Partea 2: Defciency DHHC21 atenuează disfuncția renală în timpul leziuni septice

Contacttina.xiang@wecistanche.com

Discuție

În lucrarea de față, raportăm DHHC21 ca un nou regulator al perfuziei renale și al funcției în timpul leziunilor septice. Noile noastre descoperiri indică: (1) Zdhhc21devde? șoarecii prezintă o funcție renală mai bună și mai puține leziuni renale după leziuni septice în comparație cu șoarecii WT;(2)Deficiența funcțională DHHC21 păstrează perfuzia țesutului renal, saturația oxigenului și RBF în leziuni septice;(3)Palmitoilarea alAR catalizată DHHC21 este necesară pentru activarea căii de semnalizare alAR și constricția indusă de alAR a arterelor renale. Acest studiu oferă o nouă perspectivă mecanicistă asupra reglementării perfuziei renale și a funcției în timpul leziunilor septice. Sugerăm că deficiența funcțională DHHC21 conferă efecte protectoare asuprafuncția renalăîn leziuni septice și că inhibarea DHHC21 poate servi ca o strategie terapeutică pentru a combatedisfuncție renalăîn timpul leziunilor septice.

Click aici pentru a ști cistanche tubulosa extract de beneficii

Hipoperfuzia/hipoxia țesutului renal este una dintre principalele cauze ale disfuncției renale în timpul leziunilor septice3-5. Am detectat hipoperfuzia renală la șoareci după CLP evidențiată de intensitatea semnalului MSOT slăbită a hemoglobinei totale, scăderea saturației de oxigen în țesutul renal și reducerea RBF după leziuni septice. În concordanță cu constatările Curții, reducerea RBF a fost observată la pacienții cu sepsis cu leziuni renale, precum și la modelele animale mari de leziuni septice7,10l1. Este demn de remarcat faptul că mai multe studii raportează că disfuncția renală se poate dezvolta la animalele de sepsis cu RBF334 nemodificat sau chiar crescut. Aceste constatări discrepante pot fi atribuite diferitelor modele și metode animale utilizate pentru măsurarea fluxului sanguin. De exemplu, în timp ce leziuni septice polimicrobiene induse de CLP a fost frecvent utilizat, unele studii folosesc o injecție intravenoasă de Escherichia coli35.

Palmitoilarea proteinelor a fost raportată recent ca un nou regulator al funcției proteinelor, implicat în patogeneza și progresia multor boli. A fost identificat pentru prima dată ca un nou tip de modificare post-translațională de către Schmidt et al.3637.Descoperirea familiei DHHC a promovat de atunci extinderea rapidă a acestui domeniu38,39. Rolurile palmitoylation și PATs au fost raportate în numeroase condiții fiziologice și patologice, inclusiv metabolismul lipidic,cancer,boli cardiovasculare, și tulburări neurologice23,0,4. Deși implicarea palmitoilare în boala renală polichistică și cancerul de rinichi a fost raportată anterior23., au existat studii foarte limitate care examinează rolul funcțional al PATs înboli renale, în special în disfuncția renală în timpul leziunilor septice. Din câte știm, suntem primii care investighează rolul DHHC2l în disfuncția renală în leziunile septice. Constatările noastre indică faptul că inhibarea DHHC21 salvează foarte mult funcția renală și păstrează structura renală în leziuni septice.

Studiul nostru folosind Zdhhc21dp/d4? șoarecii demonstrează că efectele benefice ale deficienței funcționale DHHC21 asupra funcției renale sunt atribuite capacității sale de a îmbunătăți perfuzia țesutului renal în timpul leziunilor septice. În condiții bazale, șoarecii Zdhhc21ewaeP nu prezintă semne de dezechilibru sarea/apa sau leziuni structurale/funcționale renale5. Cu toate acestea, pierderea funcției DHHC21 suprimă reducerea indusă de leziuni septice a RBF, perfuzia renală și saturația oxigenului renal. Creșterea rezistenței vasculare renale cauzată de vasoconstricția renală excesivă este considerată un motiv major pentru perfuzia țesutului renal afectat în leziuni septice6.9. Rezultatele noastre indică implicarea alAR în medierea hipoperfuziei țesutului renal indus de leziuni septice, după cum reiese din creșterea palmitoilației alAR și activarea unei căi de semnalizare alAR în leziuni septice. Cu toate acestea, DHHC21 deficit funcțional inhibă alARpalmitoylation și rezultatele într-o capacitate contondentă de alAR pentru a activa efectorul său în aval și de a media vasoconstricție induse de fenilefrină în arterele renale.

"Mecanismul molecular care stă la baza reglementării funcției alAR de către DHHC21 rămâne încă să fie pe deplin elucidat. Defectul funcției alAR cauzat de pierderea funcției DHHC21 poate fi atribuit modificării conformaționale a alAR. Multe GPCRs se bazează pe palmitoylation pentru conformația lor intracelulară corespunzătoare, Palmitat atașat în cozile C-terminale de GPCRs introduce în membrana plasmatică pentru a crea a patra buclă intracelulară, care este esențială pentru interacțiunea GPCRs cu proteinele partenere și propagarea semnalelor GPCR17,4. Un studiu anterior a indicat că palmitoilarea albarului are loc, de asemenea, în regiunea sa C-terminal44. Prin urmare, lipsa palmitoilației αlAR mediate de DHHC21 poate modifica conformația intracelulară a alAR, blocând astfel propagarea semnalelor αlAR. Acest lucru poate fi susținut de rezultatele noastre care arată că activarea ERK, un eveniment de semnalizare în aval al activării alAR, este inhibată la șoarecii Zdhhc21devider supuși leziunilor septice. Cu toate acestea, topologia reglementată de DHHC21 a terminalului carboxil alAR trebuie confirmată în continuare cu ajutorul cristalografiei cu raze X.

Un alt aspect inedit al studiului nostru este utilizarea MSOT pentru a evalua perfuzia renală și funcția în timpul leziunilor septice. MSOT a fost raportată ca o metodă fără etichete pentru a măsura perfuzia diferitelor organe și o tehnică imagistică fiabilă pentru a determina funcția renală2832,45. Comparativ cu debitmetrul Doppler care nu permite vizualizarea microvasculaturii45, MSOT generează imagini cu rezoluție spațială ridicată la 150 um, oferind în același timp o evaluare cantitativă a stării de perfuzie în microvasculatura renală. IRDye800CW solubil în apă este un trasor sigur de utilizat pentru măsurarea clearance-ului renal și nu induce toxicitate la o doză de până la 20 mg/kg. Mișcarea în două faze a IRDye800CW pe care am observat-o este în concordanță cu studiile publicate anterior. Înregistrările noastre MSOT indică o întârziere Tmax mai mare în rinichi sepsis, sugerând insuficiență renală clearance-ul. Un studiu de nefropatie demonstrează că funcția renală afectată detectată de MSOTis este corelată semnificativ cu leziuni histologice glomerulare30. Datele noastre, în concordanță cu publicațiile anterioare, sugerează că MSOT este o tehnică minim-invazivă și fiabilă pentru a monitoriza perfuzia renală și funcția.

În prezent, nu există inhibitori specifici DHHC21 disponibile. Cel mai frecvent utilizat inhibitor pat este 2-BP, care are un efect larg asupra mai multor DHHCs și, de asemenea, interferează cu metabolismul acizilor grași47. Astfel, dezvoltarea inhibitorilor moleculelor mici care vizează în mod specific DHHC21 ar fi o direcție promițătoare. De asemenea, merită subliniat faptul că alAR nu este singurul substrat al DHHC21. Mai multe alte substraturi DHHC21 au fost identificate recent, inclusiv molecula de adeziune a celulelor endoteliale plachetare (PFCA M-1), caverolina receptorilor de estrogen-1, sintetazei oxidului nitric endoteliale (eNOS), Fyn, superoxid dismutaza (SOD-1), și PLCB122,41,4s,49, În timp ce dincolo de domeniul de aplicare al prezentului studiu, nu putem exclude posibilitatea ca aceste substraturi pot afecta, de asemenea, funcția renală în timpul leziuni septice.

În concluzie, prezentul studiu demonstrează pentru prima dată că DHHC21 joacă un rol critic în reglarea perfuziei renale în timpul leziunilor septice prin mecanisme care implică palmitoilarea alAR și vaso-constricția mediată de alAR. În plus, inhibarea DHHC21 exercită efecte protectoare asupra funcției renale în timpul leziunilor septice.

Materiale și metode

Reactivi. Toți reactivii sunt enumerați în tabelul suplimentar S1.

Animale. Șoarecii Zdhhc21depher și șoarecii lor de control de tip sălbatic (B6C3Fe) au fost achiziționați de la Jackson Laboratory. Genotipul lui Zdhhc21dephe? șoarecii au fost confirmați prin secvențiere (Genewiz, Inc., NJ, SUA). Grundurile utilizate pentru secvențiere au fost: AGCTGACTGAAGGGCACC(forward) și AAAACCTGTAACGCATTTCCA (invers)23. Animalele au fost menținute în cadrul unui ciclu de lumină/întuneric de 12/12 ore, cu acces liber la hrană și apă. Șoareci (16-20 săptămâni)de ambele sexe au fost folosite pentru acest studiu. Toate experimentele pe animale sunt aprobate de către Universitatea din Florida de Sud instituționale de îngrijire a animalelor și utilizarea Comitetului și în conformitate cu Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea de laborator

Ligaturarea cecală și puncția, Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (3% inducție și 1% întreținere). O incizie a liniei mediane a fost făcută în regiunea abdominală rasă, iar cecumul a fost exteriorizat, bine ligat la 5 mm sub supapa ileocecală și perforat de două ori cu un ac cu ecartament de 20 distal până la punctul de ligatură. Un mm de fecale a fost extrudat din fiecare gaură de puncție. Cecumul a fost apoi repoziționat, iar abdomenul a fost închis în două straturi. 37 C Soluție inelară lactată a fost aplicată local pentru a preveni uscarea cecumului. Șoarecilor li s-a administrat apoi 37 °C 0,9% soluție salină subcutanat pentru resuscitarea fluidelor. Un preoperator 0.5-1.5 mg/kg doza de Buprenorfină susținut-eliberare a fost dat pentru analgezie. Șoarecii sham au fost supuși aceleiași proceduri chirurgicale, dar fără ligatură cecală și puncție50,51.

Tomografia optoacustică multispectrală. Evaluarea excreției renale a IRDye800CW. Șoarecii au fost anesteziați prin izofluran și epilați în jurul regiunii trunchiului. Șoarecii au fost fotografiați folosind Altera Medical MSOT Imaging System (München, Germania) la mai multe lungimi de undă:700,730,760,775,785, 800,850 nm la o rată de 10 cadre/s. Șoarecii au fost plasați într-o poziție în sus într-un suport și mutați de-a lungul etapei liniare orizontale pentru a poziționa rinichii deasupra traductorului concav poziționat fix. După înregistrarea de bază,60 nmol de RDve800CW dizolvat în l00 ul de 0,9% soluție salină a fost injectat intravenos pe o perioadă de l0 s. Imaginile au fost reconstruite folosind formula de back-projection și procesate cu analiză multispectrală. Regiunile de interes (ROI) au fost desenate în jurul cortexului renal și a regiunii medulla/pelvisului și au fost descrise modificările temporale ale semnalului MSOT în ROI.

Măsurarea perfuziei renale. Șoarecii au fost pregătiți pentru imagistica MSOT utilizând aceleași proceduri menționate mai sus. Respirația mouse-ului a fost monitorizată îndeaproape pe parcursul întregii proceduri. Imaginile au fost reconstruite și s-a efectuat unmixing spectral. ROI-urile au fost trase în jurul întregii regiuni renale drepte. Intensitățile medii ale pixelilor hemoglobinei oxigenate (HbO)) și hemoglobinei deoxigenate (Hb) au fost dobândite. Hemoglobina totală (HbT =HbO,+ Hb) și saturația oxigenului (So=HbO, /HbT) au fost apoi calculate>2.

Histopatologie renală. Rinichii au fost fixați, tăiați de-a lungul planului sagital și procesați pentru încorporarea parafinei. Secțiunile (5 μm) au fost de-parafinizate, rehidratate și oxidate cu acid periodic timp de 8 minute la temperatura camerei (RT), urmată de incubarea cu soluția Schiff timp de 25 de minute. Secțiunile au fost apoi contrasate cu hematoxilină. Imaginile au fost surprinse folosind Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, SUA). Afectarea structurală renală a fost evaluată pe baza următoarelor caracteristici: anomalie glomerulară, pierderea marginii periei tubulului proximal, vacuolarea, dilatarea epiteliului tubul, detașarea/necroza celulelor tubulare și infiltrarea neutrofilelor. Fiecare caracteristică a fost clasificată pe o scară de 0-5 în funcție de severitate.

Măsurarea creatininei și a azotului ureic din sânge. Sângele mouse-ului a fost colectat prin puncție cardiacă la 24 de ore după leziuni septice. Plasma a fost generată prin centrifugarea sângelui la 2500g timp de 15 min la RT. Măsurarea creatininei: plasma a fost deproteinizată folosind o coloană de spin de 10 kDa; nivelurile creatininei din filtrat au fost apoi măsurate cu ajutorul unui kit de testare a creatininei. Nivelul azotului ureic din sânge (BUN) a fost determinat cu ajutorul unui kit de detectare colorimetrică a azotului ureic urmând instrucțiunile producătorului.

Măsurarea RBF și MAP. Șoarecii au fost anesteziați folosind izofluran. Traductorul de tensiune arterială a fost canulat în artera carotidă. O incizie midline a fost făcută în zona abdominală, urmată de o incizie transversală stângă pentru a expune artera renală. RBF a fost măsurată cu ajutorul unui debitmetru cu ultrasunete în timp de tranzit (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, SUA). După plasarea sondei de debit în jurul arterei renale expuse, șoarecilor li s-a permis să fie stabilizați timp de cel puțin 30 de minute. RBF și MAP au fost înregistrate simultan folosind PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, SUA). Datele au fost analizate folosind LabChart Pro versiunea 7 software4,55

Captură asistată de rășină. Arterele renale au fost colectate și lizate în tampon de liză (100 mM HEPES.25 mM NaCl,1 mM EDTA,10 μM palmostatin B, inhibitori de protează, pH 7.4)22,56. Lizatele tisulare au fost incubate cu tampon de blocare (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5% SDS,6 ul/ml MMTS,pH 7.4) la 50°CC timp de 30 min cu vortexare constanta. După precipitarea cu acetonă rece, proteinele au fost peletate prin centrifugare la 5000g timp de 30 min și spălate de cinci ori cu acetonă rece 70%. Peletele proteice au fost resuspendate în tampon de legare (100 mM HEPES,1,0% SDS,1 mM EDTA, pH 7,4). Concentrația de proteine a fost determinată și normalizată între grupuri. Fiecare probă de proteine a fost împărțită în două părți egale fiecare a primit aceeași cantitate de izopropil sefaroză 6B margele, Hydroxvlamine (0.2 M, pH 7.4), și NaCl(0.2 M) adăugat în fiecare parte, respectiv. După 4 ore de incubare la RT cu rotație constantă, proteinele palmitoilate au fost eluate cu 50 mM DTT în 1×Sample Buffer și colectate pentru SDS-PAGE.

Blotting de Vest. Măsurarea αlAR palmitoilat. Probele prelevate de la RAC au fost încărcate pe un gel Tris-Glycine de 4-20% și transferate pe o membrană de nitroceluloză după electroforeză. După blocarea timp de 1 h la RT, alAR a fost cercetat cu anticorp primar anti-αlAR de iepure (1:500)peste noapte la 4 °C. După spălarea de trei ori cu TBST, membrana a fost incubată cu anticorp secundar anti-iepure irdye800CW (1:20,000) timp de 45 de minute la RT.

Măsurarea fosforilării ERK. Arterele renale au fost lizate în 1×RIPA care conțin inhibitori de protează și fosfatază. Membrana a fost sondată cu anticorpi anti-ERK de iepure (1:1000) și anti-fosforilați de Șoarece ERK (1:1000). IRDye800CW măgar anti-șoarece și IRDye680RD măgar anti-iepure anticorpi au fost folosite pentru incubație secundară (1:20,000). Membranele au fost fotografiate și analizate folosind Li-COR Odyssey CLx.

Evaluarea vasoreactivității prin intermediul miografului de sârmă. Arterele renale ale mouse-ului. Arterele renale (250-350 μm în diametru)au fost izolate de WTand Zdhhc21dp/de șoareci și scufundate în gheață rece oxigenizat (95%O,/5%CO.) soluție salină fiziologică (PSS,130 mM NaCl,4,7 mM KCl,1,18 mM KH,PO,1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO,5,5 mM glucoză,0,026 mM EDTA și 1,6 mM CaCl,pH 7,4). Segmentele de navă (~ 2 mm lungime) au fost montate pe camera de miograf de sârmă (Instrumente sisteme vii, VT, SUA) între două fire de wolfram (30 um în diametru). Tensiunea izometrică a fost înregistrată cu ajutorul aparatului de aer condiționat de semnal Living Systems (MYO-SC-1) cuplat cu software-ul LabScribe v4 iWorks. După echilibrare timp de 30 min la 37 ° CCin PSS, procedura de normalizare a fost efectuată pentru a determina circumferința internă optimă L,= 0,9×L(Lo = circumferința internă care corespunde presiunii transmurale de 100 mmHg). Apoi, viabilitatea navei a fost testată cu 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl,60 mM KCl,1,18 mM KH,PO.1.17 mM MgSO.7H,O,14.9 mM NaHCO, 5.5 mM glucoză,0.026 mM EDTA,1.6 mM CaCl,pH 7.4). Arterele care nu au răspuns la KPSS au fost dezamorsate. Arterele au fost tratate cu concentrații crescute de fenilefrina (10 nM-30 μM). Integritatea endotelială a fost apoi evaluată folosind acetilcolina(10 μM). Au fost construite curbele concentrație-răspuns.

Artere mici din rinichi umani. Arterele mici (~ 1000 um în diametru) au fost disecate de rinichi umane viabile intacte, care au fost respinse pentru operația de transplant. Segmentele de navă (~ 2 mm lungime) au fost montate pe barele I (250 um în diametru) ale camerei de miograf de sârmă. Proceduri similare de echilibrare și normalizare au fost efectuate pe arterele umane. Apoi, arterele au fost incubate cu controlul vehiculului (0,02% DMSO în PSS) timp de 1 oră. Vasele au fost apoi testate pentru viabilitate cu 60 mM KPSS și tratate cu concentrații crescute de fenilefrină (10 nM-30 uM). După spălare, vasele au fost incubate cu 2-BP(100 uM) timp de 1 h; viabilitatea navei a fost apoi testată din nou cu 60 mM KPSS cu 100 uM 2-BP. Arterele mici, cu nici un răspuns sau redus la KPSS au fost aruncate. Arterele au fost apoi contestate cu aceleași concentrații de fenilefrina urmată de acetilcolina(10 uM). Au fost construite și comparate curbele concentrație-răspuns ale arterelor de control sau de 2 BP tratate cu 2 BP.

Imunofluorescență. Arterele renale umane au fost fixate în 10% formalină pentru 48 h,parafină-embedded, și secționate. Lamele au fost apoi deparafininizate, rehidratate și permeabilizate cu PBS conținând 0,05% Triton X-1002. După blocare, lamele au fost etichetate cu anticorpi anti-DHHC21 de iepure și anticorpi anti-αlAR de capră (1:100)peste noapte la 4 °CC. După spălare, incubarea anticorpilor secundari s-a făcut cu măgar anti-iepure Alexa Fluor 488 și măgar anti-capră Alexa Fluor 568(1:500). După montarea cu mediul de montare ProLong Diamond cu DAPI, lamele au fost fotografiate cu microscop confocal de scanare cu laser inversat Leica SP8.

Analiza statistică. Informații detaliate (de exemplu, numele testului, testul post-hoc, valoarea n, nivelul alfa, valoarea p) pentru fiecare test statistic sunt enumerate în tabelul suplimentar S2. Toate datele îndeplinesc ipoteza de distribuție normală. Testul de normalitate a fost efectuat cu ajutorul testului Shapiro-Wilk cu nivel alfa setat la 0,05. Comparațiile dintre două grupuri au fost analizate folosind testul t student (cu două cozi), iar trei grupuri sau mai multe au fost comparate prin intermediul one-way ANOVA cu analiza post-hoc Tukey. Comparația pentru curbele miografului de sârmă a fost efectuată folosind ANOVA.p bidirecțional<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">