Partea Ⅰ Valoarea adjuvantă a Herba Cistanches atunci când este utilizat în combinație cu statine la modelele murine

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson și Clara Bik San Lau

1 Institutul de Medicină Chineză, Universitatea Chineză din Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong.

2 Laboratorul cheie de stat de fitochimie și resurse vegetale din vestul Chinei, Universitatea Chineză din Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong.

3 Divizia de Farmacologie Clinică, Departamentul de Medicină și Terapeutică, Universitatea Chineză din Hong Kong, Shatin, Noi Teritorii, Hong Kong. Elaine Wat și Chun Fai Ng au contribuit în mod egal la această lucrare. Corespondența și solicitările de materiale trebuie adresate către CBSL (e-mail: claralau@cuhk.edu.hk)

Pentru mai multe informații: emily.li@wecistanche.com

Faceți clic aici pentru a obține mai multe informații despre Cistanche

Abstract

Statinele sunt bine cunoscute ca au probleme de toxicitate musculara.Herbacistanci(HC) este o plantă chinezească folosită în mod tradițional pentru durerea la nivelul coapselor și genunchilor. Studiul nostru anterior in vitro a sugerat că ar putea proteja împotriva toxicității musculare induse de statine. Cu toate acestea, efectul protector in vivo nu a fost niciodată investigat. Obiectivul acestui studiu a fost de a determina dacă extractul apos deHerbaCistanche(HCE) ar putea preveni toxicitatea musculară indusă de simvastatină la șobolani și dacă Herba Cistanche E ar putea exercita și efecte benefice asupra reducerii hipercolesterolemiei induse de dieta bogată în grăsimi și a colesterolului hepatic crescut, reducând astfel doza de simvastatină atunci când este utilizată în terapia combinată. Din rezultatele noastre, Herba Cistanche E a restabilit în mod semnificativ reducerea indusă de simvastatină a greutății musculare și a redus creatinkinaza plasmatică crescută la șobolani.HerbaCistancheE a îmbunătățit, de asemenea, reducerea indusă de simvastatină a nivelurilor de glutation muscular, potențialul membranei mitocondriale musculare și a redus inflamația musculară indusă de simvastatină. Mai mult, HCE ar putea exercita o reducere a greutății ficatului, a nivelurilor totale de lipide hepatice și a nivelurilor de lipide plasmatice la șoarecii hrăniți cu grăsimi. În concluzie, studiul nostru a oferit dovezi in vivo căHerba CistancheE are potențiale efecte protectoare asupra toxicității induse de simvastatină în mușchi și, de asemenea, efecte benefice asupra ficatului gras nealcoolic indus de dietă și asupra hiperlipidemiei atunci când este utilizat singur sau în combinație cu simvastatină în doză redusă.

Inhibitorii HMG-CoA reductazei, cunoscuți și sub numele de statine, sunt bine documentați a fi benefici pentru pacienții hipercolesterolemici cu risc moderat și ridicat de boli cardiovasculare1. Statinele, una dintre cele mai vândute clase de medicamente eliberate pe bază de rețetă din lume, acționează prin inhibarea reducerii HMG-CoA la acid mevalonic în stadiul incipient al căii mevalonatului pentru a reduce sinteza colesterolului endogen2, 3. Deși statinele sunt de obicei bine tolerate , unul dintre cele mai importante și binecunoscute efecte adverse clinice este anomaliile mușchilor scheletici, care pot varia de la mialgie benignă până la miopatie severă4, 5. Într-un studiu amplu pe 10.409 subiecți francezi, realizat printr-un interviu telefonic, 10 la sută dintre pacienții care au primit tratamentul cu statine a raportat simptome musculare, din care 30 la sută dintre acești pacienți simptomatici au dus la întreruperea tratamentului6. Grupul de lucru pentru siguranța statinelor Asociației Naționale a Lipidelor a oferit recomandări pentru gestionarea simptomelor legate de mușchi la pacienții care urmează tratament cu statine. În general, se recomandă ca la pacienții cu simptome severe, cum ar fi creșterea creatinkinazei (CK) mai mare de 5 × LSN, statinele să fie reținute, până când nivelul CK este din nou normalizat5. Din cauza apariției acestor efecte secundare și a faptului că nu există un tratament eficient pentru toxicitatea musculară indusă de statine, există astfel un impuls de a căuta noi terapii pentru gestionarea problemelor musculare induse de statine.

În timp ce sunt propuse un amestec de mecanisme care ar putea fi responsabile pentru efectele adverse ale statinei, se crede că mecanismele mitocondriale sunt implicate în efectele adverse ale toxicității musculare ale statinei1. Mevalonatul nu este doar un precursor al colesterolului, ci este și un precursor pentru compuși importanți, cum ar fi selenoproteinele, dolicolul și ubichinona7, 8. Statina poate regla în jos selenoproteine ​​precum glutation peroxidaza (GPx), compromițând densitatea antioxidantă și contribuind la efectele adverse ale acesteia. efecte 4. Statinele ar putea duce, de asemenea, la epuizarea ubichinonei, determinând un consum redus de oxigen și sinteza ATP9. În plus, studiile în creștere in vitro și in vivo au demonstrat că statina ar putea acționa direct asupra mitocondriilor tisulare, provocând creșterea speciilor reactive de oxigen (ROS) și stres oxidativ mitocondrial, ducând la moartea celulelor și, prin urmare, contribuind la leziuni hepatice și musculare10, 11.

Herbacistanci, întreaga plantă uscată deCistanchedeserticolaYC Ma (familia Orobanchaceae), sunt plante parazite care cresc predominant în zonele deșertice din nordul și nord-estul Chinei12. Conform teoriei medicinei chineze, Herba Cistanches are gustul dulce, cald și sărat13. Este o planta tonica chinezeasca care revigoreaza Yang, care este folosita in principal pentru a trata deficienta renala cu simptome precum impotenta, infertilitatea, ejacularea precoce. Este, de asemenea, o plantă chinezească care este prescrisă în mod tradițional pacienților pentru durerea la nivelul coapselor și genunchilor și este utilizată în mod obișnuit în formulările chinezești pentru tratamentul problemelor musculare12, 14. Interesant, acest lucru este, de asemenea, în concordanță cu studiile științifice moderne care au demonstrat anti -activitățile de oboseală ale unui extract de Herba Cistanches bogat în polizaharide și feniletanoizi la șobolani după exercițiu, prin scăderea leziunilor musculare și îmbunătățirea stocării ATP15. În plus, lucrări recente au demonstrat că un extract cu metanol de Herba Cistanches ar putea îmbunătăți generarea de ATP mitocondrial16.Herbacistancisa dovedit, de asemenea, a fi un puternic antioxidant și captator de radicali liberi în diferite organe, reducând stresul oxidativ și activitățile ROS în studii in vivo17, 18. Într-un studiu recent efectuat de laboratorul nostru, am demonstrat căHerbacistanciextractul apos a prevenit semnificativ toxicitatea indusă de simvastatină în celulele musculare scheletice L6, precum și o reducere a producției de ATP indusă de simvastatină restabilită în funcție de doză în celulele L6, sugerând potențialul deHerbacistanciextract apos în protejarea împotriva toxicității musculare induse de statine19. Cu toate acestea, dovezile in vivo lipsesc.

Prin urmare, am emis ipoteza căHerbacistanciextractul apos (HCE) ar putea exercita efecte benefice asupra toxicității musculare induse de simvastatină. Astfel, acest studiu și-a propus să determine dacă utilizarea HCE ar putea reduce toxicitatea musculară indusă de simvastatină folosind un model animal in vivo și, în plus, dacă HCE ar putea exercita și efecte benefice asupra reducerii hipercolesterolemiei induse de dieta bogată în grăsimi și a colesterolului hepatic crescut. , reducând astfel doza de simvastatină utilizată.

Materiale și metode

Autentificarea și extracția materialelor pe bază de plante.

Materii prime din plante dinHerbacistanci(Cistanche deserticola, provenit din Mongolia Interioară) a fost achiziționat de la Zi Xin, un furnizor renumit din Guangzhou, China. Herba Cistanches a fost autentificat chimic folosind cromatografia în strat subțire și cromatografia lichidă ultra-performanță în conformitate cu Farmacopeea Chineză 201013, așa cum s-a descris anterior19, cuverbascozidșiechinacozid(achiziționat de la Institutul Național pentru Controlul Produselor Farmaceutice și Biologice, China) ca markeri chimici. La autentificare chimică, exemplar de bon de herbar deHerbacistancia fost depus la Muzeul Institutului de Medicină Chineză de la Universitatea Chineză din Hong Kong, cu numărul de exemplar de voucher 2014-3434.

Herbacistanciextractul apos a fost preparat așa cum s-a descris anterior19. Pe scurt, 1 kg de plantă crudă a fost înmuiată timp de 1 oră, urmată de extracție de două ori prin încălzire timp de 1 oră la reflux la 100 de grade folosind apă distilată 10x. Extractele apoase (HCE) au fost apoi combinate şi filtrate, iar filtratul a fost concentrat sub presiune redusă la 60 de grade. Extractul concentrat a fost liofilizat până la uscare. Procentul de randament a fost de 50,1 procente g/g. Toată pulberea extrasă a fost ambalată în vid și depozitată până la utilizare.

Animale experimentale.

Simvastatina a fost achiziționată de la SR Pharmasolutions Ltd. Șobolani masculi Sprague Dawley (180–200 g) și șoareci masculi C57Bl/6J (8-în vârstă de 8-săptămâni) au fost furnizați de Centrul de servicii pentru animale de laborator, Universitatea Chineză din Hong Kong. Experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul de Etică al Experimentării Animale al Universității Chineze din Hong Kong (Ref nr. 12/074/MIS). Toate metodele experimentale au fost efectuate conform ghidurilor aprobate specificate de Comitetul de etică a experimentelor cu animale al Universității Chineze din Hong Kong. Toți șobolanii (3 animale per cușcă) și șoarecii (5 animale per cușcă) au fost găzduiți în cuști standard normale, la o temperatură constantă de 21 de grade, cu un ciclu lumină-întuneric de 12-h. Fiecare cușcă standard conținea aspen ca material de așternut. Toate animalele au avut acces ad libitum la dietă și apă.

Studiul toxicității musculare indusă de statine la șobolani.

Toți șobolanii au fost împărțiți aleatoriu în 5 grupuri (n=5–10). Toate animalele urmau o dietă normală. De asemenea, li s-a administrat zilnic apă distilată sau simvastatină și cu sau fără tratament cu HCE intragastric. Pentru animalele cărora li se cere să li se administreze atât simvastatină, cât și HCE, HCE a fost administrat la 3 ore după administrarea simvastatinei pentru a preveni orice interacțiune chimică directă plante-medicament. Extractul din plante sau simvastatina a fost dizolvat în 0,5% metilceluloză în apă distilată la o concentrație cunoscută. Un volum precalculat a fost administrat intragastric fiecărui animal în funcție de greutatea individului, astfel încât volumul calculat să conțină cantitatea necesară din doza propusă. Detaliile acestor grupuri sunt următoarele:

Grupa a) Dieta normal-chow plus apă distilată (grupul normal de control)

Grupa b) Dieta normal-chow plus simvastatină (640 mg/kg)

Grupa c) Dieta normală, plus simvastatină (640 mg/kg) plus HCE în doză mică (1,1 g/kg animal)

Grupa d) Dietă normală plus simvastatină (640 mg/kg) plus HCE în doză mare (2,2 g/kg animal)

Grupa e) Dieta normală, plus HCE în doză mare (2,2 g/kg de animal)

Aportul de alimente a fost înregistrat zilnic și greutatea corporală a fost măsurată de două ori pe săptămână. Tratamentul a fost dat timp de 4 săptămâni. După aceea, animalele au fost anesteziate folosind un amestec de ketamina (100 mg/kg) și xilazină (10 mg/kg) intraperitoneal. Sângele a fost extras prin puncție cardiacă și lăsat să se coaguleze. Plasma a fost apoi separată prin centrifugare (3,000 rpm timp de 10 minute). Diferiți mușchi (cvadriceps, gastrocnemiu, soleus, tibial anterior și extensor digitorumlongus) au fost excizati și păstrați la -80 de grade până la analiză.

Măsurarea creatinkinazei plasmatice. Activitatea creatinkinazei plasmatice (CK) a fost determinată folosind kitul Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, SUA) conform instrucțiunilor producătorului.

Măsurarea glutationului peroxidazei musculare. Glutation peroxidaza musculară (GPx) a fost măsurată folosind kitul disponibil comercial (703102, Cayman Chemical, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, țesuturile musculare au fost clătite cu PBS la pH 7,4 pentru a elimina orice celule roșii din sânge și s-au omogenizat în 5-10 ml tampon de liză rece, după care omogenatul a fost centrifugat la 10,000 g timp de 15 minute la 4 grade. Supernatantul a fost apoi îndepărtat și testat pentru activitatea GPx folosind trusa comercială.

Prepararea fracțiilor mitocondriale și citosolice musculare. Fracțiile mitocondriale și citosolice din probele de mușchi au fost preparate folosind Mitochondria Isolation Kit (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, probele de mușchi proaspete au fost pre-tratate cu unt de extracție, tăiate în bucăți mici și omogenizate în tampon de extracție. Omogenatele de țesut au fost apoi centrifugate. Supernatantul a fost colectat și rezervat pentru analiza fracției citosolice. Peletele mitocondriale au fost apoi spălate și centrifugate din nou și utilizate pentru analiza fracției mitocondriale.

Măsurarea speciilor reactive de oxigen mitocondrial (ROS). ROS a fost măsurat cu protocolul modificat din literatura anterioară20. Pe scurt, ROS a fost măsurat din fracția mitocondrială (50 pg proteină/ml) folosind soluție DCFDA (C6827, Invitrogen, SUA). Amestecul a fost incubat la 37 de grade timp de 10 minute la întuneric, după care a fost incubat cu soluție de substrat (10 mM piruvat, 15 mM malat) pentru fotoactivare. Intensitatea fluorescenței a fost măsurată la fiecare 5 minute timp de 60 de minute de BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader la 485 nm de excitare și 520 nm de emisie. Intensitățile fluorescenței au fost calculate pentru măsurarea generării ROS.

Potențialul membranei mitocondriale musculare. Potențialul membranei mitocondriale al fracției mitocondriale din probele musculare a fost determinat conform protocolului producătorului (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, SUA). Această procedură este un test cu punct fix care măsoară absorbția de JC-1 cu formarea agregatelor J. Pe scurt, suspensia mitocondrială a fost diluată pentru a conține 20 ug de proteină și a fost incubată cu colorantul JC-1 timp de 7 minute la temperatura camerei. Acest 7-minut este un timp optimizat și validat de către Producător folosind diverși compuși (așa cum se menționează în protocolul producătorului), deoarece fluorescența observată a soluției va crește până la un platou după 5-10 minute, urmată de o scădere drastică a fluorescența JC-1 datorită egalizării concentrațiilor de JC-1 în interiorul și în afara matricei mitocondriale. Intensitatea fluorescenței a fost măsurată de BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader la 490 nm de excitare și 590 nm de emisie. Au fost calculate intensitățile de fluorescență pentru măsurarea gradienților potențiali.

Evaluarea histologiei musculare și a inflamației. Imunohistochimia celulelor inflamatorii din mușchi a fost evaluată prin colorarea CD68 și CD163 așa cum a fost descris anterior21-23. Au fost tăiate secțiuni de parafn de 5 μm, lipite de lamele de sticlă Superfrost™ Plus (Menzel-Gläser, Germania). Anticorpii primari de șoarece anti-șobolan CD68, ED1 și CD163, ED2, (Bio-Rad, SUA) au fost aplicați pe secțiuni la diluție 1:100. Colorarea specifică a fost detectată de EnVision™ Systems (Dako, Danemarca), folosind anticorpul secundar, IgG anti-șoarece conjugat cu polimer EnVision-HRP la o diluție de 1:200 și a fost detectată folosind soluție DAB (Dako, Danemarca), urmată prin contracolorare cu hematoxilină. Secțiunile au fost apoi montate în dibutil-ftalat în histonă (DPX). Prezența neutrofilelor în mușchi a fost detectată prin imunohistochimie cantitativă folosind software-ul ImageJ.

Analiza expresiei genelor musculare. Testul PCR care profilează genele legate de stresul oxidativ a fost efectuat utilizând matrice PCR pentru stresul oxidativ și apărarea antioxidanților (PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, SUA). Matricea PCR a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, ARN-ul total a fost izolat prin legarea selectivă la o membrană pe bază de silicagel în urma lizei și omogenizării probelor de mușchi într-un tampon denaturant de tiocianat de guanidină (kit RNeasy, Qiagen). ARN-ul a fost transcris invers în cADN utilizând kitul RT2 First Strand (SABiosciences, Frederick, SUA). Acest ADNc a fost apoi adăugat la RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABiosciences, Frederick, SUA). Apoi, fiecare probă a fost alicotată pe matrice PCR de stres oxidativ și de apărare antioxidantă la șobolan (SABiosciences, Frederick, SUA). Toate etapele au fost efectuate conform protocolului producătorului.

Studiul hiperlipidemiei induse de dieta bogată în grăsimi și al steatozei hepatice la șoareci.

Toți șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în 5 grupuri (n=8–1{0) și au primit următoarele: Grupa a) Dietă normală (Tabelul 1); Grupele b la e) Dietă bogată în grăsimi (conține 21% grăsimi și 0,15% colesterol) (Tabelul 2). Au fost date diete timp de 8 săptămâni pentru animale pentru a induce obezitatea. După 8 săptămâni, toate grupurile hrănite cu conținut ridicat de grăsimi au primit apă distilată sau simvastatină zilnic și sau tratament cu HCE intragastric, la 3 ore după administrarea de simvastatină. Extractul din plante sau simvastatina a fost dizolvat în 0,5% metilceluloză (Sigma-Aldrich Corporation, SUA) în apă distilată la o concentrație cunoscută. Un volum precalculat a fost administrat intragastric fiecărui animal în funcție de greutatea individului, astfel încât volumul calculat să conțină cantitatea necesară din doza propusă. Detaliile acestor grupuri sunt următoarele:

Grupa a) Dieta normal-chow plus apă distilată

Grupa b) Dietă bogată în grăsimi plus apă distilată

Grupa c) Dietă bogată în grăsimi plus simvastatină (50 mg/kg)

Grupa d) Dietă bogată în grăsimi plus HCE (4,4 g/kg)

Grupa e) Dietă bogată în grăsimi plus simvastatină (25 mg/kg) plus HCE (4,4 g/kg)

Aportul de alimente a fost înregistrat zilnic și greutatea corporală a fost măsurată de două ori pe săptămână. La sfârșitul studiului de 16-săptămâni, toți șoarecii au fost sacrificați după 16-oră de post peste noapte. Animalele au fost anesteziate cu un amestec de ketamina (100 mg/kg) și xilazină (10 mg/kg) intraperitoneal. Sângele a fost extras prin puncție cardiacă și lăsat să se coaguleze. Plasma a fost separată prin centrifugare (3,000 rpm timp de 10 minute). Ficatul a fost excizat și păstrat la -80 de grade până la analiză.

Măsurarea lipidelor plasmatice și hepatice.

Trigliceridele plasmatice, colesterolul (11488872216 și 11489232216, Roche Diagnostics, Elveția), colesterolul cu lipoproteine ​​de înaltă și densitate joasă (L-Type HDL-C și L-Type LDL-C, Wako Pure Chemicals Industries, Japonia) au fost măsurate prin concentrații metode enzimatice folosind trusa disponibilă în comerț conform instrucțiunilor producătorului. Activitatea creatinkinazei plasmatice (CK) a fost determinată utilizând trusa Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, SUA). Lipidele hepatice totale au fost determinate gravimetric după extracție prin metoda lui Bligh și Dyer24. Lipidele hepatice individuale au fost cuantificate enzimatic (așa cum este descris mai sus) după solubilizare în izopropanol (Sigma-Aldrich, SUA)25.

Evaluarea histopatologiei și inflamației hepatice. Colorație cu hematoxilină și eozină (colorare H&E). Secțiuni de căpușe (5 μm) de țesut încorporat în parafină au fost tăiate cu un microtom și plasate pe lame de microscop SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, SUA). Secțiunile au fost supuse colorării H&E conform metodei lui Harris și colab. 26 și montat cu dibutil-ftalat în histonă (DPX) (Sigma-Aldrich, SUA)25.

Colorare și cuantificare Mac-3. Secțiuni groase (5 μm) de țesut încorporat în parafină au fost tăiate folosind un microtom și plasate pe lame de microscop SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, SUA). A fost efectuată extragerea antigenului, urmată de blocarea cu Peroxidază Block (Dako Cytomation, Danemarca). Anticorpul Mac-3 anti-șoarece primar purificat (BD Pharmingen, SUA) a fost aplicat pe secțiuni la o diluție de 1:50. Colorarea specifică a fost detectată folosind sistemele EnVision™ (Dako, Danemarca). Lamele au fost incubate cu anticorpul secundar, IgG anti-iepure conjugat cu polimer EnVision-HRP la o diluție de 1:200. Mac-3 a fost detectat folosind soluție DAB (Dako, Danemarca) și contracolorat cu hematoxilină. Secțiunile au fost apoi montate în DPX. Prezența macrofagelor în ficat a fost detectată prin imunohistochimie cantitativă folosind software-ul ImageJ.

Analize statistice. Diferențele dintre grupurile de tratament și de control au fost testate cu analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul de comparație multiplă posthoc Bonferroni. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism Versiunea 6.0 (GraphPad, SUA). O probabilitate de p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Rezultate

EfectulHerbaCistancheE privind toxicitatea musculară indusă de simvastatină la șobolani. Masurarea masei musculare si a creatinkinazei plasmatice. Cinci tipuri diferite de mușchi (cvadriceps, gastrocnemius, soleus, tibial anterior și mușchi extensor al degetelor lungi) au fost izolate de la toți șobolanii tratați. Efectele diferitelor tratamente asupra greutății musculare sunt prezentate în Fig. 1a. Simvastatina (640 mg/kg) a indus o scădere semnificativă a greutății asupra mușchilor cvadriceps, gastrocnemius și tibial anterior la șobolani, în timp ce aceste reduceri au fost restabilite semnificativ de HCE asupra mușchilor cvadriceps și gastrocnemiu într-o manieră dependentă de doză. Cu toate căHerbaCistancheE a exercitat o tendință de a restabili greutatea mușchiului tibial anterior la șobolanii tratați cu simvastatină, niciunul dintre aceste grupuri de tratament nu a atins semnificație statistică. Nu a fost observat niciun efect semnificativ al tratamentului cu HCE singur asupra greutății musculare în comparație cu șobolanii de control (Fig. 1a).

Figura 1b a arătat efectele diferitelor tratamente asupra nivelurilor plasmatice ale creatinkinazei (CK) la șobolani. Simvastatina a indus o creștere semnificativă a activității creatinkinazei la șobolani, care a fost redusă semnificativ prin co-tratamentele cu HCE la ambele doze. De asemenea, nu a existat un efect semnificativ al tratamentului cu HCE singur asupra nivelurilor de CK în comparație cu grupul de control. Deoarece gastrocnemiul pare a fi sensibil la tratamentul cu simvastatină și este cel mai mare mușchi izolat în masă, am ales acest mușchi pentru o analiză ulterioară, inclusiv măsurarea glutationului peroxidazei musculare (GPx), măsurarea MMP și ROS mitocondrială și evaluarea histologiei musculare și a inflamației. .

Măsurarea glutation peroxidazei (GPx) musculară. Nivelurile de glutation peroxidazei musculare au fost măsurate și prezentate în Fig. 2a. Administrarea de simvastatină a indus o tendință de reducere a măsurării glutation peroxidazei musculare (GPx) la șobolani. Cu toate acestea, HCE a exercitat o tendință de a ameliora reducerea indusă de simvastatină a GPx muscular la ambele doze de 1,1 g/kg și 2,2 g/kg. De asemenea, nu a existat un efect semnificativ al tratamentului cu HCE în monoterapie asupra nivelurilor GPx musculare în comparație cu șobolanii de control normali.

Măsurarea potențialului de membrană mitocondrială (MMP) și a ROS. Tratamentul cu simvastatină (640 mg/kg) a indus o reducere semnificativă a MMP musculară (Fig. 2b). Această reducere a fost îmbunătățită în funcție de doză la șobolanii care au primit co-tratament cu HCE și simvastatină (Fig. 2b). Pe de altă parte, interesant, grupul de tratament cu simvastatină în monoterapie a redus semnificativ nivelurile ROS mitocondriale musculare în comparație cu grupul de control normal (Fig. 2c). Cu toate acestea, tratamentul cu HCE administrat șobolanilor tratați cu simvastatină a exercitat o tendință dependentă de doză de a restabili nivelurile ROS mitocondriale musculare la nivelul normal. De asemenea, nu a existat un efect semnificativ al tratamentului cu HCE singur la șobolani, comparativ cu grupul de control normal, atât pentru măsurarea MMP mitocondrială, cât și pentru ROS.

Evaluarea histologiei musculare și a inflamației. Mușchii gastrocnemius de la șobolani cărora li sa administrat diferite tratamente au fost analizați în continuare histologic, iar secțiunile colorate reprezentative sunt prezentate în Fig. 3a. Animalele din grupul de control au demonstrat secțiunile histologice ale mușchilor normali. În schimb, secțiunile H&E de la animalele tratate cu simvastatină au evidențiat infiltrarea markerilor inflamatori (săgeți galbene), care a fost redusă semnificativ în acele secțiuni musculare ale șobolanilor, având în vedere combinația de simvastatină și HCE. S-au efectuat și analize imunohistochimice pentru prezența macrofagelor CD68 și CD163 în Figurile 4a și, respectiv, 5a, cu cuantificări ale macrofagelor respective prezentate în Figurile 4b și 5b. Analiza imunohistochimică a secțiunilor musculare a dezvăluit prezența macrofagelor (CD68) la șobolanii tratați cu simvastatină (colorație maro), care a fost redusă semnificativ la șobolani având în vedere co-tratamentul HCE la ambele doze (Fig. 4b). De asemenea, nu a fost observată nicio inflamație semnificativă la animalele tratate numai cu HCE. În mod similar, analiza imunohistochimică a secțiunilor musculare a dezvăluit prezența macrofagelor CD163-pozitive la șobolanii tratați cu simvastatină (colorație maro), care a fost redusă semnificativ la șobolani având în vedere co-tratamentul cu HCE la 2,2 g/kg (Fig. 5b). ). De asemenea, nu a fost observată nicio inflamație semnificativă la animalele tratate numai cu HCE.

Analiza expresiei genelor musculare. Pentru a determina efectele simvastatinei și HCE asupra genelor legate de stresul oxidativ din mușchi, testul PCR care profilează genele legate de stresul oxidativ a fost efectuat utilizând matrice PCR de stres oxidativ la șobolan și de apărare antioxidantă. Genele care au fost afectate semnificativ de tratamentul cu simvastatină au fost analizate și prezentate în Fig. 6. Pentru profilul de expresie al genelor care reglează antioxidanții, șobolanii tratați cu simvastatină (640 mg/kg) au crescut expresia genelor care reglează antioxidanții. Acestea includ glutation peroxidaze (GPx) GPx1 și GPx7 și alte peroxidaze, inclusiv Serpinb1b și club (Fig. 6a). HCE la ambele doze (1,1 sau 2,2 g/kg) a redus aceste creșteri induse de simvastatină ale GPxs și ale altor peroxidaze la niveluri normale. Pe de altă parte, tratamentul cu HCE singur a crescut semnificativ nivelurile de expresie ale GPx1. În ceea ce privește expresia genelor care reglează metabolismul ROS, simvastatina a indus în mod semnificativ expresia altor gene ale metabolismului superoxidului, inclusiv Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 și Ucp2. În mod similar, HCE la ambele doze a redus semnificativ aceste creșteri (Fig. 6b). În plus, simvastatina a indus expresia genelor sensibile la stres oxidativ, inclusiv Apoe, Ccl5 și Txn1, în timp ce aceste expresii au fost reduse semnificativ la animalele tratate concomitent cu HCE la ambele doze (Fig. 6c). Pe de altă parte, simvastatina a provocat o reducere semnificativă a expresiei genice a Txnip. Nu a existat un efect semnificativ al HCE asupra reducerii induse de simvastatină a expresiei genei Txnip (Fig. 6c). Simvastatina a exercitat, de asemenea, o creștere semnificativă a expresiei genelor care reglează transportatorii de oxigen, inclusiv Slc38a1 și Vim. Co-tratamentul cu HCE a redus expresia acestor gene la ambele doze (Fig. 6d).

Efectele utilizării combinate a Simvastatinului și HCE asupra aportului de alimente și a greutății corporale la șoareci. Figura 7a a arătat aportul zilnic de hrană al șoarecilor pentru toate grupurile de tratament. O dietă bogată în grăsimi a indus o creștere semnificativă a aportului alimentar zilnic al animalelor în comparație cu animalele hrănite cu mâncare (p.<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Măsurarea săptămânală a greutății corporale. După 16 săptămâni de hrănire bogată în grăsimi, animalele hrănite cu HF au câștigat în mod semnificativ mai multă greutate decât animalele hrănite cu mâncare (Fig. 7b). Cu toate acestea, nu a existat niciun efect semnificativ între șoarecii hrăniți cu HF și toate grupurile de tratament hrăniți cu HF. De asemenea, nu a existat nicio diferență semnificativă între șoarecii hrăniți cu HF care au primit co-tratament cu simvastatină și HCE față de șoarecii hrăniți cu HF care au primit numai HCE sau simvastatină (Fig. 7b).

Efectele utilizării combinate a Simvastatinului și HCE asupra hiperlipidemiei și steatozei hepatice la șoareci. Măsurarea activității lipidelor plasmatice și a creatinkinazei. Nivelurile lipidelor plasmatice ale tuturor șoarecilor sunt prezentate în Fig. 8. În comparație cu șoarecii obișnuiți hrăniți cu alimente, șoarecii hrăniți cu HF au avut niveluri semnificativ crescute de colesterol total plasmatic (TC), care au fost reduse semnificativ în toate grupurile de tratament (Fig. 8a) . Șoarecii hrăniți cu HF tratați cu simvastatină și HCE au avut un TC plasmatic semnificativ mai scăzut în comparație cu animalele HF cărora li sa administrat simvastatină în monoterapie sau animalele HF cărora li s-a administrat HCE singur (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

TG plasmatic mai mic comparativ cu șoarecii hrăniți cu HF cărora li s-a administrat singur tratament cu simvastatină (p<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">măsurarea lipidelor iver.

Efectele diferitelor grupuri de tratament asupra hepatomegaliei induse de HF (ficat mărit) au fost asociate cu o reducere semnificativă a conținutului total de lipide hepatice, exprimat ca miligram de lipide per ficat (Fig. 9a). Conținutul total de lipide hepatice a fost semnificativ mai mare la șoarecii hrăniți cu HF comparativ cu șoarecii obișnuiți hrăniți cu mâncare (de 3,0-ori mai mare, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

După cum se arată în Fig. 9b și c, măsurarea colesterolului total hepatic (TC) și a trigliceridelor hepatice (TG) a arătat că șoarecii hrăniți cu HF au avut niveluri crescute ale ambelor lipide în comparație cu șoarecii obișnuiți hrăniți cu mâncare (adică 3.{{4}). }creștere de ori în TC, p<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Evaluarea inflamației ficatului. Colorarea imunohistochimică a fost efectuată pentru a colora prezența macrofagelor (Mac-3) (Fig. 10a). Analiza imunohistochimică a secțiunilor hepatice a evidențiat prezența Mac-3 atât la șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi, cât și la șoarecii hrăniți cu alimente normale (colorație maro). Această inflamație a fost crescută în continuare la animalele tratate cu simvastatină, deși o astfel de creștere nu a atins semnificație statistică. Interesant, tratamentul cu HCE, cu sau fără co-tratament cu simvastatină, a redus semnificativ inflamația la șoarecii hrăniți cu grăsimi. Când se compară între toate grupurile de tratament, tratamentul cu HCE, cu sau fără co-tratament cu simvastatină, a avut, de asemenea, o inflamație semnificativ mai scăzută în comparație cu grupul de tratament cu simvastatină (p.<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Continuați lectură ...