Partea 1: Geraniolul ameliorează leziunea renală mediată de doxorubicină prin modificarea stării antioxidante, a inflamației și a apoptozei: Roluri potențiale ale NF-kB și Nrf2/Ho-1

Pentru mai multe informatii. a lua legaturatina.xiang@wecistanche.com

Abstract: mediat de doxorubicinăinsuficiență renalăeste o problemă serioasă în tratamentul cancerului. În consecință, această lucrare a investigat capacitatea geraniolului de a modula indusă de doxorubicinăafectarea rinichilorfolosind un model de șobolan. Șobolanii au fost repartizați aleatoriu în patru grupuri: martor, doxorubicină (20 mg/kg, intraperitoneal, ip), doxorubicină plus 100 mg/kg geraniol și doxorubicină plus 200 mg/kg geraniol. O singură injecție cu doxorubicină a declanșat insuficiență renală, evidențiată de valorile modificate ale creatininei serice, azotului ureic din sânge și albuminei; a provocat, de asemenea, modificări histologice în arhitectura rinichilor. În plus, doxorubicina a îmbunătățit peroxidarea lipidelor în timp ce reduce glutationul, activitatea catalazei și expresia glutation peroxidază și superoxid dismutază. Interesant, pre-tratamentul cu geraniol a salvat modificările induse de doxorubicină ale parametrilor antioxidanti renali, activitatea enzimatică și expresia genelor și proteinelor inflamatorii și mediatoare de apoptoză. Mai mult, tratamentul profilactic cu geraniol a păstrat majoritatea caracteristicilor histologice ale rinichilor într-o manieră dependentă de doză. Aceste descoperiri susțin că geraniolul ar putea proteja împotriva mediată de doxorubicinădisfuncție renală. Cu toate acestea, sunt necesare cercetări suplimentare pentru a clarifica mecanismele efectelor protectoare ale geraniolului împotriva disfuncției renale mediate de doxorubicină.

Cuvinte cheie: doxorubicină; inflamaţie; stresul oxidativ; apoptoza; leziuni renale; geraniol

1. Introducere

De la descoperirea sa, medicamentul anti-cancer cu antraciclină doxorubicină (Dox) a fost utilizat pe scară largă împotriva tumorilor solide și a tumorilor maligne hematologice. Printre cele mai frecvente efecte secundare ale sale este nefrotoxicitatea, descrisă ca disfuncție renală cu filtrare, reabsorbție și excreție reduse, care este asociată cu un risc semnificativ de morbiditate și mortalitate. Aproximativ 60% dintre pacienții cu cancer care primesc chimioterapie dezvoltă nefrotoxicitate, limitând eficacitatea terapeutică a Dox[5,6]. În timp ce procesele fundamentale care provoacă nefrotoxicitatea mediată de Dox rămân necunoscute, literatura sugerează că contribuitorii probabili includstresul oxidativ, inflamaţie, șiapoptoza. În special, dovezile indică faptul că reducerea Dox-asociatăstresul oxidativ, inflamaţie, iar evenimentele apoptotice pot ajuta la reducerea toxicității renale a medicamentului.

Factorul nuclear (derivat din eritroide 2)-like 2 (Nrf2) este un factor transcripțional sensibil la redox, cu abilități antioxidante, antiinflamatorii și citoprotectoare care susțin sistemele celulare de apărare. La stresul oxidativ, Nrf2 eliberează proteina inhibitoare citoplasmatică, care intră în nucleu și activează mai multe gene implicate în apărarea antioxidantă, cum ar fi hemoxigenaza-1(Ho{-1), glutation peroxidaza (GPx), catalaza( CAT) și superoxid dismutază (SOD) [14-19]. S-a demonstrat că tratamentul cu Dox reduce atât expresia mARN, cât și a proteinei Nrf2 și, prin urmare, cea a genelor și proteinelor antioxidante din aval, ceea ce duce la toxicitate renală.

Factorul nuclear-kB (NF-kB) este un factor transcripțional care reglează expresia multor gene inflamatorii; ca figura centrală a căii NF-kB, care este activată de speciile reactive de oxigen (ROS), poate declanșa un răspuns inflamator și leziuni tisulare rezultate [8,22,23]. Numeroase studii au raportat că Dox provoacă inflamație și crește producția de citokine proinflamatorii, cum ar fi interleukina-6(IL{-6), interleukina-1 beta (L{-1), şi factor de necroză tumorală-alfa (TNF-)[11,13]. În plus, s-a demonstrat că creșterea producției de ROS după afectarea rinichilor mediată de Dox joacă un rol cheie în activarea căii apoptotice intrinseci prin instabilitatea mitocondrială. Determinanții cheie ai acestei căi sunt proteinele asociate mitocondriale Bax și Bcl-2; un raport echilibrat dintre Bcl-2 și Bax previne apoptoza, în timp ce dezechilibrul duce la creșterea permeabilității membranei și la scurgerea citocromului c în citosol, care activează caspaza-9(Casp{-9) și caspaza{ {21}} (Casp-3). O astfel de activare duce în general la fragmentarea ADN-ului și moartea celulelor.

Este de mare interes să se maximizeze utilizarea clinică a medicamentelor chimioterapeutice minimizând în același timp efectele negative ale acestora. În consecință, au fost întreprinse eforturi de cercetare pentru a investiga utilizarea diverșilor agenți în combinație cu Dox pentru a ameliora efectele adverse ale acestuia [13,30,31]. Extractele din plante și ingredientele lor bioactive sunt recunoscute de multă vreme pentru capacitatea lor de a reduce toxicitatea mediată de medicamente. Geraniolul este alcool monoterpenic aciclic care se găsește în aproape toate uleiurile esențiale, cum ar fi cele din ghimbir, trandafir, portocală, lavandă și lămâie [32,33]. Numeroase studii au raportat că geraniolul are diverse proprietăți benefice, cum ar fi anti-ulcer, anti-cancer [35], antidepresiv [36], antiinflamator [33] și, în plus, poate ușura nefropatia diabetică [37] .

Din câte cunoștințele noastre, în prezent nu există informații specifice cu privire la efectele preventive ale geraniolului împotriva nefrotoxicității mediate de Dox. Prin urmare, am studiat efectele și mecanismele probabile ale acțiunii geraniolului asupra rănilor cauzate de Dox prin căile de semnalizare NF-kB și Nrf2/Ho-1 în rinichii șobolanilor Wistar.

2. Material și metode

2.1.Animale

Șobolanii masculi Wistar au fost procurați de la centrul de îngrijire a animalelor King Saud University (KSU) din Riad, Arabia Saudită. Animalele au fost menținute în condiții controlate, cum ar fi au fost ținute la temperatura camerei (25 ± 1 grad) cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și au avut acces nerestricționat la apă și o dietă standard, așa cum este autorizat de Comitetul de etică al studiului instituțional local al KSU. (REC) sub numărul de autorizare KSU-SE-19-122.

2.2. Design experimental

Această investigație a examinat un total de 32 de șobolani Wistar masculi cântărind 190-210 g, alocați în patru grupuri. Sobolanilor li s-a dat o saptamana pentru a se adapta la mediu inaintea studiului. Grupul vehicul, cunoscut și ca grupul de control, a fost format din șobolani cărora li sa administrat o formulare orală de soluție salină normală. Grupul II a constat din șobolani cărora li sa administrat Dox (doză unică de 20 mg/kg ip) în ziua 17 [11]. Șobolanii din grupul ⅢI și IV li s-au administrat doze profilactice de geraniol (pe cale orală) la 100 și, respectiv, 200 mg/kg, timp de 18 zile, iar în ziua 17 au fost, de asemenea, supuși Dox (20 mg/kg, ip). În ziua 18, șobolanii au fost eutanasiați folosind o combinație de ketamina/xilazină într-un mediu controlat. S-a recoltat sânge și a fost izolat serul, iar ambii rinichi au fost îndepărtați și imediat congelați rapid în azot lichid. Testele biochimice, de expresie a genelor și proteinelor au fost efectuate pe țesuturile congelate. Pentru examinarea histologică, probele de țesut renal au fost spălate în PBS și apoi conservate într-o soluție de formaldehidă de 4%. Pe parcursul investigației, nu a existat niciun indiciu de suferință sau deces la un animal de experiment.

2.3. Determinarea markerilor funcției renale

Pentru a izola serul din sângele colectat în momentul sacrificiului, probele de sânge au fost centrifugate timp de 10 minute la 2000 x g într-o centrifugă pre-răcită. Serul obținut a fost apoi analizat pentru a cuantifica albumina, azotul ureic din sânge (BUN) și creatinina. Valorile defunctia rinichilormarkerii au fost calculați utilizând Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, SUA.

2.4.Eoaluarea peroxidării lipidelor

Peroxidarea lipidelor a fost evaluată în țesuturile renale așa cum a fost descris anterior de Ohkawa și colab., cu ușoare modificări.

2.5. Cuantificarea glutationului redus

Nivelurile de glutation redus (GSH) în supernatantul post-mitocondrial renal (PMS) au fost măsurate conform metodei descrise de Sedlak și Lindsay, cu modificări minore.

2.6. Cuantificarea activității catalazei

Activitatea CAT în sindromul premenstrual renal a fost determinată conform metodei descrise de Claiborne, cu modificări minore.

2.7. Analiza expresiei genelor (RT-qPCR)

Reactivul TRIzolTM (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA) a fost utilizat pentru a extrage ARN-ul total din țesuturile renale, conform instrucțiunilor producătorului. Puritatea și cantitatea specimenelor de ARN extrase au fost determinate folosind un spectrofotometru NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, SUA). ARN-ul izolat a fost apoi transcris invers în cADN folosind cDNA Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, SUA), iar expresia genei a fost cuantificată cu SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, SUA) pe Applied Biosystems 7500 Fast Real- Sistem Time PCR. Abordarea AACt a fost apoi utilizată pentru a determina expresia relativă a diferitelor gene între grupuri, cu GAPDH folosit ca genă de întreținere. Tabelul 1 listează secvențele de primer utilizate în acest studiu (IDT, Leuven, Belgia).

2.8. Analiza imunoblot

Analiza Western blot a fost efectuată așa cum este descris de Alasmari și colab. [41]. Pe scurt, proteinele izolate (30-50 ug) au fost supuse electroforezei pe geluri SDS-PAGE și apoi transferate pe membrane PVDF. După blocarea cu lapte uscat degresat 5% timp de 60 de minute, petele au fost testate peste noapte la 4 grade cu anticorpi primari selectivi (împotriva Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, clivată-caspază{{{{ 14}}, Bcl-2, Bax și GAPDH, diluție 1:1000). Membranele au fost ulterior spălate, apoi incubate timp de 60 de minute la temperatura camerei cu anticorpi secundari adecvați conjugați cu HRP (diluție: 1:5000). Kitul de reactivi ECL și echipamentele de imagistică cu gel (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) au fost utilizate pentru a detecta prezența proteinelor pe membrană.

2.9.Studii de histopatologie

Țesuturile renale au fost post-fixate în formaldehidă 4%, apoi procesate pentru secţionarea cu parafină şi colorare. Un microtom a fost folosit pentru a tăia secțiuni de parafină la o grosime de 3 μm. Secțiunile tăiate au fost apoi tratate pentru a îndepărta ceara și au fost colorate folosind colorant cu hematoxilină plus eozină (H&E) pentru examinarea histopatologică. Imaginile histologice ale rinichilor au fost obținute folosind o cameră DP72 cuplată la un microscop Olympus BX.

2.10.Analiza datelor

Datele au fost analizate cu programul computerizat Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA, SUA), iar rezultatele sunt prezentate ca medii și abateri standard (media ± SD). Diferențele dintre grupuri au fost evaluate folosind ANOVA unidirecțional urmată de testul de comparație al lui Tukey, cu o valoare p mai mică de 0,05 indicând semnificația statistică (p<>