PARTEA Ⅰ: Efectele condițiilor de mediu asupra numărului de nefron
Mar 20, 2022
pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com
PARTEA Ⅰ: Efectele condițiilor de mediu asupra numărului de nefron: modelarea bolii materne și a reglării epigenetice în dezvoltarea renală
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse și colab.
1. Introducere
Dezvoltarea fătului este afectată de mediul in utero, iar un mediu advers poate predispune la boli precum hipertensiunea arterială, bolile cardiovasculare și bolile cronice de rinichi mai târziu în viață [1-4]. O serie de tulburări intrauterine pot duce la o reducere a dotării nefronilor și la compromisul funcției renale la descendenți. La rozătoare, afecțiunile care conduc la scăderea numărului de nefroni la naștere includ restricția de creștere intrauterină (RCIU), dieta cu conținut scăzut de proteine a mamei, medicamente (inclusiv corticosteroizi sau medicamente antiinflamatoare nesteroidiene), mutații monogenetice și niveluri scăzute de vitamina A, precum și diabet matern matern. și deficit de fier [5-10]. La om, în prezent nu există o metodă neinvazivă de măsurare a numărului de nefroni. Cu toate acestea, studiile postmuritoare au demonstrat o corelație negativă între numărul de nefroni și tensiunea arterială [4,11]. În plus, se știe că afecțiunile intrauterine asociate cu un număr redus de nefroni, cum ar fi IUGR, sunt asociate cu rate crescute de hipertensiune arterială și CKD[12].
Experimentele in vivo în care condițiile intrauterine adverse sunt induse artificial la animalele gestante s-au dovedit neprețuite pentru detectarea și descrierea modificărilor renale induse la descendenți. Cu toate acestea, orice intervenție experimentală în timpul gestației are ca rezultat modificări complexe ale fiziologiei materne, placentare și fetale care pot afecta ele însele mediul metanefroiului în curs de dezvoltare. Tehnicile de modelare ex vivo ocolesc acest lucru, permițând investigarea dezvoltării rinichilor complet separat de influența animalului mamă, a placentei sau a altor organe ale fătului. Culturile izolate de metanefroi pe o interfață cu aer mediu au fost efectuate inițial de Trowell în 1950 [13] și ulterior au fost rafinate prin cultivarea rinichilor pe membrane filtrante[14], oferind o bază pentru condițiile de cultură cu o singură variabilă.
În rezumat, există un număr tot mai mare de dovezi care sugerează că insultele prenatale asociate cu un număr scăzut de nefroni sunt relevante pentru factorii de risc pentru hipertensiune arterială și CKD. Pentru a dezvolta strategii preventive care să asigure o dotare adecvată a nefronilor la naștere, este necesară o înțelegere mecanică a factorilor care influențează dezvoltarea renală și nefrogeneza. În lucrarea de față, cultura de organe metanefrice a fost folosită pentru a modela diferite aspecte ale reglementării mediului pentru a studia efectele acestora asupra creșterii renale și posibilele implicații pentru funcția renală pe termen lung și a fost utilizată pentru a screening-ul pentru regulatorii epigenetici folosind compuși mici aprobați de FDA.
Click pentru produse Cistanche herba pentru funcția renală
2. Rezultate
2.1. Utilizarea culturilor de organe metanefrice pentru a studia efectul condițiilor de mediu asupra dezvoltării renale
Pentru a modela condițiile de mediu nefavorabile, rinichii din ziua embrionară (E) 12,5 embrioni au fost cultivați la interfața cu aer mediu (Figura 1A). Pentru a facilita monitorizarea nefronului și dezvoltării glomerulare, Six2. Cre și Pod. Au fost folosiți șoareci reporter Cre dual-fluorescenți, respectiv (Figura 1B, C). O afecțiune comună în timpul sarcinii este febra, care afectează mai mult de 10% dintre sarcini în primele 16 săptămâni de gestație [15]Caldura este un teratogen bine caracterizat, iar hipertermia în timpul sarcinii s-a dovedit că duce la avort fetal, întârziere de creștere, și defecte de dezvoltare, cum ar fi agenezia renală, hipoplazia și greutatea mică la naștere la mai multe specii [16-21]. Pentru a evalua impactul condițiilor hipertermice prelungite cu febră asupra creșterii rinichilor și formării nefronilor, rinichii au fost izolați și menținuți fie la 37, fie la 40 de grade (Figura 1D). După 7 zile de cultură, rinichii cultivați la 40C au fost, în medie, cu 18,36 la sută mai mici decât omologii lor cultivați în condiții fiziologice (Figura 1E). Cu toate acestea, nu a fost găsită nicio diferență semnificativă în numărul de glomeruli per rinichi între grupuri (Figura 1F). Cu toate acestea, scăderea creșterii globale a rinichilor demonstrează un efect negativ al temperaturii crescute asupra creșterii metanefrice.
Se estimează că 19% dintre femeile însărcinate suferă de anemie prin deficit de fier [22], deficitul de fier este una dintre cele mai răspândite afecțiuni cu potențialul de a perturba dezvoltarea renală [23]. Datele in vivo au arătat că creșterea renală, numărul glomerular și absorbția renală de fier sunt reduse în timpul sarcinilor afectate de deficitul de fier matern [24]. Pentru a evalua impactul reducerii aportului de fier legat de transferină asupra creșterii rinichilor și nefrogenezei, explantele au fost cultivate într-un mediu care conține 50 ug/mL de holo-transferină saturată cu fier sau 50 ug/mL de apo-transferină sărăcită în fier, respectiv. Rinichii cu restricții de fier au rămas mult mai mici decât omologii lor suficienți în fier și au prezentat apoptoză crescută în mugurii ureterici și ramificare și proliferare redusă a mugurilor ureterelor (Figura 1G, Figura suplimentară S1A-F). În timp ce populația de nefron a fost neafectată morfologic, a putut fi observată o scădere a părții distale în curs de dezvoltare a nefronului, precum și a tubilor distali (Figura 1H, I, Figura suplimentară S1G-J). Rinichii cu deficit de fier au fost, în medie, 47,9% din dimensiunea omologilor lor cultivați cu holo-transferină (Figura 1) și au arătat o reducere a numărului total de glomeruli per rinichi de 69,9% după 7 zile de cultură (Figura 1K) . Astfel, epuizarea fierului de către apo-transferină a arătat efecte severe asupra creșterii rinichilor cu un fenotip de nefrogeneză total proximală.
Figura 1. Utilizarea culturilor de organe metanefrice pentru a studia efectul condițiilor de mediu asupra dezvoltării renale.(A) Creasta urogenitală de la embrionii de șoarece E12.5 (panoul din stânga) a fost extrasă microchirurgical (al doilea panou), iar rinichii au fost izolați (al treilea panou) și plasați pe inserții Transwell (panoul din dreapta). Bare de scară∶ 1 mm (panoul din stânga), 500 μm (al treilea panou). (B) Șoarecii transgenici cu expresie dublă Tomato/EGFP au fost utilizați pentru etichetarea condiționată a celulelor Six2-pozitive și a descendenților lor folosind Six2. Cre sau (C) celule pozitive pentru podocină folosind Pod. Cre soareci. (D) Explantele din același embrion au fost cultivate timp de 7 zile la 37 sau 40 de grade. Bare de scară∶ 500 μm. （E） Suprafața explantelor cultivate timp de 7 zile la 37 sau 40 de grade .n=40 perechi, test t pereche, medie±SD.(F) Numărul de glomeruli din grupurile de explante după 7 zile.n{{ 17}} perechi, test t pereche, medie ±SD. （G） Explantele din același embrion au fost cultivate timp de 7 zile într-un mediu care conține holo-Tf sau apo-Tf. Bare de scară∶ 500 μm. (H) Imaginile pe câmp larg ale perechii de explante de cultură holo-Tf și apo-Tf colorate împotriva SIX2 și E-cadherină după 48 de ore de cultură arată un grup normal de celule progenitoare și defecte în morfologia nefronului timpuriu. Bară de scară ∶ 100 μm. (I) Imagini cu câmp larg ale perechii de explant cultivate cu holo-Tf și apo-Tf colorate împotriva WT1 și JAG1. Bare de scară∶100 μm. （） Suprafețele explantelor cultivate cu holo-Tf și apo-Tf după 7 zile.n=30 perechi, test t pereche, medie ± SD.(K) Numărul de glomeruli din grupurile de explante după 7 zile.n =17 perechi, test t pereche, medie ± SD.
2.2. Ex Vio Expunerea ridicată la glucoză duce la modificări asociate nefropatiei diabetice în rinichiul în curs de dezvoltare
Diabetul matern este o altă afecțiune comună în timpul sarcinii, cu o prevalență globală a hiperglicemiei în sarcină de ~ 17% și peste 20 de milioane de născuți vii în fiecare an [25]. S-a demonstrat că diabetul indus la modelele de șoarece și șobolan duce la descendenți cu un număr mai mic de nefroni [10,26,27]. Cultura de organe metanefrice a fost folosită înainte pentru a studia efectul glucozei ridicate asupra dezvoltării renale [27-29]. Anterior, am raportat o reducere a dimensiunii, a numărului de nefroni și a metilării ADN-ului în condiții de glucoză ridicată de 55 mM [30]. Spre deosebire de datele publicate [28], nu a putut fi observat niciun efect asupra dimensiunii explantelor sau numărului glomerular în probele noastre atunci când sunt cultivate în medii diferite de glucoză de 30 mM, comparativ cu condițiile de control de 5 mM după 7 zile (Figura suplimentară S2A, B). În plus, nu a putut fi detectată nicio scădere a metilării ADN-ului la LINE-1 și a site-urilor satelit importante (Figura suplimentară S2C, D). Efectul glucozei ridicate de 55 mM asupra dezvoltării renale după o cultură în perioada de 7-zi a fost analizat în continuare, arătând o scădere a ratei de creștere începând cu ziua 3 în cultură (Figura 2A, B). Colorațiile prin imunofluorescență nu au arătat defecte morfologice ale grupului de celule progenitoare SIX2-pozitive (Figura 2C), dar au arătat o colorare redusă a podocalixinei markerului podocitelor (PODXL, Figura 2D). S-a descoperit că glomerulii conțin o matrice bazală glomerulară îngroșată vizibilă în colorațiile histologice (Figura 2E). Descoperiri similare au fost făcute în microscopia electronică, arătând o creștere a grosimii membranei bazale glomerulare (Figura 2F), unul dintre cei mai timpurii markeri de pre-diabet și nefropatie diabetică (DN)[31,32], în cinci rinichi din șase și niciunul. din șapte rinichi de control al litermate. Pentru a dezvălui în continuare modificările transcriptomului, a fost efectuată o analiză a expresiei genelor diferențiale în perechi (DGE) a culturilor de rinichi din trei pui, cu un rinichi din fiecare embrion cultivat cu glucoză ridicată și celălalt cu mediu de control și rinichii reuniți pentru analiză ( n=3).DGE a confirmat reglarea în sus a componentelor matricei extracelulare ca proces biologic primar reglat în sus (Tabelul suplimentar S1). Genele reglate în jos au fost implicate în principal în activarea celulelor (imune) și exocitoză/secreție (Tabelul suplimentar S1). Ontologia fenotipului mamiferelor a indicat morfologia anormală a cortexului renal și a corpusculului renal din cauza genelor reglate în jos, cum ar fi Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb și Vegfa (Tabelul suplimentar S1). Expresia renală a mai multor gene, cum ar fi Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa și Txnip, care s-a dovedit a fi suprareglate în nefropatia diabetică [33-36], s-a dovedit a fi crescută în condiții de hiperglicemie. Pentru a compara profilul de expresie genetică a culturii renale cu glucoză ridicată cu DN-ul uman, datele DGE au fost corelate cu datele umane din glomeruli și tubulii microdisecați din biopsiile pacienților cu nefropatie diabetică de la Banca Europeană de ADNc renal (ERCB). Din cele 216 gene reglate diferențial potrivite după analiza lotului, 94 de gene au fost reglate diferențial în mod corespunzător în fracțiile glomerulare și/sau tubulare (Figura 2G). Suprapunerea modelului nostru și a DNgenelor umane a arătat 40 din 95 de gene suprareglate în glomeruli și 34 de gene în tubuli (25 de gene în comun) (Figura 2H). Genele au fost implicate în cea mai mare parte într-o organizare a matricei extracelulare (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) și adeziunea celulară (ITGBL1, CLDN15). În plus, genele asociate diabetului, cum ar fi TXNIP, SPON2 și PAPPA, au fost reglate. Din 120 de gene reglate în jos din culturile de rinichi, 22 au fost, de asemenea, reglate în jos în glomeruli și 39 au fost, de asemenea, reglate în jos în tubuli (16 în comun (Figura 2I). Aceste gene au fost implicate ca răspuns la stimulul endogen (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), dezvoltarea epiteliului nefron (PTPRO, PODXL, VEGFA) și reglarea pozitivă a chemotaxiei celulelor endoteliale (LGMN, P2RX4, VEGFA).În plus, genele asociate diabetului zaharat, cum ar fi RASGRP3, SIRPA, GATM și ESM1 au fost reglate în jos. 37-39]. Genele reglate diferențiat care nu se suprapun cu datele ERCB au reflectat și modificări asociate diabetului, cum ar fi matricea extracelulară (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) sau diabetul gestațional (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1) Astfel, dezvoltarea renală în condiții de glucoză ridicată a prezentat asemănări remarcabile cu nefropatia diabetică la adulți uman.
Figura 2. Ex vivo ex vivo ridicat la glucoză duce la modificări asociate nefropatiei diabetice în rinichiul în curs de dezvoltare.(A) Rinichi embrionari din Pod.Cre; Animale de tomate/EGFP cultivate timp de 7 zile în condiții de glucoză scăzută (LG, 5,5 mM -D-glucoză, 55 mM manitol) sau glucoză ridicată (HG, 55 mM -D-glucoză). Bară de scară: 500 um.(B)Aria suprafeței rinichilor afecțiunilor HG și LG.*,p=0,0474;*,p=0,0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ex Vivo Expunerea ridicată la glucoză influențează formarea memoriei pe termen lung prin metilarea ADN-ului
Pentru a înțelege în continuare modificările moleculare mediate de un mediu hiperglicemic, culturile de rinichi au fost cultivate în condiții de glucoză ridicată timp de 3,5 zile și apoi au fost schimbate în condiții de glucoză scăzută pentru aceeași perioadă de timp (Figura 3A). În mod remarcabil, incubarea în condiții fiziologice după perioada mai scurtă de incubare în mediu cu glucoză ridicată nu a inversat reducerea creșterii după 7 zile în cultură, culturile crescând la aceeași viteză ca și în cazul tratamentului continuu cu glucoză ridicată (Figura 3B). În plus, metilarea ADN-ului a arătat hipometilarea elementului LINE-1 și a locilor sateliti majori (Figura 2C, D), precum și hipermetilarea ADN susținută a promotorului Ppargcla, atât în condiții de glucoză ridicată, cât și în condiții inversate (Figura 3E), indicând formarea memoriei metabolice prin metilarea ADN-ului din cauza condițiilor de mediu adverse anterioare ca mijloc de programare fetală.
Figura 3. Ex vivo ex vivo ridicat la glucoză influențează formarea memoriei pe termen lung prin metilarea ADN-ului.(A) Imagistica rinichilor embrionari E12.5 din ziua 0 până în ziua 7 în mediu cu glucoză scăzută (5,5 mM), mediu cu glucoză ridicată (55 mM) sau mediu cu glucoză ridicată timp de 3,5 zile și inversare la mediu cu glucoză scăzută pentru zilele rămase.Bară de scară:500 um. (B) Suprafața rinichilor timp de 7 zile. Media ± SD. n=36 rinichi. LG, tratament cu glucoză scăzută; HG, tratament cu glucoză ridicată; HG la LG, 3,5 zile de tratament cu glucoză ridicată și 3,5 zile scăzută.***,LG-HG (test t neîmperecheat):p=0.0004;**,LG-HG la LG (test t asociat ):p<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4. Ecranul mic compus Ex Vivo identifică regulatorii epigenetici ai dezvoltării renale
Rezultatele acestei lucrări, precum și ale lucrărilor anterioare sugerează că mecanismele epigenetice joacă un rol în dezvoltarea rinichilor [30, A40-45]. Prin urmare, am dorit să evaluăm sistematic efectul modulatorilor epigenetici ai diferitelor clase de enzime asupra dezvoltării renale. Pentru aceasta, am selectat o bibliotecă de 22 de compuși mici aprobați de FDA cu activitate inhibitorie demonstrată [46-56] (Figura 4A). Folosind șoareci Six2.Cre-reporter pentru a evalua dezvoltarea nefronului, structurile renale au fost cultivate timp de 3 zile cu inhibitorii în mediu. Dimensiunea crește de-a lungul timpului în comparație cu organele de control ale littermatelor, iar morfologia a fost verificată pentru anomalii în dezvoltare (Figura 4B). S-ar putea dovedi că mai mulți inhibitori interferează cu dezvoltarea renală normală ex vivo. Inhibitorul HDAC entinostat, un inhibitor de benzamid histon deacetilază cu o afinitate mare pentru HDAC1,2 și 3 [57], a arătat o reducere consistentă a creșterii și lipsă de diferențiere și proliferare după 3 zile (Figura 4C). TH39 s-a dezvoltat ca inhibitor selectiv de HDAC8 (IC50). HDAC8 88 nM, 26-de ori selectivă față de HDAC1,28-de ori selectivă față de HDAC6[56]), a arătat o inhibare la fel de severă a creșterii în comparație cu organele de control. În plus, chelatorii de fier și inhibitorii JmJC deferasirox și deferoxamină au prezentat o reducere a creșterii analogă cu mediul cu deficit de fier. În plus, inhibitorul SET7/9 ciproheptadina [58,59] a arătat o reducere a creșterii și lipsa de diferențiere și proliferare în comparație cu rinichii de control (Figura 4D), dar a părut și să interfereze cu semnalizarea Wnt (Figura suplimentară S3). Alți inhibitori HDAC, HAT, HDM și HMT și inhibitorul DNMT 5-azacitidina nu au prezentat o reducere a creșterii sau anomalii de dezvoltare în intervalul de timp măsurat (Figura 4A).
Figura 4. Ecranul compus mic ex vivo identifică modulatorii dezvoltării renale.(A) Lista compușilor mici, țintele lor epigenetice și concentrația utilizată arată reducerea creșterii renale cu entinostat, TH39, deferasirox, deferoxamină și ciproheptadină în Mai mult sau egal cu 3 experimente independente după 3 zile în cultură. Culturile martor au fost tratate cu DMSO. ***, valoarea p<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
