Partea Ⅱ Dezvoltarea unui test imunologic cu flux lateral de nanoparticule de europiu pentru detectarea NGAL în urină și diagnosticarea leziunii renale acute

Rezultate

1. Exprimarea și purificarea proteinei recombinate NGAL

Plasmida recombinantă pSecTag2A-NGAL a fost transfectată în celule CHO. Proteina NGAL-6×His este exprimată în principal în supernatantul celular și ulterior purificată de Ni Sepharose. Proteina NGAL recombinată purificată a fost obţinută la o puritate de aproximativ 95 la sută şi analizată prin SDS-PAGE cu o greutate moleculară aproximativă de 23,7 kDa (Fig. 1 A). Western blot a confirmat, de asemenea, expresia și purificarea proteinei recombinate NGAL (Fig. 1B).

2. Generarea de MAb

În primul rând, am comparat efectele tensiunii continue asupra perforației membranei celulare la diferite intensități de câmp electric, iar amplitudinea pulsului a fost de 400 V, 450 V, 500 și, respectiv, 550 V, pentru a optimiza schema de fuziune electrică. Conform rapoartelor anterioare, concentrația celulară are un impact semnificativ asupra eficienței fuziunii[16]. Suspensia mixtă de celule spline izolate și celule de mielom SP2/0 au fost transferate în camera de fuziune la diferite concentrații de aproximativ 2 × 106, 2 × 107 și 2 × 108 celule/mL. Eficiența fuziunii a fost cea mai mare la 450 V DC, iar concentrația optimă de celule a fost de 2 × 107 celule/mL (Fig. 2).

3. Caracterizarea MAbs

MAb-urile au fost purificate prin coloana de proteină A. MAb-urile purificate au fost separate cu 12% SDS-PAGE și au fost observate două benzi cu greutăți moleculare de 55 kDa și 25 kDa în condiții de reducere. Benzile clare de 170 kDa au fost observate în condiții nereducătoare, care este proteina intactă a 2F4 și 1G1 (Fig. 3 A). Western blot a indicat că toate MAb-urile se leagă în mod specific la proteina NGAL umană (Fig. 3B). După electrofuziunea celulelor și sub-clonarea, supernatanții hibridoamelor au fost detectați prin ELISA indirectă cu NGAL-6×His și PCT- 6×His pentru a asigura legarea specifică a anticorpilor la NGAL. Două hibridoame foarte pozitive (1G1, 2F4) cu legare specifică NGAL, fără reacție încrucișată la PCT-6×His au fost selectate cu succes pentru producerea și purificarea MAbs (Fig. 3 C). Pentru a detecta afinitatea a doi MAb, interacțiunea dintre anticorpii cu concentrații diferite și proteina NGAL a fost analizată prin sistemul BIAcore T200. Diagrama cinetică a arătat că afinitatea lui 2F4 și 1G1 a fost 4,5 × 10− 7 și, respectiv, 6,0 × 10− 7 (Fig. 3D). Izotipurile acelor două MAb care au fost detectate de truse comerciale au fost IgG1. Rata de blocare a împerecherii 2F4 și 1G1-HRP a fost de 63% prin detectarea cELISA, ceea ce indică faptul că aceștia au recunoscut epitopi diferiți.

4. Proceduri EU-NPS-LFIA

Pe baza EU-NPS ca etichete și imunotestul de tip sandwich, LFIA a fost stabilit pentru detectarea NGAL. MAb 2F4 a fost acoperit pe o membrană de nitroceluloză și împerecheat cu EU-NPS-1G1 pe baza împerecherii anticorpilor într-o platformă de imunocromatografie cu flux lateral. După cum este ilustrat schematic (Fig. 4), TL și CL ale membranei de nitroceluloză au fost acoperite cu MAb 2F4 și IgG anti-șoarece de capră. EU-NPS-1G1 a fost etichetat pe tamponul conjugat. Proba care conține antigenul NGAL a migrat către tamponul conjugat pentru a se combina cu EU-NPS-1G1 și a forma complexe antigen-anticorp. Ulterior, complexele au fost capturate de mAb 2F4 în linia T în timp ce migrează pentru a forma complexe sandwich. Excesul de complex a fost combinat cu IgG anti-șoarece de capră. Benzile de testare au fost măsurate cu un detector de fluorescență după 15 minute.

5. Evaluarea performanțelor

Perechile de anticorpi (2F4- labeld1G1) ca anticorpi detector și captură au fost utilizate pentru a stabili imunocromatografice fluorescente, iar performanța analitică a EU-NPS-LFIA au fost evaluate prin construirea curbei standard. Raportul relativ al intensității fluorescenței (HT/HC) a fost crescut cu concentrația NGAL. EU-NPS-1G1 a arătat o reacție la mAb 2F4 (Fig. 5 A). Influența cârligului cu doze mari nu a fost detectată când concentrația de antigen a atins 3000 ng/mL. Ecuația de regresie a fost prezentată după cum urmează: y=0.0012 x plus 0,0059 (R{2=0.99), unde y reprezintă raportul HT/HC și x reprezintă concentrațiile de NGAL (Fig. 5B). Limita de detecție (LOD) a fost de 0,36 ng/mL (de 3 ori abaterea standard a martor, n=20) calculată de Ghidul EP17-A2 de Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), concentrația NGAL a avut o relație liniară în intervalul de 1-1500 ng/mL[17].

6. Precizie

Au fost efectuate experimente de recuperare a intra-testului și intertestului pentru a evalua precizia și reproductibilitatea metodei imunologice. Diferitele concentrații (50, 200 și 800 ng/mL) de substanță standard NGAL au fost adăugate la probele de urină negative. Precizia intra-test a fost calculată cu trei replici la fiecare concentrație sporită într-o zi, iar precizia inter-testare a fost calculată cu trei replici la fiecare concentrație sporită la fiecare trei zile timp de cincisprezece zile continuu[18]. Rezultatele au fost prezentate în Tabelul 1, coeficientul de variație intratest (CV) calculat a variat de la 2,57 la 4,98 la sută (n=10), mai mic de 10 la sută. CV-ul inter-testare a variat între 4,11 și 7,83 procente (n=15), de asemenea, mai mic de 10 procente.

Precizia intra-test și inter-testare au fost verificate de două dispozitive de evaluare (Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd și Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd), iar rezultatul este în cele din urmă consistent. Aceste rezultate au explicat că precizia LFIA dezvoltat a fost la un nivel ridicat, iar reproductibilitatea a fost la un nivel acceptabil.

Click aici pentru a cumparaSuplimente de Cistanche

7. Specificitatea

Specificitatea benzilor de testare a fost evaluată prin adăugarea de substanțe endogene în concentrații normale și diferite de probe de urină, inclusiv creatinina, glucoză și azot ureic. După cum se arată în Tabelul 2, rezultatele au indicat că toate abaterile relative (DR) au fost în intervalul de ± 10 la sută, sugerând că interacțiunea antigen-anticorp a fost stabilă și ilustrând specificitatea benzilor de testare a fost acceptabilă față de NGAL.

8. Teste cu probe clinice

Pentru a evalua competența aplicativă a NGAL pe baza EU-NPS-LFIA pentru determinarea probelor clinice, un total de 83 de probe de urină conținând 26 de probe de valoare mică (11–70 ng/mL), 19 mediană probe de valoare (110–800 ng/mL), 38 de probe de mare valoare (800–1740 ng/mL), au fost măsurate cu testul ARCHITECT de urină NGAL. Rezultatele coeficientului de corelație (R2 ) al curbei de regresie au fost 0,9829 (p < 0,01), indicând faptul că cele două metode de detecție au avut o relație liniară semnificativă (unde x reprezintă concentrațiile de NGAL obținute de analizorul ARCHITECT, y reprezintă valorile măsurate prin benzi de testare dezvoltate) (Fig. 6). Astfel, EU-NPS-LFIA dezvoltat pentru determinarea NGAL a fost foarte precis în testarea clinică.

Discuţie

EU-NPS-LFIA pentru detectarea NGAL în urina umană și diagnosticarea AKI a fost dezvoltat în studiul nostru. Diagnosticul actual de AKI este confirmat de concentrația creatininei serice (sCr), care este constantă, cu excepția cazului în care cel puțin 50% din funcția renală afectată[19]. AKI s-a dezvoltat la 89% dintre pacienții severi cu COVID-19, iar majoritatea pacienților au avut predominant oligurie când apare mai devreme decât creatinina plasmatică[20]. Biomarkerii au crescut niveluri crescute la internare, ceea ce este asociat cu o mortalitate crescută. NGAL este unul dintre acești biomarkeri, ale căror niveluri pot fi corelate pozitiv cu riscul de mortalitate la pacienții spitalizați cu COVID-19[21]. În AKI, mai multe studii au descoperit că concentrația NGAL în urină este asociată semnificativ cu concentrația sCr[22]. În ultimii ani, au fost dezvoltate diverse metode electrochimice și imunologice pentru detectarea NGAL, cazuri de determinare electrochimică, test de ligatură de proximitate în fază solidă și imunotest electrochimic fără enzime[23, 24]. Cu toate acestea, aceste tehnici necesită echipament precis, personal specializat și interpretare profesională a rezultatelor. Prin urmare, dezvoltarea unui test de detecție eficient și convenabil pentru concentrația NGAL în urină este critică pentru monitorizarea acestei tulburări. Eficiența scăzută a fuziunii polietilenglicolului (PEG) în metodele convenționale provoacă dificultăți în obținerea de anticorpi funcționali, am optimizat parametrii de fuziune electrică care au permis îmbunătățirea eficienței fuziunii pentru a prepara hibridoame viabile și am obținut doi MAb anti-NGAL. MAb-urile nu sunt doar de mare afinitate, ci sunt și direcționate către diferiți epitopi, utilizați pentru a stabili un test de diagnostic de înaltă calitate.

Herba Cistanche

În ultimii ani, multe studii au fost raportate că au dezvoltat mai multe teste imunodiagnostice rapide NGAL, inclusiv imunosenzorul fotoelectrochimic și trei imunosenzori electrochimici, testul de ligatură de proximitate în fază solidă și testul de flux lateral [25]. Într-un studiu, imunosenzorul a fost realizat de anticorpi de captură NGAL imobilizați la un electrod de carbon modificat prin serigrafie și adăugarea etichetată a anticorpului secundar împotriva NGA la nanofoile g-C3N4 decorate cu PB-NP formând un sandwich pe SPCE [24]. Celălalt studiu a dezvoltat un anticorp împotriva NGAL care a fost imobilizat pe un electrod serigrafic (SPCE) modificat cu anilină electropolimerizată depusă deasupra unui electrospray grafen/poli-anilină (G/PANI)[25]. Două rapoarte au arătat că LOD a variat foarte mult de la 0.6 pg/mL la 21,1 ng/mL, în funcție de nanofoile g-C3N4 cu elementul N îmbunătățit eficiența electrocatalitică a nanohibrizilor decât nanofoile de grafen și LOD al NGAL testul variază în funcție de imunosenzor, complex conjugat și anticorpi[26]. Conform acestor studii, ne-am lămurit că sensibilitatea LFIA ar putea fi îmbunătățită bazându-ne pe diferite nanoparticule de fluorescență menționate în secțiunea de preambul. Nanoparticulele de înaltă sensibilitate etichetate în LFIA ca sonde fluorescente au fost cercetate continuu în ultimele decenii, nanoparticulele de aur sunt cele mai utilizate, dar aplicarea testelor de curgere laterală bazate pe etichete tradiționale este limitată la identificarea lor slabă și semnalul mai slab. 27]. În prezent, există anticorpi disponibili pentru dezvoltarea NGAL, care au fost aplicați pe diferite platforme pentru detectarea NGAL, dar nu sunt disponibili în LFIA pe baza etichetelor EU-NPS experimentate pe detectarea NGAL în plus față de analiza de flux lateral bazată pe tehnologia UCP [28] , 29].

Testele imunologice cu fluorescență au un avantaj în diverse domenii de detectare, în special în punctele cuantice mature, sensibilitatea lor a fost influențată de MAb și materiale fluorescente și s-ar putea îmbunătăți considerabil de EU-NPS și MAb specifici pentru a utiliza sondele fluorescente[30 ]. EU-NPS au fost aplicate benzilor de fluorescență LFIA care s-au maturizat în domeniul de detecție și au sporit câteva avantaje ale LFIA pentru sensibilitatea, specificitatea și stabilitatea testului[31]. Datorită proprietăților excelente ale EU-NPS, limita de detecție pentru NGAL în această metodă a fost de 0.36 ng/mL, în timp ce nivelurile medii ale NGAL din urină au fost de aproximativ 7,0 ng/mL la persoanele sănătoase[32] . Dezvoltarea și aplicarea EU-NPS-LFIA a NGAL sunt încă în faza inițială, acest test trebuie să testeze NGAL de probe de ser și urină cu pacienți cu COVID-19 pentru care se îmbunătățește tratamentul în viitorul lucrărilor .

Concluzii

În studiu, am obținut cu succes doi MAb anti-NGAL de șoarece (2F4, 1G1) și am fost etichetați cu EU-NPS pentru a stabili tehnica imună a fluxului lateral. S-a descoperit că EU-NPSLFIA detectează NGAL într-o gamă largă de 1- 3000 ng/mL în 15 minute, sensibilitatea de detectare a atins 0,36 ng/mL. Acești MAb anti-NGAL ar putea fi utilizați în mod fiabil în LFIA fluorescentă a detectării NGAL în probele de urină, așa că ar trebui să fie aplicabile în diagnosticul AKI.

Cistanche tubulosa

Eficacitatea extractului de Cistanche asupra leziunilor renale acute

Leziunea renală acută (AKI), cunoscută și sub numele de insuficiență renală acută, este o afecțiune medicală frecventă asociată cu o scădere bruscă a funcției renale. AKI poate provoca morbiditate și mortalitate semnificativă, mai ales dacă este lăsată netratată. Ca atare, diagnosticarea precoce și tratamentul prompt sunt esențiale pentru a îmbunătăți rezultatele pacientului.

Extractul de Cistanche, derivat din planta Cistanche deserticola, a fost folosit în medicina tradițională chineză pentru a trata diverse afecțiuni de sănătate. Cercetări recente au arătat că extractul de Cistanche poate fi promițător în tratamentul AKI.

Studiile au identificat mecanisme potențiale prin care extractul de Cistanche își exercită efectele terapeutice asupra AKI. Acestea includ suprimarea inflamației, reducerea stresului oxidativ, reglarea în jos a căilor apoptotice și promovarea regenerării tisulare. În plus, sa demonstrat că extractul de Cistanche previne progresia fibrozei renale, care poate apărea ca urmare a AKI.

Studiile pe animale sugerează că administrarea extractului de Cistanche are un efect protector asupra funcției renale în modelele de AKI, ceea ce duce la îmbunătățirea ratei de filtrare glomerulară, reducerea leziunilor celulelor tubulare și scăderea nivelului de azot ureic din sânge și a nivelurilor de creatinine serice. Studii ulterioare în practica clinică pe subiecți umani indică o creștere a debitului de urină și a ratei de filtrare glomerulară (RFG), prevenind în același timp creșteri suplimentare ale nivelurilor serice de azot ureic și creatină la pacienții cu AKI asociată intervenției chirurgicale cardiace.

Cu toate acestea, rămân câteva întrebări cu privire la dozele ideale, profilurile de siguranță pe termen lung și standardizarea preparatelor. Sunt necesare studii suplimentare controlate randomizate de înaltă calitate pentru a evalua doza optimă și regimul de administrare al extracției de Cistanche.

În general, dovezile sugerează că extractul de Cistanche poate fi o terapie eficientă pentru AKI, deși sunt necesare cercetări și teste suplimentare extinse pentru recomandări mai definitive. În concluzie, în ciuda unor limitări, extractul de Cistanche arată potențialul de reducere a severității AKI. Detectarea precoce și tratamentul prompt pot îmbunătăți rezultatele pacientului și calitatea vieții. Pacienții trebuie să se consulte cu furnizorii de asistență medicală înainte de a se angaja în terapii alternative pentru a asigura siguranța și a evita orice efecte adverse.

Efectele lui Cistanche

Referințe

15. Huang X, Aguilar Z, Xu H, Lai W, Xiong Y: bandă imunocromatografică cu flux lateral pe membrană cu nanoparticule ca reporteri pentru detectare: o revizuire. Biosenzori bioelectronics 2016, 75:166–180.

16. Weeratna R, Comanita L, Davis H: CPG ODN permite o doză mai mică de antigen împotriva antigenului de suprafață al hepatitei B la șoarecii BALB/c. Immunology cell biology 2003, 81(1):59–62.

17. Tong Q, Chen B, Zhang R, Zuo C: Standardizarea analizei clinice a enzimelor folosind bazine de ser uman congelat cu valori atribuite de procedurile de măsurare de referință ale Federației Internaționale de Chimie Clinică și Medicină de Laborator. Scandinavian Journal of clinical laboratory investigation 2018, 78:74–80.

18. Huang D, Ying H, Jiang D, Liu F, Tian Y, Du C, Zhang L, Pu X: Detectarea rapidă și sensibilă a interleukinei-6 în ser prin imunotest cu flux lateral rezolvat în timp. Biochimie analitică 2020, 588:113468.

19. Shapiro N, Trzeciak S, Hollander J, Birkhahn R, Otero R, Osborn T, Moretti E, Nguyen H, Gunnerson K, Milzman D și colab: The diagnostic accuracy of plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin in the prediction of acute kidney leziuni la pacienții din secțiile de urgență cu suspiciune de sepsis. Analele medicinei de urgență 2010, 56(1):52–59.e51.

20. Luther T, Bülow-Anderberg S, Larsson A, Rubertsson S, Lipcsey M, Frithiof R, Hultström M: Pacienții cu COVID-19 aflați la terapie intensivă dezvoltă preponderent leziuni renale acute oligurice. Acta anesthesiologist Scandinavica 2021, 65(3): 364–372.

21. Abers M, Delmonte O, Ricotta E, Fintzi J, Fink D, de Jesus A, Zarember K, Alehashemi S, Oikonomou V, Desai J: An immune-based biomarker signature is associated with mortality in COVID-19 pacientii. JCI Insight 2021, 6(1).

22. Wagener G, Jan M, Kim M, Mori K, Barasch J, Sladen R, Lee H: Asociere între creșterea lipocalinei asociate cu gelatinaza neutrofilă urinară și disfuncția renală acută după intervenția chirurgicală cardiacă la adulți. Anesthesiology 2006, 105(3):485–491.

23. Kannan P, Tiong H, Kim D: Determinarea electrochimică foarte sensibilă a lipocalinei asociate cu gelatinaza neutrofilă pentru leziunea acută a rinichilor. Biosenzori bioelectronics 2012, 31(1):32–36.

24. Zhang F, Zhong H, Lin Y, Chen M, Wang Q, Lin Y, Huang. lipocalină asociată. Mikrochimica acta 2018, 185(7):327.

25. Yukird J, Wongtangprasert T, Rangkupan R, Chailapakul O, Pisitkun T, Rodthongkum N: Imunosenzor fără etichetă bazat pe nanocompozit grafen/polianilină pentru detectarea lipocalinei asociate cu gelatinaza neutrofilă. Biosenzori bioelectronics 2017, 87:249–255.

26. Gong Y, Li M, Wang Y: Nitrura de carbon în conversia și stocarea energiei: progrese și perspective recente. ChemSusChem 2015, 8(6):931–946.

27. Chen A, Yang S: Înlocuirea anticorpilor cu aptameri în imunotestul cu flux lateral. Biosenzori bioelectronics 2015, 71:230–242.

28. Li H, Mu Y, Yan J, Cui D, Ou W, Wan Y, Liu S: Imunosenzor fotoelectrochimic fără etichete pentru lipocalină asociată gelatinazei neutrofile, bazată pe utilizarea nanocorpilor. Chimie analitică 2015, 87(3): 2007–2015.

29. Lei L, Zhu J, Xia G, Feng H, Zhang H, Han Y: Un test rapid și ușor de utilizat pentru a detecta lipocalina asociată cu gelatinaza neutrofilă (NGAL) folosind nanoparticule de conversie ascendentă. Talanta 2017, 162:339–344.

30. Yeo S, Bao D, Seo G, Bui C, Kim D, Anh N, Tien T, Linh N, Sohn H, Chong C și colab.: Îmbunătățirea unei aplicații de diagnosticare rapidă a anticorpilor monoclonali împotriva virusului subtipului gripei aviare H7 folosind Nanoparticule de europiu. Rapoarte științifice 2017, 7(1):7933.

31. Chen E, Xu Y, Ma B, Cui H, Sun C, Zhang M: MonascusCarboxylFunctionalized, Europium Nanoparticle-Based Fluorescent Imunocromatographic Test for Sensitive Detection of Citrin in Fermented Food. Toxinele 2019, 11(10).

32. Bolignano D, Coppolino G, Campo S, Aloisi C, Nicocia G, Frisina N, Buemi M: Neutrophil gelatinase-associated lipocalin in patients with autosomal dominant polychystic kidney disease. Jurnalul American de Nefrologie 2007, 27(4):373–378.

Moli Yin 1 , Yuanwang Nie 2 , Hao Liu 2 , Lei Liu 1 , Lu Tang 1 , Yuan Dong 2 , Chuanmin Hu 1 și Huiyan Wang 1

1 Jilin Collaborative Inovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR China.

2 Academia de Laborator, Universitatea de Medicină Jilin, 132013 Jilin, PR China.