Partea 4: Cartografierea interacțiunii epigenomice și transcriptomice în timpul formării și retragerii memoriei în ansamblul de engrame hipocampice
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 3
Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 5
ARN-sev
ul apă fără nucleaze), timp de 30 min la 37c cu balansare ușoară. Fragmentele de ADN crescute au fost amplificate și codificate cu bare folosind reacția PCR (1 ciclu; 5min – 72c, 30sec – 98c, 10 cicluri; 15sec – 98c, 30sec – 60c, 3min – 72c). Urmând protocolul producătorului, ADN-ul amplificat a fost curățat și purificat utilizând bile AMPure 1,8x (perle AmpureXP, Beckman Coulter, A63880). După QC al bioanalizatorului pentru dimensiunea și distribuția bibliotecii, bibliotecile au fost secvențiate pe platforma Illumina Nextseq 550 la Centrul MIT BioMicro.
Cistanche și Cistanches pentru îmbunătățirea memoriei
Analiza ATAC-seq — Datele brute fastq ale citirilor de secvențiere la capătul împerecheat de 40-bp au fost aliniate la genomul de referință mm9 al șoarecelui folosind Bowtie 2.0 în modul final de pereche50. Colecția Samtools51 a fost utilizată pentru a sorta, elimina duplicatele PCR (rmdup), indexa fișierele BAM (index) și calcula statisticile bibliotecii (flagstat, vezi Tabelul suplimentar 13). Fișierele BAM au fost subeșantionate de la citirile aliniate, împerecheate și unice corespunzător la 50M. Vârfurile cromatinei deschise au fost analizate utilizând software-ul MACS252. Regiunile cu acces diferențial (DAR) au fost identificate de Diffbind v1.16.353 cu parametrii și setările implicite pentru a utiliza DESeq2 (limită; FDR < 0,01;="" modificări="" ale="" ori=""> 1,5). Matricea completă a numărărilor normalizate (RPKM54) a fost preluată de pachetul DiffBind. Pentru o generație de piese de tip bigwig, fișierele de semnal de pileup (fragment pileup per milion de citiri) în format biografie au fost construite utilizând funcția MACS2 call peak cu steagurile -B –SPMR. Apoi, îmbogățirea pliului normalizat (FE) pe urmele lambda de intrare a fost generată folosind funcția bdgcmp a MACS2 cu setarea - m FE. Apoi fișierele bedGraph au fost convertite în format bigwig.
Instrumentele IGV55 au fost folosite pentru vizualizarea fișierelor mari. ChromHMM56 a fost folosit pentru a stabili un model de stare a cromatinei din două studii independente care au utilizat țesutul hipocampus în vrac înainte și după șocul piciorului21,22 și pentru a determina îmbogățirea DAR-urilor față de modelul de stare. Analiza îmbogățirii motivelor57,58 și adnotarea vârfurilor au fost efectuate de instrumentele HOMER59. Toate codurile sunt disponibile în fișierul software suplimentar. Extracția ARN și pregătirea bibliotecii - Urmează imediat fixarea și sortarea (vezi pregătirea țesuturilor), 4 ul de protează au fost adăugate în tamponul de digestie (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Life Technologies, AM1975) . Probele au fost incubate în blocuri de căldură timp de 15 minute la 50 grade, apoi 15 minute la 80 grade. Apoi, la fiecare probă s-au adăugat 0,75 ml de Trizol LS (reactiv TRIzol™ LS, Thermo Fisher Scientific, 10296028) și 0,2 ml de soluție de fenol: cloroform (fenol: cloroform: alcool izoamilic, 1 fază, VWR International, K169), urmat de agitare viguroasă timp de 5 minute la temperatura camerei (RT). Suspensia a fost plasată în tuburi grele cu gel Phase lock (PLG, 5 Prime, 2302830) și centrifugă la 13,000rpm timp de 5 minute. Faza acvatică cu acizi nucleici a fost extrasă din tuburi în tub Eppendorf proaspăt cu o cantitate egală de etanol 100%. Purificarea ARN a fost efectuată cu kitul Direct-zol™ ARN MicroPrep (Zymo Research, R2060) pentru purificarea ARN, conform instrucțiunilor producătorului. ARN-ul a fost eluat (10 ul, DEPC) și apoi stocat la -80 de grade. Kitul SMARTer Stranded Total ARN-Seq v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006) a fost utilizat pentru pregătirea și amplificarea bibliotecii. Au fost utilizate 3 replici biologice (N=3) pentru pregătirea bibliotecii. Bibliotecile au fost pregătite conform instrucțiunilor producătorului fără pas suplimentar de fragmentare (FFPE, opțiunea 2, vezi manual), cu epuizarea ADNc ribozomal și amplificare finală PCR (15 cicluri). Bibliotecile au fost secvențiate pe platforma Illumina HiSeq 2000 la Centrul MIT BioMicro.
Analiza ARN-seq - Datele brute rapide au fost aliniate la referința mm9 de șoarece
genomul folosind Bowtie 2.0. Citirile mapate din corpurile genelor (inclusiv citirile de exoni și introni) au fost procesate de Cufflinks 2.260 și DEseq261 cu adnotarea genei de referință UCSC mm9 pentru a estima abundența transcripției. Expresia genică diferențială și analizele în aval au fost efectuate folosind DEseq2 și script-uri R personalizate. Abundența relativă a transcrierilor a fost măsurată prin fragmente pe kilobază de exon per milion de fragmente mapate (FPKM).
Pentru analiza programelor transcripționale, expresia fiecărei gene a fost evaluată pentru diferitememoriefazele (Activat -devreme, Activat -tarziu, Reactivat) prin modificarea lor log2 ori (log2FC) din starea bazală. 1095 de gene exprimate diferențial (DEG) au trecut de criteriile de limită, în care am observat cel puțin într-o comparație a valorii P a< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">
Cistanche poate îmbunătăți memoria
Captarea conformației cromozomilor (Hi-C)
Nucleii din celulele fixate (vezi pregătirea țesuturilor) au fost sortați în tuburi Eppendorf de 1,5 mL care conțineau 500 ul tampon de liză proaspăt rece cu gheața (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 procente Igepal CA{{ 9}}, apă de calitate Pi și PCR) și congelate pe gheață carbonică și păstrate la -80c până când au fost utilizate. Bibliotecile Hi-C au fost preparate din 100,000 celule/per grup (colectate de la două animale) în două replici biologice, utilizând manualul kit-ului Dovetail™ Hi-C (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, SUA). Cele șase biblioteci Hi-C au fost secvențiate (terminat pereche) pe platforma Illumina Nextseq 500. Conducta HOMER Hi-C a fost folosită pentru a filtra artefacte experimentale, cum ar fi circularizarea, auto-ligaturile și duplicatele PCR. Citirile filtrate au fost aliniate la genomul șoarecelui de referință (mm9) și procesate în continuare folosind conducta HOMER HI-C.
Instrumentele HOMER Hi-C au fost folosite pentru a efectua analiza componentelor principale (PCA) pe datele Hi-C pentru a identifica compartimentele subnucleare (A și B) la rezoluție de 50 Kb (vezi software-ul suplimentar). Pentru analiza comutatorului de compartiment, am scăzut mai întâi valorile PC1 dintre grupuri. Apoi am identificat tranzițiile BtoA de sus ca regiuni cu PC1 se modifică peste percentila 90 și tranzițiile de sus AtoB ca regiuni cu PC1 se schimbă sub percentila a 10-a. Deoarece compartimentele subnucleare sunt reglementate ca unități de câteva sute de kilobaze, am consolidat segmente consecutive de 50 Kb AtoB sau BtoA care se aflau la o distanță de 100 Kb unul de celălalt. Domeniile consolidate care aveau o dimensiune totală mai mică de 200 Kb le-am aruncat. Comutatorul de compartiment a fost luat în considerare numai dacă o valoare negativă a fost transformată într-o valoare pozitivă (și invers). În cele din urmă, valorile pozitive și negative ale primei componente au fost comparate între toate cele trei populații de neuroni (bazal, activat - timpuriu și activat - târziu).
Captură promotor Hi-C
Urmează fixarea și sortarea (vezi pregătirea țesuturilor) celulele au fost sortate în tuburi Eppendorf de 1,5 ml care conțineau 500 ul tampon de liză proaspăt rece cu gheața (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 procente Igepal CA{ {9}}, apă de calitate Pi și PCR), congelată pe gheață carbonică și păstrată la -80c până când au fost utilizate. Bibliotecile Hi-C au fost pregătite din 10,000 celule /per grup (N{=3-4), așa cum s-a descris anterior62, cu unele modificări. Probele au fost centrifugate (4 grade, 1.600 g timp de 20 de minute) iar peletul a fost resuspendat în 400 ul de tampon Cutsmart 1,2x (New England Biolabs,
STATELE UNITE ALE AMERICII). Prima digestie de restricție a fost efectuată așa cum este descris în protocolul original cu 1.500 U de HindIII (R3104L, New England Biolabs, SUA), ca 6-cutter de bază (în loc de BglII în protocolul original). După marcarea cu biotină și ligatura peste noapte (a se vedea protocolul original pentru detalii), probele au fost centrifugate (4 grade, 1.600 × g timp de 15 minute) și peletul a fost resuspendat în 25 ul de PBS. Suspensia a fost incubată la 65c cu 3 ul de proteinază K timp de 12-16 ore. Purificarea ADN-ului Hi-C a fost efectuată așa cum este descris în protocolul original cu 100 ul de perle de streptavidină (Dynabeads M-280-streptavidin, Life Technologies, 11205D). Pentru a doua enzimă de restricție, am folosit 4-cuțitorul de bază Hpych4V (10 U/per probă, R0620S, New England Biolabs, SUA). După reacția A-tailing (a se vedea protocolul original pentru detalii), probele au fost amplificate folosind PCR (17 cicluri) și purificate cu bile AMPure XP. Bibliotecile Hi-C au fost eluate în 20 ul de 10 mM Tris-HCI (pH 8,5). Proiectarea sistemului de captare a momelii pentru Promoter Capture Hi-C – O listă de 5000 de promotori ai genei de șoarece a fost obținută din protocolul publicat anterior în Schoenfelder. et al.29. Lista conține doar transcrieri cu un biotip de regiuni care codifică proteine, cu situsuri de fragmente de restricție HindIII. Au fost proiectate două sonde de captură de 120 bp, câte una la fiecare capăt al fragmentului. Sondele au fost sintetizate de Agilent Technologies conform sistemului de îmbogățire a țintei SureSelect (Agilent Technologies).
Pregătirea și secvențierea bibliotecii de captare a promotorului Hi-C - Pentru a captura produse de ligatură Hi-C care conțin secvențe promotoare, am folosit protocolul publicat anterior29. Pe scurt, blocanții de hibridizare (Agilent Technologies) au fost adăugați la bibliotecile de ADN Hi-C. Tamponul de hibridizare și ARN-ul de momeală de captură au fost preparate conform instrucțiunilor producătorului (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Apoi, blocanții de ADN/hibridare din bibliotecă Hi-C au fost încălziți timp de 5 minute la 95 de grade, înainte de a scădea temperatura la 65 de grade. ADN-ul din bibliotecă Hi-C a fost amestecat cu tampon de hibridizare (preîncălzit timp de 5 minute până la 65 de grade) și, ulterior, cu sistemul de momeală de captare proiectat la comandă (preîncălzit timp de 3 minute până la 65 de grade), constând din 10,000 biotinilate ARN care vizează capetele fragmentului de restricție HindIII ale a 5000 de promotori ai genei de șoarece (Agilent Technologies, vezi Material suplimentar pentru proiectarea momelii de captură). După 24 de ore la 65 de grade în aparatul PCR, s-au efectuat tragerea biotinei (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) și spălările urmând protocolul de îmbogățire a țintei SureSelect (Agilent Technologies). După spălarea finală, bilele au fost resuspendate în 30 μL NEBuffer 2 fără eluare prealabilă a ADN-ului și a fost efectuată o PCR post-captură (patru cicluri de amplificare folosind primeri universali illumine) pe ADN-ul legat de margele prin ARN biotinilat. Bibliotecile Capture Hi-C au fost secvențiate la sfârșitul perechi (Nextseq 500, Illumina).
Analiza Hi-C de captare a promotorului – conducta HiCUP63 a fost folosită pentru a procesa citirile brute de secvențiere fastq. Această conductă a fost folosită pentru a mapa perechile de citit față de genomul șoarecelui (mm9), pentru a filtra artefacte experimentale (cum ar fi citirile circularizate și religaturile) și pentru a elimina citirile duplicate. Pentru datele pc-HiC, fișierele BAM rezultate au fost subeșantionate și procesate folosind versiunea CHiCAGO 1.2.064, urmând setările implicite pentru a apela interacțiuni semnificative. Detaliile complete ale acestei conducte sunt disponibile de la Babraham Bioinformatics
Cistanche poate îmbunătăți memoria
Injecție cu virus adeno-asociat stereotaxic
Șoarecii ArcCreERT2 au fost anesteziați cu avertină și pentru infuzie cu virus AAV9-EF1a-DIO-hChR{2-EYFP (Serotype5, obținut din miezul viral UNC). Mai întâi, a fost făcută o mică gaură în craniu deasupra hipocampului dorsal (față de Bregma: anterior-posterior −2.0 și mediolateral ± 1.5), o seringă Hamilton cu un ac 33-gauge a fost coborâtă. la -1,8 DV și 500 ηl de virus au fost infuzați cu un debit de 50 ηl pe minut în ambii hipocampi. Acul a fost retras, după o perioadă de 10 minute după injectare și șoarecii au fost lăsați să se recupereze timp de 4 zile.
