implicată în patogeneza anemiei asociate bolii renale în CKD umană. Concentrațiile plasmatice de EPO și indicele de producție de reticulocite nu au fost crescute la pacienții cu BRC anemici, indicând o reducere a eritropoiezei, care, împreună cu moartea RBC, este de așteptat să agraveze anemia asociată bolii renale. Motivele pierderii secreției de EPO a rinichilor în CKD umane rămân neclare. În mod remarcabil, deși nu toți pacienții cu RFG normal au avut anemie, cei cu RFG redus au fost toți anemici, indicând un efect de CKD de lungă durată și avansată. În special, deficitul relativ de EPO în CKD poate fi depășit prin utilizarea noii clase de inhibitori ai prolil hidroxilazei,³⁹sugerând o detecție perturbată a oxigenului ca o posibilă cauză a hiposecreției de EPO.

Cistancheîmbunătăţifunctia rinichilors și ajutor cu CKD.

Datele noastre demonstrează o deformabilitate redusă a RBC în ambele modele de șoarece de nefropatie proteinurică, care poate fi direct legată de nivelurile crescute de Ca2+ citoplasmatice.⁴⁰ Împreună, aceste mecanisme ar putea acționa în comun pentru a facilita inducerea morții celulelor RBC și îndepărtarea RBC senescente și rănite din circulația sanguină.¹⁵În plus, am observat reprogramarea metabolică în aceste celule, care indică stresul oxidativ și remodelarea lipidelor membranare. Deși CoA și acil-CoA nu au fost măsurate direct în aceste probe, ele sunt transformate activ în RBC în acilcarnitine de către carnitin palmitoil transferaza.³⁶Nivelurile acumulate ale acestei din urmă clase de compuși indică activarea acestor mecanisme în nefropatie, deoarece acești metaboliți nu sunt transportați ușor prin membranele RBC.⁴¹ În sprijinul suplimentar, am observat acumularea în ambele modele de precursori CoA, inclusiv pantotenatul, care este preluat.⁴²și metabolizată⁴³de RBC, în paralel cu creșterea acizilor grași liberi și scăderea carnitinei libere. Interesant, am descoperit anterior că aceste modificări apar în asociere cu niveluri suprafiziologice de Ca2+ intracelular.¹⁶Deși aceste rezultate au fost generate ex vivo, raportăm aici răspunsuri similare in vivo. În plus, acilcarnitinele sunt capabile să moduleze direct proprietățile membranei⁴⁴și se corelează cu deformabilitatea RBC^,45, precum și hemoliza osmotică și oxidativă.⁴⁶Carnitina liberă neconjugată, promovează deformabilitatea membranei prin medierea interacțiunilor dintre proteinele membranei.⁴⁷ Observațiile noastre privind scăderea semnificativă a nivelurilor de carnitină în RBC de la șoarecii cu nefropatie, probabil din cauza consumului crescut pentru generarea de acilcarnitine, pot contribui la deteriorarea parametrilor reologici pe care i-am observat în paralel.

Descoperirile noastre sugerează mecanisme comune care duc la moartea eritrocitară la șoarecii cu deficit de DIN și podocină, care pot fi legate atât de proteinuria în intervalul nefrotic, cât și, mai important, de dezvoltarea unor boli severe.insuficiență renalăîn modelele de șoarece observate începând cu ziua 20. La om, CKD avansată cu RFG redus este un predictor puternic al anemiei,⁴⁸iar stimularea morții RBC ar putea fi legată de mediul uremic. Trebuie să recunoaștem că în CKD avansată, mulți factori și tulburări pot intra în joc și pot promova anemia asociată bolii renale. Contribuția proteinuriei grele la stimularea morții RBC rămâne neclară, dar, deși nu este dovedit, ar putea implica factori care se pierd în urină, cum ar fi transferrina sau alții care reglează metabolismul RBC.⁴⁹Până în prezent, tratamentul actual al anemiei asociate bolii renale se concentrează pe creșterea eritropoiezei prin substituție cu fier sau EPO,⁵⁰prin aplicarea de stabilizatori ai proteinei cu factor inductibil de hipoxie orală,⁵¹sau prin administrare orală sau iv de fier.⁵²Cu toate acestea, aceste tratamente nu iau în considerare creșterea mortalității RBC. Într-un studiu transversal anterior la pacienții cu hemodializă și dializă peritoneală, am constatat că pacienții cu un procent mai mare de eritrocite care expun PS au fost tratați cu doze mai mari de EPO.¹⁴ Prin urmare, ameliorarea morții celulelor RBC promite a fi o posibilă abordare terapeutică în tratarea anemiei asociate bolilor renale. În acest context, efectul inhibitor al diferiților agenți farmacologici asupra morții celulelor RBC53 necesită studii suplimentare pe oameni și pe animale.

În concluzie, metabolismul celular alterat contribuie la disfuncția RBC, la creșterea morții RBC și, prin urmare, la anemie la modelele de șoarece de CKD proteinurică, în ciuda nivelurilor crescute de EPO seric. Descoperirile acestui studiu pot explica parțial mecanismele anemiei asociate cu CKD la oameni.

Cistanche beneficiifuncțiile rinichilor și ajută la CKD.

DEZVĂLUIRE

Deși nu au legătură cu conținutul articolelor, ADA și TN sunt fondatorii Omix Technologies, Inc. Toți ceilalți autori au declarat că nu există interese concurente.

DECLARAȚIA DE DATE

Datele vor fi puse la dispoziție la cerere rezonabilă.

MULȚUMIRI

Autorii recunosc asistența tehnică expertă a Andreei Janessa. Aceste studii au fost susținute de un grant de la Fundația Germană de Cercetare către RB (BI 2149/2-1) și FA (AR 1092/2-2). LS a fost susținut de o bursă Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) de către facultatea de medicină a Universității din Tübingen. SMQ a fost susținut de resurse de la Canadian Blood Services. Ca o condiție a finanțării guvernului canadian, acest raport trebuie să conțină declarația „Opiniile exprimate aici nu reprezintă neapărat punctul de vedere al guvernului federal al Canadei”.

CONTRIBUȚIILE AUTORILOR

RB și FA au conceput studiul. Colectarea datelor a fost efectuată de RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M și BF.

Analizele statistice au fost efectuate de RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M și ADh; iar cifrele au fost generate de RB, TN, MZK, IG-M, LQ-M, BF și ADh. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, AS, TB, MS, ALB, FG, SMQ,

iar FA a interpretat datele. Manuscrisul a fost scris, revizuit și editat de RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ și FA.

MATERIAL SUPLIMENTAR

Fișier suplimentar (PDF)

Materiale și metode suplimentare.

Figura S1. Proiectarea experimentală a studiilor la șoareci 129S1/SvImJ și Nphs2Dipod.

Figura S2. Eliminarea expresiei podocinei și a semnelor distinctive ale sindromului nefrotic la șoarecii Nphs2Dipod.

Figura S3. Rata de supraviețuire redusă a celulelor roșii din sânge în sindromul nefrotic experimental la șoarecii Nphs2Dipod.

Figura S4. Morfologie alterată și deformabilitate redusă a celulelor roșii din sânge la șoarecii Nphs2Dipod.

Figura S5. Metabolomica indică acumularea de stres oxidativ și activarea remodelării lipidelor membranei în celulele roșii din sânge la șoarecii Nphs2Dipod.

Figura S6. Metabolomica indică un metabolism alterat în celulele roșii din sânge obținute de la șoareci 129S1/SvImJ.

Figura S7. Metabolomica indică o modificare a metabolismului în celulele roșii din sânge primite de la șoarecii Nphs2Dipod.

Figura S8. Stresul de forfecare la jumătate din deformabilitatea maximă a globulelor roșii (RBC) și sensibilitatea osmotică a RBC nu sunt semnificativ diferite la sindromul nefrotic primar și la pacienții avansati cu boală renală cronică (IRC).

REFERINȚE

1. Finkelstein FO, Story K, Firanek C, et al. Calitatea vieții și nivelul hemoglobinei legate de sănătate la pacienții cu boli renale cronice. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4:33–38.

2. Efstratiadis G, Konstantinou D, Chytas I, et al. Sindromul anemie cardio-renală. Hipocratia. 2008;12:11–16.

3. Staples AO, Wong CS, Smith JM, et al. Anemia și riscul de spitalizare în boala renală cronică pediatrică. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4: 48–56.

4. Kurella Tamura M, Vittinghoff E, Yang J, et al. Anemia și riscul de declin cognitiv în boala cronică de rinichi. BMC Nephrol. 2016;17:13.

5. Toft G, Heide-Jørgensen U, van Haalen H, et al. Anemia și rezultatele clinice la pacienții cu boală renală cronică severă nedependenți de dializă sau dependenți de dializă: un studiu populațional danez. J Nephrol. 2020;33:147–156.

6. Geddes CC. Fiziopatologia anemiei renale. Transplant Nephrol Dial. 2018;34:921–922.

7. Artunc F, Risler T. Concentrațiile serice de eritropoietina și răspunsurile la anemie la pacienții cu sau fără boală renală cronică. Transplant Nephrol Dial. 2007;22:2900–2908.

8. Erslev AJ, Besarab A. Eritropoietina în patogeneza și tratamentul anemiei insuficienței renale cronice. Rinichi Int. 1997;51:622–630.

9. Wish JB, Aronoff GR, Bacon BR și colab. Bilanțul pozitiv al fierului în boala cronică de rinichi: cât este prea mult și cum să spui? Sunt J Nephrol. 2018;47:72–83.

Howard RL, Buddington B, Alfrey AC. Excreția urinară de albumină, transferină și fier la pacienții diabetici. Rinichi Int. 1991;40:923–926.

Si etc.