Activarea complementului mediată-3-pentraxină într-un model porcin de ischemie renală/leziune de reperfuzie

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella și colab

ABSTRACT

Pentraxinele sunt o familie de molecule de recunoaștere a modelelor conservate evolutiv, cu roluri esențiale în imunitatea înnăscută și inflamație, cum ar fi opsonizarea agenților patogeni în timpul infecțiilor bacteriene și virale. În special, sa demonstrat că Pentraxin 3 (PTX3) lung reglează mai multe aspecte ale inflamației vasculare și tisulare în timpul transplantului de organe solide.

Studiul nostru a investigat rolul PTX3 ca un posibil modulator al activării complementului într-un model porcin de leziuni de ischemie/reperfuzie renală (I/R). Am demonstrat că depozitele precoce de PTX3 induse de leziuni I/R la niveluri capilare peritubulare și glomerulare. Microscopia de scanare laser confocală a evidențiat depozite de PTX3 co-localizate cu celulele endoteliale CD31 plus. În plus, PTX3 a fost asociat cu macrofage infiltrate (CD163), celule dendritice (SWC3a) și miofibroblaste (FSP1). În special, am demonstrat activarea semnificativă mediată de PTX{10}}a căilor clasice (mediate de C1q) și lectinei (mediate de MBL) ale complementului. Interesant este că depozitele de PTX3 s-au co-localizat cu activarea complexului de complement terminal (C5b-9) pe celulele endoteliale, indicând faptul că activarea complementului mediată de PTX3-a avut loc în principal la nivel vascular renal. În concluzie, aceste date indică faptul că PTX3 ar putea fi o potențială țintă terapeutică pentru a preveni leziunile I/R induse de complement.

Corespondenta catre:Giuseppe Castellano

Cuvinte cheie:ischemie/leziune de reperfuzie, sistem complement, pentraxină 3,rinichi, calea clasică

Cistanche tubulosa previne bolile de rinichi, faceți clic aici pentru a obține mostra

INTRODUCERE

Leziunea de ischemie-reperfuzie (I/R) reprezintă cauza majoră a acutărinichirăniredupă transplant și se caracterizează printr-o activare semnificativă a sistemului complementului [1, 2]. În acest scenariu, celulele endoteliale (EC) joacă un rol critic în repararea dezadaptativă după I/R, conducând la fibroză precoce prin tranziția endotelială la mezenchimală (EndMT) [3]. În timpul fazei de reperfuzie, Complementul orchestrează procesele imunologice și inflamatorii, contribuind la diferite boli imunitare și inflamatorii [2–5]. Alte componente esențiale ale brațului umoral al sistemului imunitar înnăscut sunt reprezentate de pentraxinele despre care se crede că joacă un rol esențial în biologia vasculară [6].

Pentraxinele sunt o familie de proteine ​​solubile multimerice [6] care sunt clasificate în familii scurte și lungi pe baza structurii lor [7]. Aceste proteine ​​conservate evolutiv sunt efectori de fază acută, care servesc ca senzori pentru inițierea inflamației și creșterea rapidă a plasmei în timpul infecției [8]. Pentraxina lungă 3 (PTX3) este o moleculă solubilă de recunoaștere a modelului care este crucială în protecția imună înnăscută și poate activa sistemul complementului [9-11].

În special, PTX3 a indus activarea căii clasice și a lectinei prin legarea cu C1q, MBL, Ficolin -2 și este capabil să afecteze calea alternativă prin CFH [10-12].

Spre deosebire de alte pentraxine produse de ficat în fluxul sanguin (adică CRP), PTX3 poate fi eliberată de celulele rezidente în locul inflamației, de exemplu din fagocitele mononucleare, celulele dendritice, fibroblastele și EC [9] care acționează într-o manieră paracrină. [13]. PTX3 este, de asemenea, stocat într-o formă gata preparată în neutrofile, localizat în granule specifice și secretat ca răspuns la recunoașterea fragmentelor microbiene [14]. În EC, expresia PTX3 este indusă cu ușurință de TNF- și IL-1, dând o tranziție de la un fenotip repaus, antiinflamator, la o stare procoagulantă și proinflamatoare, reglând astfel puternic funcția microvasculară [7, 8] ]. Din acest motiv, nivelurile PTX3 au fost descrise cacronicrinichiboala, creșterea nivelurilor de proteine ​​ale PTX3 a fost corelată cu scăderea RFG și cu complicațiile cardiovasculare, cu toate acestea, încă puțin se știe despre rolul PTX3 în setările timpurii ca acut indus de I/R.rinichiaccidentare [15, 16].

Rolul PTX3 în bolile inflamatorii renale este bivalent, dintr-o parte, proteina poate activa căile clasice și ale lectinei, promovând inflamația și leziunea inițială [10–12]. Pe de altă parte, domeniul N-terminal al PTX3 a modulat activarea complementului a atenuat recrutarea leucocitelor și a inhibat fibroza interstițială în leziunea renală acută, promovând repararea țesuturilor [17-20].

Complementul joacă un rol esențial în patofiziologia acută indusă de leziuni I/Rrinichirănire[21, 22]. Într-un model porcin de leziuni renale I/R, am demonstrat rolul esențial al activării sistemului de complement în inducerea EndMT și a fibrozei precoce, cu implicarea atât a căilor clasice, cât și a lectinei [23]. Mai mult, am demonstrat că inhibarea terapeutică a acestor căi de complement de către C1-INH recombinant (rhC1INH) a produs o reducere semnificativă a depunerilor de complement, cu scăderea recrutării celulelor inflamatorii infiltrante și leziuni tubulointerstițiale [23]. Aceste rezultate au fost confirmate și de Delpech PO et al [24]; o modulare semnificativă a depunerilor glomerulare și tubulare C1q, MASP și C4d a fost evaluată după 30 de minute post-reperfuzie, indicând un rol central al C1-INH pentru a contracara căile clasice și ale lectinei.

În acest studiu, am investigat posibila implicare a PTX3 în mediarea activării precoce a complementului în leziuni renale I/R, caracterizând diferitele surse celulare de PTX3.

REZULTATE

PTX3 este exprimat de celulele endoteliale și celulele imune care se infiltrează într-un model porc de leziuni I/R

În primul rând, am investigat prezența PTX3 într-un model de porc de leziuni renale induse de I/R calde. Am observat depozite foarte limitate de PTX3 în țesutul normal (Figura 1A). Leziunea I/R a provocat o depunere difuză de PTX3 deja la 15 minute după reperfuzie (Figura 1B, 1C) în zona tubulointerstițială (Figura 1E), la capilarele peritubulare (Figura 1D; săgeată) și la niveluri glomerulare (Figura 1D). Depozitele de PTX3 erau încă detectabile la 1 oră după reperfuzie la nivelul capilarelor peritubulare (Figura 1G). În munca noastră anterioară [23] am demonstrat că principalele caracteristici ale leziunii I/R sunt apoptoza celulelor epiteliale tubulare și recrutarea de celule inflamatorii infiltrante, cum ar fi monocite, celule dendritice și limfocite. Cu toate acestea, prin evaluarea histologică de rutină (Figura suplimentară 1), am demonstrat că 30 de minute de ischemie caldă urmate de 15 minute de afectare interstițială precoce a tubului indusă de reperfuzie, caracterizată prin congestie capilară mai mare și vacuolare citoplasmatică focală a epiteliului tubului renal, în comparație cu cea bazală. condiție.

Pentru a caracteriza în continuare localizarea celulară a depozitelor de PTX3 și pentru a evalua efectul său potențial în modularea răspunsului inflamator și a leziunii, am efectuat o analiză de dublă imunocolorare și microscopie confocală. Expresia proteinei PTX3 a fost detectată în majoritatea EC la niveluri capilare peritubulare (Figura 2A) și glomerulară (Figura 2B), la 15 minute după reperfuzie.

Este bine cunoscut faptul că leziunea I/R este caracterizată prin activarea crescută a răspunsurilor imune înnăscute și adaptative, inclusiv traficul de celule inflamatorii în organul bolnav, care exacerbează și mai mult leziunile prin intermediul celulelor imune și al sistemului Complement [25]. În modelul nostru de porci, am observat, de asemenea, deja la 15 minute după reperfuzie, un infiltrat inflamator dens compus în mare parte din macrofage și celule dendritice în zona tubul-interstițială. Am descoperit că ambele celule prezentatoare de antigen au fost caracterizate de o expresie crescută a PTX3 în comparație cu T0, deoarece am observat un număr crescut de CD163 plus /PTX3 plus (Figura 2E, 2F, 2K) și SWC3a plus /PTX3 plus (Figura 2G, 2H, 2L) celule la nivelurile interstițiale tubulare la T15.

Expresia PTX3 poate contribui la EndMT în leziuni I/R

În observațiile anterioare, am demonstrat că leziunea I/R a fost responsabilă pentru EndMT [26, 27], caracterizată prin dobândirea unui fenotip mezenchimal de către EC cu pierderea markerilor endoteliali specifici și câștigarea markerilor mezenchimale, cum ar fi fibroblast-specifici. proteina 1 (FSP-1), caderina neuronală (N-cadherina) și actina alfa-musculară netedă (alfa-SMA). Astfel, am investigat dacă expresia PTX3 de către EC ar putea afecta acest proces. După cum era de așteptat, atunci când am investigat expresia alfa-SMA, ca markeri ai miofibroblastului activat, nu am găsit nicio co-localizare între alfa-SMA și PTX3 (Figura 2C, 2D). Dimpotrivă, am observat o creștere a FSP1 tubulointerstițial plus / PTX3 plus miofibroblaste pe toată perioada de observație (Figura 2K-2M).

Depozitele de PTX3 sunt asociate cu activarea sistemului complementului

În cele din urmă, am investigat dacă depozitele PTX3 au fost asociate cu activarea complementului. Într-adevăr, ca și în cazul altor componente ale familiei pentraxinelor, PTX3 poate regla activarea căii clasice a complementului [7]. Pentru a defini relația dintre PTX3 și activarea complementului, am efectuat imunofluorescență cu etichetă dublă pentru a evalua expresia PTX3 și terminalul terminal. Complexul de complement, C5b-9, folosind un anticorp îndreptat împotriva unui neoepitop C{9-. Am observat o co-localizare semnificativă a depozitelor PTX3 și C5b-9 (Figura 3A, 3B). Complexul terminal al complementului a fost localizat la nivel peritubular, precum și în interiorul capilarelor peritubulare împreună cu stratul de celule endoteliale, așa cum am demonstrat anterior [23, 28]. Deoarece PTX3 poate activa sistemul Complement prin căile clasice și lectinei, am evaluat depunerea de C1q și MBL în parenchimul renal. Interesant, depozitele C1q (Figura 3E, 3F) și MBL (Figura 3C, 3D) au fost găsite în principal la nivel interstițial și capilar (Figura 3C până la 3F), așa cum s-a descris anterior [23] și colocalizate cu depozitele PTX3.

C1-inhibitorul interferează cu legarea PTX3 de celulele endoteliale

În munca noastră anterioară [23] am demonstrat că administrarea de inhibitor C1-a condus la o reducere semnificativă a depunerilor de complement, cu scăderea recrutării celulelor inflamatorii infiltrante și leziuni tubulointerstițiale. Prin urmare, am examinat nivelul de expresie a PTX3 la animalele tratate cu rhC1-INH. Am descoperit că infuzia de inhibitor C1-a redus depozitele de PTX3 la nivelul capilarelor peritubulare și la nivel interstițial după 15 minute post-reperfuzie (Figura 4A).

Mai mult, pentru a susține ipoteza că reducerea depozitelor de PTX3 la animalele tratate cu rhC1-INH a fost asociată cu inhibarea leziunilor endoteliale, am efectuat experimente in vitro și am evaluat legarea rhC{1-INH și PTX3 pe EC cultivată în condiții normale sau în prezența stresului celular (Figura 4B). Analiza FACS a arătat că EC în condiții normale nu a legat atât rhC1-INH, cât și PTX3. În conformitate cu studiul nostru anterior [26], am observat o legare celulară crescută a rhC1-INH pe EC stimulată cu H2O2-, comparativ cu condițiile bazale. Mai mult, în absența rhC1-INH, PTX3 ar putea lega EC activată. Interesant este că atunci când EC activată cu H2O2-a fost incubată cu PTX3 și rhC{1-INH, am observat că C1INH a fost capabil să protejeze EC la blocarea legării PTX3.

DISCUŢIE

În acest studiu, am demonstrat depunerea PTX3 în faza incipientă a leziunii renale I/R și posibila sa contribuție la dezvoltarea EndMT. Interesant, am descoperit că activarea Complementului mediată de PTX3-se produce în principal la nivel vascular, co-localizându-se cu C1q și MBL, moleculele de recunoaștere ale căilor clasice și ale lectinei din cascada Complementului.

Leziunea I/R declanșează un răspuns inflamator marcat caracterizat prin activarea complementului, radicali liberi de oxigen și producție de citokine proinflamatorii, ducând la activarea endoteliului vascular și a leucocitelor periferice [29, 30]. În timpul leziunii I/R, activarea complementului duce la depunerea componentelor complementului pe membrana suprafeței EC deteriorate și disfuncționale, cu generarea simultană de anafilatoxine și amplificarea procesului inflamator [31]. În timpul inflamației, PTX3 crește rapid și ar putea exercita un rol central în modularea răspunsului endotelial. Într-adevăr, PTX3 a fost indicat ca un potențial biomarker al disfuncției endoteliale vasculare în mai multe boli, inclusiv cronice.rinichiboală, preeclampsie și mai multe boli vasculare [7, 16, 17, 32]. De asemenea, am demonstrat că PTX3 este implicat în alte complicații vasculare, cum ar fi eșecul fistulei arteriovenoase la pacienții cu hemodializă [33]. Aceste observații sugerează că PTX3 ar putea fi o punte între răspunsul inflamator și disfuncția endotelială [34]. În conformitate cu aceste studii, am observat depozite de PTX3 la nivel endotelial deja după 15 minute după reperfuzie (Figura 2A, 2B). Rezultatele noastre au demonstrat, de asemenea, că în faza incipientă a leziunii I/R, PTX3 s-a colocalizat cu marker de miofibroblast, FSP-1 (Figura 2I, 2J), dar nu cu alfa-SMA, un marker exprimat de miofibroblast activat (Figura 2C, 2D). Luate împreună, aceste date ar putea sugera că disfuncția endotelială și procesul EndMT [35], observate la animalele I/R [26], au avut loc mai întâi în EC care exprimă PTX3.

Legătura dintre PTX3 și celulele inflamatorii este recunoscută pe scară largă. În această lucrare, ne-am concentrat în mod special asupra efectelor inerente ale PTX3 în infiltrarea interstițială a leucocitelor care sunt o sursă majoră de PTX3 [36]. În special, am găsit macrofage și celule dendritice, după 15 minute după reperfuzie, care exprimă niveluri mai mari de PTX3 (Figura 2E până la 2H). Aceste date sunt în acord cu numărul tot mai mare de dovezi care sugerează un rol relevant pentru imunitatea înnăscută în mediarea leziunilor precoce în leziunile I/R [23]. Activarea precoce a Complementului în țesutul renal după leziunea I/R duce la generarea mai multor mediatori inflamatori care cresc recrutarea celulelor imune [21, 23, 37, 38]. Studii recente au identificat PTX3 ca una dintre componentele principale ale rețelei care orchestrează răspunsul inflamator declanșat de leziuni I/R [39]. În diferite modele experimentale de leziuni I/R, PTX3 poate exercita roluri opuse duble asupra țesuturilor specifice [40, 41]. Producerea timpurie a PTX3 este asociată cu afectarea renală, deoarece induce expresia precoce a moleculelor de adeziune endotelială și a chemokinelor care accelerează răspunsul inflamator dezadaptativ local.

Dimpotrivă, producția locală prelungită de PTX3 previne inflamația excesivă și disfuncția organelor [41].

PTX3 este un modulator în cascadă Complement [9, 42]; aceasta este în acord cu proprietățile pleiotrope ale PTX3, indicând un rol dublu al PTX3 ca modulator sau amplificator al răspunsului imun înnăscut [39]. Inițial, PTX3 activează Complementul prin legarea C1q și MBL [43]; cu toate acestea, inflamația crescută timpurie trebuie limitată la zona țintă. Prin urmare, PTX3, prin recrutarea factorului H sau inhibarea angiogenezei, ar putea reduce, de asemenea, răspunsul inflamator și activarea complementului, păstrând parenchimul renal de leziuni inflamatorii [43]. Deși activarea complementului în I/R la rozătoare este localizată în principal la nivel tubular [44], în timpul fazei de reperfuzie, endoteliul este ținta principală a diferiților agenți proinflamatori, inclusiv mediatorii complementului [2]. Am demonstrat anterior că în modelul porcin de leziuni I/R, precum și la pacienții cu DGF, activarea sistemului Complement are loc în faza incipientă, pe capilarele peritubulare, în interiorul interstițiului și pe endoteliul glomerular [23]. Datele noastre au arătat o co-localizare clară a depozitelor de C5b-9 pe PTX3 plus EC după 15 minute după reperfuzie (Figura 3A, 3B). Prin urmare, endoteliul renal pare să fie locul predominant al activării Complementului mediată de PTX3-în faza incipientă a leziunii I/R atât în ​​mediul preclinic, cât și în cel clinic.

Interacțiunea pentraxinelor cu C1q și rolul său în activarea căii clasice a complementului sunt bine descrise [45–47]. În contextul răspunsurilor imune înnăscute, PTX3 poate lega diferite componente ale Complementului și poate modula activarea Complementului [43, 48]. PTX3 activează Complementul prin legarea C1q [49]. Rezultatele noastre în modelul animal au demonstrat în mod clar că PTX3 ar putea media activarea căii clasice prin interacțiunea cu C1q (Figura 3E, 3F). Mai mult, PTX3 modulează, de asemenea, calea lectinei a complementului, așa cum se arată în Figura 3C, 3D. MBL leagă PTX3 prin domeniul său asemănător colagenului [45], iar complexele MBL/PTX3 recrutează C1q și provoacă depunerea C3 și C4 pe suprafețele celulelor țintă.

În total, aceste rezultate sugerează rolul central al PTX3 în mediererinichidaune în leziuni I/R, care ar putea avea implicații importante pentru terapiile direcționate de complement în leziunile renale I/R.

În studiul nostru anterior [26], am investigat implicarea complementului în mediarea activării EC prin utilizarea unei forme recombinate de C1-INH, un inhibitor puternic al proteazelor căilor clasice și ale complementului lectinei (C1r, C1 s, și MASP2). În același model animal, am arătat (Figura 4A) că inhibarea terapeutică a ambelor căi de către rhC1INH a redus depozitele de PTX3 la nivelul capilarelor peritubulare și la nivel interstițial după 15 minute după reperfuzie. Aceste date confirmate cu rezultate in vitro asupra EC (Figura 4B), ne-au determinat să presupunem că rhC1INH ar putea proteja EC deteriorat la blocarea legării PTX3. În literatură, există dovezi despre legarea C1-INH la moleculele de adeziune endotelială, exprimate pe endoteliul activat, numite selectine, în special P și E-selectine [50, 51]. Această legare de EC poate interfera cu interacțiunea endotelial-leucocite în timpul inflamației și reprezintă un alt mecanism antiinflamator important [50, 51]. Prin urmare, am emis ipoteza că rh-C1INH poate lega EC activată și mediază reglarea locală a activării complementului și a procesului inflamator. În studiile noastre anterioare, am demonstrat implicarea complementului în leziunile I/R și în alte boli renale mediate imun [38, 52–54]. Mecanismele de activare a complementului în acest model animal ar putea avea implicații importante pentru interpretarea datelor așteptate în mediul uman. Pentru a dezvolta cu succes intervenții terapeutice care vizează activarea complementului [36, 54], este esențial să se stabilească validitatea datelor de porc în raport cu ceea ce se întâmplă în circumstanțe clinice. Deoarece această cercetare se limitează la studii observaționale, sunt necesare experimente suplimentare pentru a delimita mecanismele interconectate dintre PTX3 și Complement care ar putea evidenția noi strategii terapeutice. Din rezultatele de mai sus, datele noastre susțin ipoteza că PTX3 ar putea reglementa mai multe aspecte ale leziunii I/R mediate de complement, reprezentând astfel o potențială țintă terapeutică.

MATERIALE ȘI METODE

Model de porc cu leziuni I/R renale

Modelul animal al leziunii renale I/R a fost dezvoltat așa cum a fost descris anterior [23]. După aprobarea de către comitetul de etică al Ministerului Sănătății, femelele de 4-lună de porci albi mari (n=8, n=4 pentru grup, 20 kg) au suferit procedura chirurgicala deschisa experimentala sub anestezie generala. Animalele au postit timp de 24 de ore înainte de inducerea anesteziei. Electrocardiograma, frecvența cardiacă, saturația hemoglobinei în oxigen, compoziția gazelor respiratorii, frecvența respiratorie, volumul curent, presiunea căilor respiratorii, tensiunea arterială sistolica și presiunea venoasă centrală au fost monitorizate continuu și înregistrate automat (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Finlanda) . Artera și vena renală stângă au fost izolate și o ansă de vas a fost poziționată în jurul arterei renale cu o clemă în unghi drept. O biopsie renală a fost efectuată înainte de ischemie (T0). Apoi, faza ischemică a fost indusă (30 min) prin tragerea buclei vasului. Au fost apoi efectuate biopsii multiple la 15, 30 și 60 de minute după reperfuzie; animalele au fost sacrificate la 24 de ore după procedura chirurgicală. O porțiune din fiecare specimen de biopsie a fost imediat congelată rapid în mediu de temperatură optimă de tăiere (Tissuetek, Pittsburgh, PA) și depozitată în azot lichid. O altă porțiune a fost fixată în formol tamponat (4 la sută) timp de 12 ore și încorporată în parafină folosind proceduri standard.

Studiu microscopic

Specimenele renale încorporate în parafină din biopsiile renale au fost utilizate pentru colorarea histologică convențională (H&E, acid periodic-Schiff). Imaginile au fost achiziționate de dispozitivul Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, CA, SUA). Leziunile tubular-interstițiale și glomerulare au fost evaluate folosind o analiză calitativă de către doi observatori (CD, MR) care nu cunoșteau originea

Anticorpi

Anticorpii primari utilizați în acest studiu au recunoscut următoarele antigene: PTX3 (MNB4: direct împotriva domeniului N-terminal PTX3, Exira Life Sciences In., Larsen, Elveția); CD163 (monocite/macrofage, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (celule dendritice, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (proteina specifică fibroblastului 1, Abcam, Cambridge, Marea Britanie); actină alfa-musculară netedă (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, SUA); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Regatul Unit); MBL (3E7: direct împotriva domeniului de recunoaștere a carbohidraților MBL, biotehnologie Hycult, Uden, Țările de Jos) și neoantigen C9 (aE11, biotehnologie Hycult). Reactivitatea încrucișată a fost validată prin preincubarea anticorpilor specifici, înainte de utilizarea lor, cu peptide umane folosite pentru a le crește. Pre-incubarea a abolit colorația specifică pe țesutul de porc.

Imunofluorescență tisulară și microscopie cu scanare laser confocală

Caracterizarea și localizarea semnalului PTX3 au fost investigate pe țesut congelat inclus în mediu OCT (Tissue-Tek). Lamelele au fost incubate cu 5% ser de iepure timp de 1 oră la 37 grade C. Lamelele au fost apoi incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu anticorpi specifici. După trei spălări în PBS, lamele au fost apoi incubate cu anticorpii secundari corespunzători (Alexa Flour 488 și 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Toate secțiunile au fost contracolorate cu TO-PRO-3 (Molecular Probes). S-au preparat martori negativi cu anticorpi irelevanți. Secțiunile au fost analizate folosind microscopul confocal de scanare laser Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Germania). Numărul de celule infiltrate a fost măsurat în cel puțin 10 câmpuri/secțiuni de mare putere (x630) de către doi observatori independenți orbiți la originea diapozitivelor. Numărările finale au fost media celor două măsuri. În niciun caz, variabilitatea interobservatori a fost mai mare de 20 la sută.

Cultură celulară și analiza citometriei în flux

Celulele endoteliale ale venei ombilicale umane (HUVEC, EC) au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (Standarde ATCC-LGC, Sesto San Giovanni, Italia). EC a fost cultivat în mediul lor recomandat, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Germania). EC a fost placat la o densitate de 1{{10}},000celule/cm2 și a fost stimulat cu tratament cu H2O2 (3 procente, 1 oră). Apoi EC bazale și stimulate au fost spălate de două ori cu PBS și au fost îndepărtate cu PBS-EDTA 2mM și tripsină 0.001×. Apoi celulele au fost resuspendate în PBS și, respectiv, au fost incubate cu PTX3 (PTX3 uman recombinant, Sigma-Aldrich, Merck, Germania) (1 ug/ml) sau/și cu rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 ug). /ml) timp de 60 min. După spălare de trei ori cu PBS 1X, celulele au fost resuspendate în tampon de citometrie în flux (FACS) (soluție salină tamponată cu fosfat, pH 7,2, albumină serică bovină 0,2% și azidă de sodiu 0,02%) și incubate cu reactiv de blocare FCR (Miltenyi Biotec) pentru 10 min la temperatura camerei. După blocare, EC au fost incubate cu C1-INH anti-uman de iepure (furnizat de Prof. M. Daha, Universitatea din Leiden, diluție 1//100) sau/și cu anti-PTX3 de șobolan (MNB4, Exira Life Sciences In., diluție 1/20) la temperatura camerei timp de 30 de minute și spălat cu tampon FACS. Apoi, celulele au fost incubate cu IgG PE anti-iepure de capră (Molecular Probes, 1/100 diluție) sau/cu anti-șobolan IgG FITC (Molecular Probes, 1/100 diluție) la temperatura camerei timp de 30 de minute și spălate de trei ori. Celulele au fost analizate cu FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, SUA) și software Kaluza. Zona de pozitivitate a fost determinată prin utilizarea unui mAb potrivit cu izotip și, în total, au fost obținute 104 evenimente pentru fiecare probă. Au fost efectuate trei experimente independente.

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± abaterea standard (SD) și sunt comparate folosind analiza varianței sau testul t Student pereche, după caz. Diferențele au fost considerate semnificative statistic atunci când valorile p au fost mai mici de 0.05. Datele au fost analizate folosind pachetul software Statview (versiunea 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, SUA). Graficele au fost afișate folosind GraphPad Prism Software 5.

Abrevieri

I/R: ischemie/reperfuzie; EC: celule endoteliale; PTX3: pentraxină 3; FSP-1: proteina 1 specifică fibroblastului; N-caderina: cadherină neuronală; alfa-SMA: actina alfa-musculară netedă.

CONTRIBUȚIILE AUTORILOR

CD a coordonat studiul, a participat la imunomarcarea și microscopia confocală a secțiunilor renale și a redactat manuscrisul. AS și RF au participat la proiectarea studiului, au contribuit la analiza datelor, au efectuat experimente in vitro și au revizuit critic manuscrisul. MR și GSN au efectuat analize histopatologice de imagine. LL, FS, AMC au realizat modelul animal al leziunii ischemie-reperfuzie și au ajutat la revizuirea manuscrisului. GL, PD și MB au efectuat toate procedurile chirurgicale pe modelul de porc și au ajutat la revizuirea manuscrisului. MRD, P.vdP., C.vK. și FS au revizuit manuscrisul.

PP, ER, GG, GS și LG au revizuit critic manuscrisul. GC a furnizat noi instrumente analitice, a proiectat și a supravegheat cercetarea. CD, AS și RF au contribuit în mod egal la acest studiu. Toți autorii au contribuit la articol și au aprobat versiunea trimisă.

MULȚUMIRI

Mulțumim Claudiei Curci de la Unitatea Renal, Dializă și Transplant, Departamentul Urgențe și Transplant de Organe,

Universitatea din Bari pentru asistența tehnică excelentă.

CONFLICTE DE INTERES

Autorii declară că nu au conflicte de interese.

FINANȚAREA

Acest studiu a fost susținut de Universitatea din Bari „Aldo Moro”, Ministerul italian al Sănătății (GR 2016- 02362239 „O abordare bazată pe transcriptomică pentru identificarea factorilor predictivi și a țintelor terapeutice pentru funcția întârziată a grefei înrinichireceptori de transplant”, Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD a primit o bursă pentru acest proiect) și Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 „Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori”- AIM-1810057-activitatea 2 acordată AS

REFERINȚE

1. Bonventre JV, Yang L. Fiziopatologia celulară a acută ischemicărinichirănire. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Răspunsul imun înnăscut în acută ischemicărinichirănire. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Complement: un sistem cheie pentru supravegherea imună și homeostazie. Nat Immunol. 2010; 11:785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Rolul central al căii alternative a complementului în boala umană. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID:16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Inflammaging and Complement System: A Link Between AcuteRinichiLeziuni și leziuni cronice ale grefei. Front Immunol.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxins in innate immunity: lessons from PTX3. Țesut celular Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) în lumina structurii sale, mecanismului de acțiune și implicațiilor clinice. Autoimunitate. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): un modulator endogen al răspunsului inflamator. Mediatori Inflamm. 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxins la răscrucea dintre imunitatea înnăscută, inflamație, depunerea matricei și fertilitatea feminină. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Long pentraxin PTX3 as a prototypic humoral pattern recognition receptor: interplay with cellular innate immunity. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Sinergia dintre ficolin-2 și pentraxin 3 stimulează recunoașterea imună înnăscută și depunerea complementului. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 modulează imunologoza în tumoră micromediu și este un factor de prognostic pentru pacienții cu carcinom renal cu celule clare. Îmbătrânire (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Pentraxina lungă PTX3 este crucială pentru inflamația țesuturilor după

ischemie intestinală și reperfuzie la șoareci. Sunt J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. The humoral pattern recognition receptor PTX3 este depozitat în granule de neutrofile și se localizează în capcane extracelulare. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. pentraxina plasmatică 3 la pacienții cu boli cronicerinichiboală: asocieri cu funcția renală, proteina-energie, pierderea, bolile cardiovasculare și mortalitatea. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Elevated circulating levels and tissue expression of pentraxin 3 in uremia: a reflection of endothelial dysfunction. Plus unu. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Role of the soluble pattern recognition receptor PTX3 in vascular biology. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. pentraxinele PTX3 și SAP în imunitatea înnăscută, reglarea inflamației și remodelarea țesuturilor. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 inhibă fibroza interstițială indusă de leziune renală acută prin suprimarea căii IL-6/Stat3. Inflamaţie. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. Latura „dulce” a unei pentraxine lungi: cum glicozilarea afectează funcțiile PTX3 în imunitatea înnăscută și inflamație. Front Immunol. 2013; 3:407. PMID:23316195