Partea Ⅱ: Supraexprimarea PKD1 cauzează boala polichistică de rinichi

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté și Marie Trudel

Mecanismele patogenetice care stau la bazaautosomal dominant boala de rinichi cu chisturi multiple(ADPKD) rămân de elucidat. Deși există dovezi că PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) haploinsuficiența genei și pierderea heterozigozității pot cauza formarea de chisturi la șoareci, niveluri paradoxal ridicate de PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) au fost detectate în rinichii pacienților cu ADPKD (boală polichistică renală autozomal dominantă). Pentru a determina dacă PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) câștigul funcției poate fi un proces patogenetic, un PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) cromozomul artificial bacterian PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)-BAC) a fost modificat prin recombinare omoloagă pentru a viza numai un PKD1 susținut (boală polichistică de rinichi 1) expresie preferenţial rinichiului adult. Au fost generate mai multe linii transgenice care au supraexprimat în mod specific PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) transgenă în rinichi 2- la 15-pliază peste PKD1 (boala de rinichi cu chisturi multiple1) niveluri endogene. Toți șoarecii transgenici au dezvoltat reproductibil chisturi tubulare și glomerulare și insuficiență renală și au murit din cauza insuficienței renale. Acest model demonstrează că supraexprimarea PKD1 de tip sălbatic (boală polichistică de rinichi 1) singur este suficient pentru a declanșa cistogenie asemănătoare ADPKD umană (autosomal dominantboala de rinichi cu chisturi multiple). Rezultatele noastre au descoperit, de asemenea, o creștere uimitoare a expresiei renale a c-Myc la șoareci din toate liniile transgenice, indicând faptul că c-Myc este un efector critic in vivo în aval al PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) cale moleculară. Acest studiu nu numai că a produs un prim și neprețuit PKD（boala de rinichi cu chisturi multiple）model pentru a evalua patogeneza moleculară și terapiile, dar oferă, de asemenea, dovezi că câștigul de funcție ar putea fi un mecanism patogenetic în ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă).

Cistanche tratarea bolilor de rinichi

CLICK AICI PENTRU PARTEA Ⅰ

REZULTATE

Producția de PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)-Ac-BAC prin recombinare omoloagă. Pentru a determina dacă PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) doar câștigul funcției este suficient pentru a produce fenotipul ADPKD (boala polichistică renală autosomal dominantă), am izolat mai întâi o clonă genomică care conține întregul PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) într-o bibliotecă de vector BAC 129/Sv. Această bibliotecă a fost analizată prin PCR cu două seturi de primeri pentru PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) genă care a cuprins exonul 1 la capătul 5’ și exonii 39 până la 40 spre capătul 3’ (Fig. 1). O clonă BAC pozitivă pentru PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) a fost identificată gena care a inclus întregul corp al genei Tsc2 adiacent. Insertul PKD1 (boală polichistică a rinichilor 1) a fost caracterizat în detaliu pentru a se asigura că structura genomică se potrivește cu cea a PKD1 endogen (boala de rinichi cu chisturi multiple1) gena tulpinii de șoarece 129/Sv din care a derivat insertul și a tulpinii consangvinizate C57BL/6J. Hărți genomice ale PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) în BAC și în aceste tulpini consangvinizate prin analiză Southern blot, cu patru digestii cu enzime de restricție și șapte sonde care acoperă întreaga PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)genă, a apărut identic fără nicio dovadă de rearanjare (Fig. 1). Acest BAC conținea o inserție de -121-kb incluzând ~37 kb de secvență în amonte și -39 kb dintr-o secvență în aval a PKD1 (boala de rinichi cu chisturi multiple1) genă determinată prin electroforeză și secvențiere.

FIG. 2.Producția de constructe SBPkdlrAc și șoareci transgenici. (a) S-au efectuat evenimente succesive de recombinare omoloagă pe Pkdl-BAC murin pentru a introduce două modificări: elementele de reglare SB inserate imediat în amonte de codonul de inițiere Pkdl și o mutație punctiformă silențioasă a EcoRI (RI*) introdusă în exon (ex) 10. Vectorul de recombinare BAC conține o origine de replicare R6Ky, o genă rezistentă la ampicilină, o genă SacB, o genă RecA și un situs unic de donare Smal în care au fost donate elementele de reglare „SB” (sau mutația punctiformă silențioasă a exonului 10). cu brațele genei Pkd1 flancatoare. Vectorul de recombinare BAC a fost electroporat în celule E, coli (DH10B) care conțineau tipul sălbatic Pkdl-BAC și, după selecție, a avut loc un prim eveniment de recombinare omoloagă prin intermediul unuia dintre cele două brațe Pkd1 pentru a produce cointegrate BAC. Vectorul de recombinare și regiunile Pkdl duplicate ale cointegratelor BAC au fost eliminate într-o a doua etapă de selecție. Pkdl-BAC-urile rezolvate pot fie să revină la tipul sălbatic, fie să includă modificarea intenționată. Recombinarea omoloagă ulterioară în BAC-ul nou modificat poate fi apoi introdusă. orientare -la coadă și/sau coadă la coadă.Capătul 5' a fost analizat prin digestia ADN-ului genomic cu HindIII și hibridizat cu sonda transgenică specifică SB (panoul din stânga).Toate cele trei linii de șoarece transgenice au generat 10 așteptate. Banda .9-kb pentru inserarea cap-coadă; banda suplimentară observată în linia 39 reprezintă cel mai probabil un fragment de joncțiune între SB și genomul șoarecelui. Integritatea internă a transgenei a fost monitorizată prin mai multe digestii cu enzime de restricție și este prezentată o pată reprezentativă de ADN genomic digerat cu EcoRI și hibridizat cu sonda Pkdl (exon 7-15) (panoul din mijloc).

Acest SBPKD1 (boală polichistică de rinichi 1Clona )-BAC a fost modificată prin două evenimente succesive de recombinare omoloagă în E. coli. Gena PKD1 (boală polichistică a rinichilor 1) a fost marcată în exonul 10 prin substituirea unei nucleotide (G la A) pentru a crea un nou situs EcoRI la poziția 2355 pe harta cADN. Această mutație punctuală tăcută a fost produsă pentru a distinge PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) gena și transcrierea BAC din cea de origine endogenă. În plus, am înlocuit cele 5'elemente de reglementare ale PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)-BAC, profitând de elementele specifice epiteliului renal „SB” identificate anterior din gena SBM (legată la c-Myc) sau SBF legată de c-fos) construct-trans-genă pentru a restricționa expresia la rinichi (36, 38)(Fig. 2a).

Acest nou SBPkdlrAG-BAC a fost digerat cu NotL, un site unic situat imediat în amonte de elementele SB și ClaI în corpul genei Tsc2, trunchiând elementele de reglare Tsc2 și jumătatea 5' a corpului genei pentru a asigura lipsa T'sc2. expresie exogenă în toate țesuturile și pentru a elimina secvențele vectorului BAC procariot (Fig.1 și 2). Acest fragment liniarizat de 70-kb Notl-ClaI a fost izolat, purificat. și cuantificat pentru microinjecția de ovocite (36).

BENEFICIA CISTANCHE: TRATAREA BOLILOR DE RINCHI

Producerea și analiza șoarecilor transgenici SBPkdl-ac. Patru fondatori transgenici care poartă mai multe copii ale transgenei SBPkdlrAc au dezvoltat în mod constant PKD. Din cele patru SBPKD1 (boală polichistică de rinichi 1)Șoarecii fondatori RAC determinați prin analiză Southern, trei SBPKD1 (boală polichistică de rinichi 1) Liniile transgenice TAG au fost stabilite cu două până la nouă copii ale transgenei (Fig. 2b). Caracterizarea integrității transgenei în aceste linii a fost monitorizată cu sonde 5', interne și 3' așa cum se arată în exemplele reprezentative din Fig.2b. Liniile transgenice au evidențiat cu sonda 5'"SB" o bandă la 10,9 kb în concordanță cu SBPkdlrAc trans-gena fiind integrată într-o orientare cap-coadă și dezvăluită cu sonda 3' o bandă de 7.1-kb (Fig.2b). În plus, sonda internă a detectat benzile de 9,4-kb PKD1 (boală polichistică renală 1) endogenă, precum și benzile de 6,9-kb și 2,5-kb ale transgenei datorită situsului de inserție EcoRI în exonul 10 (Fig. 2b). Acești șoareci au conținut copii complete ale transgenei bazate pe analiza structurii genomice suprapuse.

PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) câștig de funcție la șoarecii transgenici SBPkdl-Ac adulți. Expresia SBPkdl-AG. transgenă și PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) a fost investigată în diferite organe. Cuantificarea nivelurilor de transcriere din transgenă și/sau gena endogenă a fost efectuată prin analiză Northern blot (Fig. 3a). După cum era de așteptat, transgenele și transcriptele genei endogene au avut lungime similară (14,2 kb). Pe baza expresiei GAPDH de control, rinichii din toate liniile de șoarece SBPkd 1 A au crescut constant expresia transcriptului în comparație cu PKD1 normal (boală polichistică de rinichi 1) în rinichii adulți (n=3) de vârstă similară. Transgena renală și expresia endogenă pentru diferitele linii transgenice au afișat un interval de 2- până la 15-ori peste PKD1 endogen renal de control(boala polichistică de rinichi 1)niveluri (Fig.3a). În special, linia transgenică39(n=4) a arătat PKD1 mai mare (boală polichistică de rinichi 1) decât liniile 3 (n=3) și 41(n=4). În plus, PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) nivelurile de expresie măsurate prin analiza Northern blot corelate cu cele obținute prin PCR în timp real folosind primeri în exonii 1 și 2 (Fig. 3b).

FIG.3.Analiza expresiei renale a șoarecilor SBPkdlrA. (a) Analiza exprimării transcriptelor (Tg) transgenelor Pkd1 endogene (endo) și SBPkdlrA în rinichi din trei linii transgenice prin Northern blot. Două probe din fiecare linie transgenică, 3, 39 și 41 au fost comparate cu transcrierea Pkdl renală endogenă a șoarecilor de control normal de vârstă potriviți din același fundal genetic (C5BI 6I × CBA/DE, probe de ARN de rinichi au fost obținute de la șoareci transgenici înainte de boală renală în stadiu terminal. Transcrierile de la endo și Tg au ambele lungime de -14.2 kb. O supraexprimare sistematică a transcriptelor a fost observată în rinichii tuturor șoarecilor transgenici în raport cu martorii netransgenici. GAPDH a fost utilizat ca control intern Cuantificarea expresiei renale la acești șoareci transgenici a variat de la 2- la 15-ori față de nivelurile endogene Pkd1 de la șoarecii martor stabilite în mod arbitrar la 1. (b) Reprezentarea schematică a transgenei și primerilor SBPkdl-. utilizat pentru a amplifica Pkdl total, inclusiv endogen și transgen (exon 1 și exon 2) și numai transgenă Pkd1 (B. exon 2) prin PCR în timp real și RT-PCR semicantitativă, analiza RT-PCR a expresiei transgenei SBPkdlAc a fost cuantificată în rinichi si in plus tesuturi renale. Este prezentată o evaluare semicantitativă reprezentativă a transgenei SBPkdl.Ac (Tg), care include o probă de țesut renal (K) de la un șoarece din toate cele trei linii transgenice (3, 39 și 41) și țesuturi extrarenale. H, inima; Lu, plămân; B. creier; Li, ficat; și S. splina de la un șoarece din linia 39. Expresia transgenei este ușor detectabilă în rinichii tuturor șoarecilor transgenici, în timp ce este scăzută până la nedetectabilă în țesuturile extrarenale. Expresia din transgena SBPkd1rAc a produs un amplicon 307-bp specific, în timp ce controlul intern S16 a generat un amplicon 102-bp. Marker M,100-bp; H, O, control negativ pentru amplificarea PCR. (c) Analiza expresiei PCR în timp real a SBPkdlr. Transgena a fost determinată de la mai mulți șoareci independenți. Transgena SBPkdl.Ac din cele trei linii de șoarece transgenice 3 (n=5), 39 (n =7) și 41 (n=5) a arătat că liniile 39 și 41 au avut cele mai mari nivelurile de expresie renală. Exprimarea transgenei SBPkdlrAc în țesuturile extrarenale de la șoareci (n=3) din cele trei linii transgenice a fost evaluată prin PCR în timp real. În comparație cu rinichii fiecărei linii transgenice (100 la sută), analiza țesuturilor extrarenale a arătat că nivelurile de expresie a transgenelor au fost în mod constant mai mici de 10- până la 1,000-ori în creier, inimă, ficat, pancreas , splina si plamani. (d) Exprimarea genei endogene c-mc în rinichii SBPkdl.Ac prin RT-PCR semicantitativă. O ilustrație schematică arată primerii utilizați pentru a amplifica c-Myc. După cum era de așteptat, expresia c-Myc este minimă în rinichii netransgenici adulți (martori). În schimb, expresia crescută a c-Mye este detectată în toți rinichii adulți SBPkdlrAc din cele trei linii, așa cum s-a observat în rinichii transgenici SBM adulți utilizați ca control pozitiv. Ampliconul lui c-Myc a fost de 250 bp; ampliconul S16, un control intern, a fost de 102 bp.M, 100-bp marker.

Cuantificarea nivelurilor de expresie a transgenei în mod specific a fost efectuată prin PCR în timp real și RT-PCR semicantitativă în cele trei linii transgenice la vârsta adultă, utilizând primeri în regiunea 5' netradusă (promotorul B, -globină) și în exonul 2 al PKD1. (boală polichistică de rinichi 1)(Fig.3b). SBPKD1 (boală polichistică de rinichi 1) Expresia RAC la șoarecii transgenici a fost comparată cu produsul genei proteinei ribozomale S16 ca standard intern. Condițiile utilizate pentru amplificarea semicantitativă RT-PCR au fost în intervalul liniar. Expresia transgenei prin PCR în timp real și RT-PCR semicantitativă au arătat în mod constant și specific cea mai mare expresie în rinichi dintre toate liniile transgenice în raport cu alte organe (Fig. 3b și c). Nivelurile de expresie renală pentru o probă individuală au fost reproductibile cu oricare dintre tehnicile de detectare utilizate. Cele mai înalte niveluri de PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) expresia renală transgenă a fost măsurată pentru liniile 39 și 41. Pentru a monitoriza dacă expresia crescută a PKD1 (boală polichistică renală 1) a rezultat din transgenă sau din gena endogenă, același grup de șoareci din cele trei linii transgenice a fost comparat pentru PKD1 renal ( boala polichistică de rinichi 1) expresia transgenelor și pentru PKD1 renală (boala polichistică de rinichi 1) expresia totală (transgenică și endogenă) prin PCR în timp real. Interesant. liniile 39 și 41 în raport cu linia 3 au arătat că creșterea PKD1 (boală polichistică de rinichi 1expresia renală a transgenei a fost similară sau peste cea a expresiei renale totale a PKD1 (boală polichistică de rinichi 1), indicând transgena ca fiind responsabilă în mod specific pentru această expresie indusă. În diferite organe (inclusiv inima, plămânul, creierul, ficatul, pancreasul și splina), SBPKD1 (boală polichistică de rinichi 1) RAC; transgena a arătat o expresie foarte slabă detectată ocazional în splină și plămân, cu o expresie mică până la nedetectabilă în alte organe (Fig. 3b). Cuantificarea prin PCR în timp real a demonstrat un nivel de 10-la 1,000-ori mai mic al expresiei transgenei în țesuturile extrarenale în raport cu expresia rinichilor (Fig. 3c). Elementele reglatoare „SB” ale transgenei SBPkdlrAc au conferit expresie renală preferenţială; această distribuție specială a organelor a fost de asemenea determinată atunci când a fost utilizată în transgenele legate de c-Myc (SBM) și c-fos (SBF) (36, 38). c-Mye, un efector în aval al PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) căi de semnalizare în SBPkdlrAc: șoareci. Pentru a obține o perspectivă asupra mecanismului patogenetic intracelular al șoarecilor transgenici SBPkdlrAc, am căutat în continuare să monitorizăm nivelul expresiei renale c-Myc pe baza observației noastre anterioare a dereglării c-Myc în rinichii ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) umane (22). Analiza rinichilor a fost efectuată din toate cele trei linii transgenice 3(n=4).39(n=7) și 41 (n =4), precum și martori (n {{9} }}). După cum se arată în Fig.3d, există o expresie substanțială a c-Mye endogen indusă la șoarecii SBPkdlrAa în raport cu șoarecii de control de vârstă similară. Interesant, nivelul de expresie c-Myc în unii rinichi SBPkdlrAG, în special linia 39, a atins niveluri comparabile cu cele observate în modelul de șoarece transgenic PKD SBM produs de expresia renală c-Myc.

Anomalii renale în SBPKD1 (boală polichistică de rinichi 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 pentru fiecare linie) au dezvoltat multiple chisturi tubulare (T) și glomerulare (G) (Fig. 4d, f și g). Chisturile au fost observate în tubii din regiunile corticale și medulare, precum și în tubii colectori din papila (Fig 4d și e). Șoarecii transgenici au prezentat hiperplazie epitelială tubulară (vârf de săgeată) care implică atât tubuli chistici, cât și nechistici și hipertrofie frecventă (Fig. 4g și h). dar severitatea a variat între șoareci individuali. Fibroza interstițială (F).s-au observat frecvent infiltrate limfoide perivasculare și gipsuri proteice (P) (Fig. 4d și e)

Fig. 4

Pentru a defini mai precis locul de localizare al PKD1 crescută (boală polichistică de rinichi 1)expresiei în rinichi, am efectuat hibridizarea in situ folosind sonda exon 36-45 utilizată anterior(16). Semnalul de hibridizare a fost localizat în mod specific la celulele epiteliale care căptușesc chistul și tubii hiperplazici, precum și chisturile glomerulare. În plus, s-a observat un anumit semnal peste epiteliul tubilor nechistici sau ușor dilatați, probabil identificând tubuli predestinați să sufere modificări chistice viitoare (Fig. 4i și j). Analiza histologică renală a fost efectuată și pe șoareci transgenici la naștere (n=8), ziua postnatală 10 (P10) (n=3), P20 (n{=5), P35 (n{ {10}}), și P45(n{= 3) în comparație cu tovarășii negativi din aceeași grupă de vârstă (n =2 până la 4). În mod interesant, toți șoarecii transgenici nou-născuți au prezentat dilatație tubulară și glomerulară în raport cu controlează colegii negativi (Fig. 4k și 1), indicând faptul că anomaliile renale au fost inițiate in utero, așa cum s-a observat la șoarecii SBM și în ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) pacienţi. Dilatația tubulară și glomerulară a crescut în dimensiune și număr odată cu vârsta progresivă. Prin P35, șoarecii transgenici au prezentat hiperplazie mai severă și dovezi de glomeruloscleroză Funcții fiziologice renale alterate la șoarecii SBPkdlrsc. Funcțiile fiziologice renale ale tuturor șoarecilor transgenici au prezentat caracteristici similare cu PKD, în timp ce colegii netransgenici nu au dezvoltat niciodată boala. La câteva luni de la naștere, animalele afectate au dezvoltat insuficiență renală cronică. Aceste animale au fost monitorizate pentru parametrii funcționali renali prin măsurarea nivelurilor serice și urinare. azotul ureic din sânge (BUN) și creatinina, osmolalitatea urinei, proteinele din urină și excreția de ioni (Tabelul 1). Toți șoarecii din cele trei linii, comparativ cu martorii, au prezentat defecte de concentrare, o constatare comună în ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă). și, în consecință, a prezentat o scădere a BUN urinar. concentrații de creatinină, proteine ​​și fier. SBPKD1 transgenic (boală polichistică de rinichi 1)rAc.fondatorii și descendenții (n=6) din fiecare linie au fost monitorizați calitativ pentru proteinurie pe probe de urină prin SDS-PAGE (Fig. 5). Șoarecii cu vârsta mai mare de 2 luni au prezentat proteinurie neselectivă care a progresat odată cu vârsta. În plus, nivelurile serice ale BUN și ale creatininei serice au fost crescute, dezvăluind insuficiență renală (Tabelul 2). Deoarece insuficiența renală cronică duce în mod obișnuit la modificări ale parametrilor hematologici, aceștia au fost examinați la șoareci transgenici SBPkdlAc cu vârsta de 3 până la 14 luni (Tabelul 2). Acești șoareci transgenici au fost anemici, așa cum demonstrează scăderea semnificativă a numărului de celule roșii din sânge, hemoglobina și hematocritul atingând jumătate din nivelurile normale. Alți parametri de celule roșii din sânge, cum ar fi procentul de reticulocite, nu au fost afectați, așa cum era de așteptat atunci când au fost induși de un defect renal. Aceste animale au murit în mod constant din cauza insuficienței renale la vârsta de -5,9± 2,8 luni (n {{12} }) pentru linia transgenică 39 și la vârste ulterioare,-14,6± 3,1 luni (n{= 20) și-11,7 ±6,5 luni (n=7) ,pentru liniile 3 și 41,respectiv.

EFECTELE CISTANCEI: TRATAREA BOLILOR DE RINCHI

DISCUŢIE

Aici raportăm izolarea și caracterizarea unui PKD1 murin (boală polichistică de rinichi 1)-BAC. Acest PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) a fost marcată și elementele de reglare au fost înlocuite pentru a ținti expresia în mod specific la rinichi prin două evenimente succesive de recombinare omoloagă. Șoarecii transgenici produși cu această nouă genă SBPkdlrAG au prezentat o creștere de 2-până la 15-ori a exprimării PKD1 (boală polichistică renală 1) și au dezvoltat reproductibil modificări morfologice renale timpurii tipice PKD. Insuficiența renală este evidentă la vârsta mijlocie, iar șoarecii mor prematur din cauza insuficienței renale. Rezultatele noastre indică, de asemenea, că mecanismul de supraexpresie PKD1 (boala polichistică a rinichilor 1) responsabil pentru acest fenotip este mediat de activarea semnalizării c-Myc in vivo. Acest studiu demonstrează că câștigul funcției renale PKD1 (boala polichistică renală 1) murină este suficient pentru a produce un fenotip renal PKD.

Din moment ce PKD1 murin (boală polichistică de rinichi 1) gena nu este duplicată așa cum este la om (27), am identificat și izolat direct o clonă BAC care conținea întregul PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) genă. Caracterizarea completă a PKD1 murină 129/Sv (boală polichistică de rinichi 1)-BAC. comparația indirectă cu alte două tulpini de șoarece consangvinizate a confirmat integritatea locului PKD1 (boala polichistică a rinichilor 1). PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)-BACinsert conținea-37 până la 39 kb de secvențe în amonte și în aval din gena PKD1 (boală polichistică a rinichilor 1). Analiza noastră a demonstrat că PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) din acest BAC a fost un locus de tip sălbatic murin de bună credință care ar putea servi pentru studii ulterioare.

Deși există dovezi puternice că formarea chistului în ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) poate rezulta din pierderea heterozigozității după inactivarea somatică a PKD1 normală (boală polichistică de rinichi 1) (3.21.32), există, de asemenea, dovezi sugestive pentru expresia susținută sau chiar crescută a policistinei-1 în epiteliul tubular chistic (22.29). Ultima observație ridică întrebarea dacă supraexprimarea PKD1 (boala polichistică a rinichilor 1) în sine este o cauză imediată suficientă a cistogenezei. La șoarecii transgenici care poartă PKD1 uman (boală polichistică de rinichi 1), TSC2. RAB26. Genele NTHL1 și SLC9A3R2, doar o minoritate de șoareci au dezvoltat chisturi și niciunul nu a avut expresie transgenă detectabilă la vârsta adultă, în ciuda a 30 de copii ale transgenei (31). La acei șoareci transgenici. a fost dificil să se stabilească un rol clar pentru supraexpresia PKD1 (boala polichistică renală 1) în cistogenie. Modelul nostru diferă, deoarece două până la nouă copii de tip sălbatic ale PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) singure, fără gene contigue, au fost integrate la șoarecii transgenici. Deoarece gena PKD1 (boala polichistică a rinichilor 1) are funcții esențiale în diferite organe sau țesuturi, așa cum este descris pentru mulți șoareci cu ablația genei PKD1 (boala polichistică a rinichilor 1), o supraexpresie sistemică a PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) ar putea duce la efecte de confuzie suplimentare. În consecință, am abordat rolul PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) câștig de funcție folosind o abordare care vizează PKD1 (boala polichistică a rinichilor 1) în mod specific rinichilor. Prin recombinare omoloagă, am înlocuit mai întâi regiunea reglatoare din amonte PKD1 (boala polichistică a rinichilor 1) cu elementele de reglare restrictive renale „SB”, prevenind astfel scăderea expresiei genelor observată în mod normal pentru PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)la vârsta adultă, precum și potențiala reglare secundară a buclei de feedback(36,38). În al doilea rând, am marcat PKD1 murin (boală polichistică de rinichi 1) transgenă (Pkdlr) cu o mutație punctiformă silențioasă în exonul 10, dar nu a inserat o etichetă epitop pentru a se asigura că va fi produsă o proteină „de tip sălbatic” complet funcțională, cu structură și integritate conservată. Din acest BAC modificat, un fragment SBPkdlrAG a fost purificat departe de gena Tsc2 și vectorul BAC pentru a preveni interferența cu gena Tsc2, care poate induce și un fenotip chistic (8.20.28). precum şi pentru a evita efectul inhibitor al secvenţelor procariote(5).

Patru șoareci fondatori SBPkdlrActransgenic diferiți și trei linii independente au fost produse cu PKD1 renal specific (boală polichistică de rinichi 1)-expresie sporită. Deosebit de izbitoare este penetranța completă a fenotipului la acești șoareci transgenici. SBPKD1 (boală polichistică de rinichi 1) Fondatorul rAc și liniile de șoarece au împărtășit câteva trăsături fiziopatologice în comun cu ADPKD (boala polichistică renală autosomal dominantă). Acestea includ dezvoltarea chisturilor în cortex, medular și glomeruli împreună cu hiperplazia epitelială, fibroza interstițială și inflamația interstițială focală.

Deoarece fenotipul PKD a fost observat în mod constant la toți diferiții șoareci fondatori transgenici și integrarea transgenei în genomul șoarecelui este un fenomen aleatoriu, fenotipul nu poate rezulta din efectul poziției cromozomiale, ci doar din creșterea PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)expresie. Într-adevăr, s-a demonstrat că expresia transgenei PKD1 (boală polichistică renală 1) în toate liniile este limitată de rinichi. așa cum sa observat anterior pentru alte transgene reglate de elementele „SB” (36,38). Mai mult, această expresie crescută a PKD1 (boală polichistică a rinichilor 1) a fost cauzată de transgenă și nu de o PKD1 endogenă indirectă (boală polichistică de rinichi 1) activare. Prin urmare, rezultatele noastre oferă dovezi clare că câștigul funcției unui PKD1 funcțional de tip sălbatic (boala polichistică renală 1) poate produce mai multe chisturi renale. Este important că aceste practici SBPKD1 (boală polichistică a rinichilor 1) constituie primul model de șoarece generat de singura supraexprimare a ortologului de șoarece al PKD1 uman (boală polichistică de rinichi 1) genă.

Șoarecii SBPkdl-Ac demonstrează că PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)supraexprimarea este un mecanism patogenetic primar al cistogenezei renale. Important este că cele mai ridicate niveluri de expresie a transgenelor în rinichi au părut să se coreleze cu progresia și severitatea fenotipului. De asemenea, am constatat că supraexprimarea PKD1 (boala polichistică a rinichilor 1) în dezvoltarea SBPKD1 (boală polichistică de rinichi 1Fenotipul )-Ac este probabil să semnaleze activarea c-Myc in vivo. În mod imaginabil, această activare ar putea fi chiar directă prin coada policistinei-1 C-terminal care suferă clivaj proteolitic și translocare nucleară (7), Deoarece exprimarea renală îmbunătățită a c-Myc la șoarecii adulți s-a dovedit că induce PKD, aceasta ar fi foarte consistent pentru a sprijini c-Myc ca efect major în aval al PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) căi de semnalizare Acest rezultat s-a corelat, de asemenea, cu descoperirile noastre anterioare privind creșterea expresiei c-Myc în rinichii tuturor ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) analizate (22). În total, aceste rezultate indică faptul că c-Mye este un mediator principal al PKD1. (boală polichistică de rinichi 1)cistogenie.

Rezultatele noastre de la PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)modelul de creștere a funcției, împreună cu haploinsuficiența și pierderea funcției PKD1 murin (boala polichistică a rinichilor) indică faptul că orice PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) dereglarea ar putea duce la cistogenie (2.19.23-26.31.40). Dezechilibru sever al PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) la șoareci indus de PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) ablația sau supraexprimarea transgenică au cauzat debutul precoce și progresia rapidă a chisturilor renale și au afectat o proporție mare de tubuli. În schimb, o PKD1 mai ușoară (boală polichistică de rinichi 1) dezechilibrul cum ar fi haploinsuficiența a dus la o progresie mai lentă a PKD cu mai multe chisturi focale. Dezvoltarea paradoxală aparentă a unui fenotip similar prin dereglarea opusă a policistinei-1 ar putea fi explicată prin rezultatul obișnuit, și anume un dezechilibru relativ al concentrației de proteine ​​care ar putea altera formarea sau funcția unui complex multiproteic de policistină activ. Luate împreună, rezultatele noastre și cele ale altor investigatori susțin că mecanismul de formare a chistului în ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) este probabil să apară din trei mecanisme patogenetice: câștigul funcției, pierderea funcției și efectele dozării genelor.

Romanul SBPkdlrAc; Șoarecii constituie un model puternic de cistogenie renală care poate oferi perspective majore asupra patofiziologiei PKD, PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) căi de transducție a semnalului și parteneri care interacționează. Studiul acestui model poate duce, de asemenea, la dezvoltarea de noi strategii terapeutice pentru a restabili echilibrul proteic normal în cadrul PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) complex multimeric.

Cistanche tratează bolile renale și îmbunătățește funcția rinichilor

REFERINȚE

1. Blouin, MJ, H.Beachemin, A Wright, M E. De Paepe, M. Surrette, AM. Frumos. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos și M. Trudel. 2000. Corecția genetică a bolii cu celule falciforme: perspective folosind modele de șoarece transgenic Nat. Med.17-182.

2 Boulter, C, S.Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle și R. Sandford. 2001.Cardiovasculare, scheletice. și defecte renale la șoareci cu o întrerupere țintită a PKD1 (boală polichistică de rinichi 1)genă. Proc. Natl.Acad. Sci. SUA 9812174-12179.

3. Brasier, JL și EPHenske.1997. Pierdereaboala de rinichi cu chisturi multiple(PKD1）regiunea cromozomului 1φp13 din celulele chistului renal susține un model de pierdere a funcției pentru patogeneza chistului. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R Dackowski, LR.Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R ML Hakim,G. ML Landes,KW Klinger,F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino și N. A Doggett.1995. Analiza secvenței genomice pentruboală polichistică renală autosomal dominantăgena prezice prezența unei repetări bogate în leucină. Hum Mol, Genet.4-575-58.

5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E. Lacy și F.Costantini. 1985. Expresia specifică a unei gene de globină străină în celula eritroidă a șoarecilor transgenici Nature 337-380.

6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst,GG Germino, and M.-C. Gubler.2002.Exprimarea transcriptelor și proteinelor PKDI și PKD2 în embrionul uman și în timpul dezvoltării normale a rinichilor. A.m. J.Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet, V, X Tian, ​​H. Husson, DH Grimm, T. Wang T. Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya, S.Somlo și MJ Caplan. 2004 Stimulii mecanici induc clivaj și nuclear translocarea capătului C pobeystin-1.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson și DJ Kwiatkowski 2000. Avansul genetic molecular în scleroza tuberoasă. Zumzet. Genet10797-114.

9. Consorțiu, EPKD1993. Identificarea și caracterizarea genei sclerozei tuberoase pe cromozomul 16.Cell75:1305-1315.

10. Consorțiu, EPKD1994.Theboală polichistică de rinichi 1gena codifică toate transcriptibile într-o regiune duplicată pe cromozomul 16 Celula 7781-894.

11. Consorțiu, L PK D 1995.Boala de rinichi cu chisturi multiple: structura completă a PKD1 (boala de rinichi cu chisturi multiple1) gena și proteina acesteia. Ce 81:289-298

12. Couillard, M.,R Guilkume, N Tanj, V.DAgati, and M. Trudel.2002. Apoptoza indusă de c-Myc înboala de rinichi cu chisturi multipleeste independent de interacțiunea FasL/Fas. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Un model de glomerulopatie cu celule falciforme umane. Rinichi Int. 46:1337-1345.

14. GengL,Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei,F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders și J.Zhou. 1996.Identificarea și localizarea poliesterului, PKD1 (boală polichistică de rinichi 1) produs genetic. J. Clin. Investig. 98-2674-2682