Partea a treia DsbA-L interacționează cu VDAC1 în apoptoza celulelor tubulare mediată mitocondrion și contribuie la progresia bolii acute de rinichi

7. Generarea de șoareci PT-VDAC1-KO

Pentru a investiga rolul VDAC1 în AKI, am stabilit un model de șoarece care prezintă knockout-ul VDAC1 în tubii proximali ai rinichilor. Figura 7a arată protocolul de reproducere utilizat pentru a genera PT-VDAC1-KO. RT-PCR a fost folosită pentru a genotipa șoarecii PT-VDAC1-KO; aceasta a fost realizată prin amplificarea unei alele floxate cu fragment 416-bp ADN și a unui fragment 370-bp ADN al genei Cre (Figura 7, b; benzile 4 și 6). Șoarecilor de tip sălbatic (PT-VDAC1-WT) le lipsea gena Cre (Figura 7, b, benzile 2 și 3). Analiza imunoblot a indicat că nivelurile de expresie ale VDAC1 în cortexele renale ale șoarecilor PTVDAC1-KO au fost mai mici decât cele ale șoarecilor PTVDAC1-WT după tratament ischemic sau simulat (Figura 7 c și d). Acest lucru a fost verificat în continuare prin colorarea imunohistochimică a VDAC1 (Figura 7e). Aceste date au verificat că am creat cu succes un model de mouse PT-VDAC1-KO.

Figura 7. Crearea și caracteristicile modelului de mouse PT-VDAC1-KO. (a, b) Protocolul de reproducere pentru generarea de șoareci PTVDAC1-KO și detectarea prin PCR a genotipului alelelor de tip sălbatic și floxate ale alelei VDAC1 și PEPCK-Cre. (c) Analiza imunoblot a VDAC1 și b-tubulinei folosind țesuturi corticale renale ale șoarecilor PT-VDAC1-KO și PT-VDAC{1-WT, după leziuni IR. (d) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. (e) Colorarea imunohistochimică a VDAC1 în țesuturile corticale renale ale șoarecilor de tip sălbatic și VDAC1 după leziuni IR. Mărire originală x 400. Scar Bar: 100µM. Fiecare experiment (c & e) a fost repetat de 6 ori independent cu rezultate similare. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru comparațiile cu grupuri multiple (d). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Faceți clic aici pentru a afla beneficiile Cistanche

8. Leziunea renală indusă de I/R, apoptoza celulelor tubulare și deteriorarea mitocondrială au fost ameliorate la șoarecii PTVDAC1-KO

Colegii de pui ai șoarecilor PT-VDAC1-WT și PT-VDAC1-KO au fost tratați cu ischemie (28 min) urmată de leziuni de reperfuzie (48 ore). Apoi am obținut probe de sânge și țesuturi renale pentru o examinare ulterioară. Am descoperit că PT-VDAC1-KO a suprimat în mod semnificativ creșterea indusă de I/R a nivelurilor de BUN și creatinine (Figura 8 a și b). În al doilea rând, analizele histologice și TUNEL au demonstrat în continuare că PT-VDAC1-KO a atenuat semnificativ leziunile tisulare induse de I/R și apoptoza celulelor renale (Figura 8 c, d, f și g). În al treilea rând, analizele EM au constatat că PT-VDAC1-KO a atenuat semnificativ deteriorarea mitocondrială indusă de I/R (Figura 8 e și h). În cele din urmă, imunoblotting a confirmat că șoarecii PT-VDAC1-KO au prezentat niveluri reduse de caspază scindată-3, o acumulare mai mică de Bax în mitocondrii și rate mai scăzute de eliberare a Cyt-c în citosol (Figura 8 I-o). Aceste date au indicat că VDAC1 a mediat și AKI indusă de I/R.

Figura 8. Atenuarea leziunii renale induse de IR, apoptoza celulelor tubulare, deteriorarea mitocondriilor și expresia Bax, Cyt-c și a caspazei clivate3 la șoarecii PT-VDAC1-KO. Arterele renale bilaterale ale șoarecilor PT-VDAC1-KO și PT-VDAC1-WT littermate au fost prinse timp de 28 de minute și apoi eliberate timp de 48 de ore pentru a stabili un model IR. (a) BUN. (b) Creatinina serică. (c) Colorare cu hematoxilină și eozină. (d) Secțiuni reprezentative ale celulelor pozitive TUNEL. (e) Detectarea cu microscopul electronic a morfologiei mitocondriilor. (f) Scorul de deteriorare tubulară. (g) Numărul de celule TUNEL-pozitive. (h) Scorul leziunilor mitocondriale. (i) Imunobloturile analizează expresia caspazei clivate3, VDAC1 și DsbA-L, precum și expresia BAX și Cyt-c în fracțiile mitocondriale și citosolice. b-tubulina și GAPDH au fost utilizate ca control al încărcării întregului lizat sau, respectiv, citosolic. COX IV a fost folosit ca control al încărcării mitocondriilor. (j- p) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. Mărire originală x 400. Scar Bar: 100 µM în c & d 20 µM în e. Fiecare experiment (c-e&i) a fost repetat de 6 ori independent, cu rezultate similare. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru comparațiile cu grupuri multiple (a, b, f-h&j-p). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. Supraexpresia leziunilor renale induse de I/R agravate de DsbA-L a fost atenuată la șoarecii PT-VDAC1-KO

de DsbA-L în timpul leziunii ischemice. Cu o săptămână înainte de stabilirea modelului de șoarece al IR, am injectat vena coadă a fiecărui șoarece cu plasmida DsbA-L (injecția a fost efectuată de două ori în această săptămână). Supraexpresia DsbA-L a agravat creșterea indusă de IR a expresiei BUN și creatininei, afectarea renală și apoptoza renală; aceste efecte au fost atenuate la șoarecii PTVDAC1-KO (Figura 9 a-d, e și f). Rezultatele imunoblot au indicat în plus că supraexprimarea DsbA-L a sporit creșterea indusă de IR a caspazei scindate-3, acumularea de Bax în mitocondrii și eliberarea Cyt-c în citosol; aceste efecte au fost reduse la șoarecii PT-VDAC1-KO (Figura 9 g și h-l). Colectiv, aceste rezultate au demonstrat în continuare că VDAC1 a mediat efectul DsbA-L în timpul leziunii ischemice.

Figura 9. Supraexpresia leziunii renale induse de I/R agravată de DsbA-L a fost atenuată la șoarecii PT-VDAC1-KO. Șoarecii PT-VDAC1-KO și PT-DsbA-L-WT au fost tratați cu sau fără plasmidă DsbA-L și apoi au stabilit un model IR. (a)BUN. (b) Creatinina serică. (c) Colorare cu hematoxilină și eozină. (d) Secțiuni reprezentative ale celulelor pozitive TUNEL. (e) Scorul de deteriorare tubulară. (f) Numărul de celule TUNEL-pozitive. (g) Imunobloturile au analizat expresia caspazei clivate3, VDAC1 și DsbA-L, precum și expresia BAX și Cyt-c în fracțiile mitocondriale și citosolice. b-tubulina și GAPDH au fost utilizate ca control al încărcării întregului lizat sau, respectiv, citosolic. COX IV a fost folosit ca control al încărcării mitocondriilor. (h- n) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. Mărire originală x 400. Scar Bar: 100mM. Fiecare experiment (c-e) a fost repetat de 6 ori independent cu rezultate similare. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru comparațiile cu grupuri multiple (a, b și f-n). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Supliment Cistanche

10. Atenuarea leziunii renale induse de I/R la șoarecii PTDsbA-L-KO a fost redusă prin supraexprimarea VDAC1

Pentru a confirma în continuare dacă deteriorarea tubulară mediată de DsbA-L a fost dependentă de VDAC1, șoarecii littermate ai șoarecilor PTDsbA-L -WT și PT-DsbA-L -KO au fost mai întâi expuși la tratament I/R și apoi injectați prin vena cozii. cu plasmida de supraexpresie VDAC1. Creșterea indusă de I/R a nivelurilor BUN și creatininei a fost ameliorată la șoarecii PT-DsbA-L-KO; cu toate acestea, acest efect a fost prevenit de supraexprimarea VDAC1 (Figura 10 a și b). Colorația HE și TUNEL a arătat că amploarea relativă a leziunii țesutului renal indusă de IR și a apoptozei celulelor renale au fost reduse la șoarecii PT-DsbAL-KO și că aceste efecte au fost blocate de supraexprimarea VDAC1 (Figura 10 c-f). Imunoblotting a arătat că șoarecii PT-DsbA-L-KO au avut niveluri mai scăzute de caspază scindată-3, niveluri mai scăzute de acumulare de Bax în mitocondrii și rate mai scăzute de eliberare a Cyt-c în citosol; cu toate acestea, aceste efecte au fost eliminate prin supraexprimarea VDAC1 (Figura 10 g-m). Aceste date au susținut faptul că DsbA-L a promovat leziunea ischemică într-un mod care a fost dependent de VDAC1.

Figura 10. Leziunea renală la șoareci indusă de IR ameliorată cu PT-DsbA-L-KO a fost diminuată de supraexprimarea VDAC1. Șoarecii PT-DsbA-L-KO și PT-DsbA-L-WT au fost tratați cu sau fără plasmidă VDAC1 și apoi au stabilit un model IR. (a) BUN. (b) Creatinina serică. (c) Colorare cu hematoxilină și eozină. (d) Secțiuni reprezentative ale celulelor pozitive TUNEL. (e) Scorul de deteriorare tubulară. (f) Numărul de celule TUNEL-pozitive. (g) Imunobloturile au analizat expresia caspazei clivate3, VDAC1 și DsbA-L, precum și expresia BAX și Cyt-c în fracțiile mitocondriale și citosolice. b-tubulina și GAPDH au fost utilizate ca control al încărcării întregului lizat sau, respectiv, citosolic. COX IV a fost folosit ca control al încărcării mitocondriilor. (hm) Analiza imaginii în tonuri de gri dintre ele. Mărire originală x 400. Scar Bar: 100mM. Fiecare experiment (c, d și g) a fost repetat de 6 ori independent, cu rezultate similare. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru comparațiile cu grupuri multiple (a, b, e, f și h-m). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. Leziunea renală indusă de CLP a fost atenuată la șoarecii PT-DsbA-LKO sau PT-VDAC1-KO

AKI indusă de sepsis este o altă cauză comună a AKI în practica clinică. Colegii PT-DsbA-L sau VDAC-WT și PT-DsbA-L sau VDAC1-KO au fost supuși modelului CLP și apoi eutanasiați la 18 ore după operație. Rezultatele au indicat că șoarecii PT-DsbA-L sau VDAC1- KO au redus semnificativ creșterile induse de CLP ale nivelurilor BUN și creatininei, precum și nivelurile crescute de leziuni ale țesutului renal și apoptoza celulelor renale (Figurile S1 și S2 a-f ). Imunoblotting a confirmat că șoarecii PTDsbA-L sau VDAC1-KO au prezentat, de asemenea, niveluri reduse de caspază scindată-3, niveluri mai scăzute de acumulare de Bax în mitocondrii și rate mai scăzute de eliberare a Cyt-c în citosol (Figurile S1 și S2 g- n). Colectiv, aceste date au demonstrat că atât DsbA-L, cât și VDAC1 au mediat progresia AKI septic.

12. Leziunea renală indusă de VAN a fost atenuată la șoarecii PT-DsbAL-KO sau PT-VDAC1-KO

AKI indusă de vancomicină (VAN) este, de asemenea, un model important pentru AKI. Tovarășii PT-DsbA-L sau VDAC1-WT și PT-DsbA-L sau VDAC1-KO au fost injectați intraperitoneal cu VAN (600 mg/kg) timp de 7 zile consecutiv. Rezultatele au indicat că șoarecii PT-DsbA-L sau VDAC1-KO au redus semnificativ creșterea indusă de VAN a nivelurilor BUN și creatininei, afectarea țesutului renal și apoptoza celulelor renale (Figurile S3 și S4 an-f). Analizele imunoblot au confirmat în continuare că șoarecii PTDsbA-L sau VDAC1-KO au prezentat, de asemenea, niveluri reduse de caspază scindată-3, o măsură mai mică a acumulării de Bax în mitocondrii și rate mai scăzute de eliberare a Cyt-c în citosol (Figurile S3 și S4 g- m). În rezumat, aceste date au demonstrat că atât DsbA-L, cât și VDAC1 au mediat AKI indusă de VAN.

Extract de Cistanche

13. Apoptoza celulelor HK-2 mediată de I/R mediată de DsbA-L a fost asociată cu VDAC1

Rezultatul de mai sus a constatat că DsbA-L a fost implicat în apoptoza celulelor BUMPT, cu toate acestea, funcția DsbA în celulele tubulare renale umane rămâne neclară. ARNsi DsbA-L a fost transfectat în celule HK2 și apoi expus la epuizarea ATP timp de 2 ore și recuperare timp de 2 ore. Rezultatele imunoblot au demonstrat că siRNA DsbA-L a ameliorat în mod semnificativ creșterea indusă de I/R a expresiei caspazei scindate-3 și VDAC1, acumularea crescută de Bax în mitocondrii și producția crescută de Cyt-c în citosol ( Figura S5 an- h). Datele au sugerat, de asemenea, că rolul DsbA-L în apoptoza celulelor HK2 a fost legat de VDAC1 în timpul tratamentului I/R.

14. Apoptoza celulelor HK-2 mediată de I/R mediată de DsbA-L este dependentă de VDAC1

Pentru a verifica în continuare dacă rolul DsbA-L în apoptoza celulelor HK2 este dependent de VDAC1. Mai întâi, celulele HK2 au fost co-transfectate cu siRNA DsbA-L plus cu sau fără plasmidă VDAC1 și apoi au fost expuse la epuizarea ATP timp de 2 ore și la recuperare timp de 2 ore. Rezultatele imunoblot au indicat că siRNA DsbA-L a atenuat semnificativ creșterea indusă de I/R a exprimării caspazei scindate-3 și VDAC1, acumularea crescută de Bax în mitocondrii și producția crescută de Cyt-c în citosol, acest efect a fost inversat prin supraexprimarea plasmidei VDAC1 (Figura S6a-h). În al doilea rând, celulele HK2 au fost co-transfectate cu ARNsi VDAC1 plus cu sau fără plasmidă DsbA-L și apoi au fost expuse la I(2 h)/R(2 h). Rezultatele imunoblot au arătat că siRNA VDAC1 a ameliorat în mod semnificativ creșterea indusă de I/R a exprimării caspazei scindate-3 și VDAC1, acumularea crescută de Bax în mitocondrii și producția crescută de Cyt-c în citosol, acest efect nu a fost îmbunătățită de supraexprimarea plasmidei DsbA-L (Figura S7a-h). Datele au verificat în mod clar că VDAC1 a mediat rolul pro-apoptoză al DsbA-L în celulele HK-2 în timpul tratamentului I/R.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h și Dongshan Zhang a,b *

un Departament de Medicină de Urgență, Republica Populară Chineză

b Institutul de Medicină de Urgență și Boli Dificile, Spitalul II Xiangya, Universitatea Central South, Changsha, Hunan 410011, Republica Populară Chineză

c Departamentul de Oftalmologie, Republica Populară Chineză

d Departamentul de Chirurgie Urinară, Republica Populară Chineză

e Departamentul de Chirurgie toracică, Republica Populară Chineză

f Departamentul de Chirurgie Generală, Spitalul II Xiangya, Republica Populară Chineză

g Departamentul de Sănătate Publică, Universitatea Central South, Changsha, Hunan, Republica Populară Chineză

h Departamentul de Endocrinologie, Spitalul Popular din Shenzhen, Cel de-al doilea colegiu medical clinic al Universității Jinan, Primul Spital afiliat al Universității de Știință și Tehnologie de Sud, Shenzhen, Republica Populară Chineză

1 Xiaozhou Li și Jian Pan au contribuit în mod egal la acest studiu