Glicozidele feniletanoide induc apoptoza în celulele Eca-109 prin calea dependentă de mitocondrii

Introducere

Cancerul esofagian este unul dintre cele mai frecvente tipuri de cancer, cu a 11-a cea mai mare rată de morbiditate și a 6-a cea mai mare rată a mortalității la nivel global și a provocat ~439,000 decese în 2015. Incidența cancerului esofagian variază în mod semnificativ între diferite regiuni, cu estul Asia și Africa de Est și de Sud prezintă cele mai mari rate de incidență, iar Africa de Vest prezintă cele mai scăzute rate în 2012. În China, cazurile estimate de cancer esofagian și mortalitățile au fost de 477,000 și, respectiv, 375,000 , în 2015. Deși rata de morbiditate a cancerului esofagian a scăzut în țările cu indice socio-demografic mediu și mediu-înalt între 2005 și 2015, rata mortalității rămâne ridicată din cauza prognosticului prost. Combinația de rezecție chirurgicală cu chimioterapie sau radioterapie a fost utilizată pentru a trata cancerul esofagian, cu toate acestea, s-a raportat că între 2003 și 2014 rata de supraviețuire 5-ană a rămas<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studya demonstrat căCistanche tubulosa glicozide feniletanoide(CTPG) ar putea suprima creșterea celulelor melanomului B16-F10 in vitro și in vivo (24). Cu toate acestea, solubilitatea slabă în apă a CTPG utilizat anterior limitează dezvoltarea medicamentului. Prin urmare, a fost utilizat CTPG solubil în apă (CTPG-W) și a fost investigat efectul antitumoral asupra celulelor canceroase esofagiene (Eca-109). S-a determinat că CTPG-W ar putea inhiba în funcție de doză viabilitatea celulelor Eca-109 prin inducerea apoptozei printr-o cale dependentă de mitocondrie.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiale și metode

animale.

Șoareci femele C57BL/6 (6-8 săptămâni, ~25 g) au fost achiziționați de la Centrul de Cercetare a Animalelor de Laborator din Beijing (Beijing, China) și găzduiți într-o zonă controlată cu temperatură (25 °C), cu ciclu de lumină (12/ 12) Unitatea de animale a Universității Xinjiang (Urumqi, China). Toate animalele au primit apă și hrană fără agenți patogeni.

Linie celulară și cultură.

Linia celulară de carcinom esofagian uman (Eca-109) a fost păstrată de Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, China) și cultivată în RPMI{{1} } mediu (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin inactivat termic (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1% L -glutamină (100 mM), 100 U/ml penicilină și 100 ug/ml streptomicina la 37°C într-o atmosferă umidificată care conține 5% CO2.

Cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).

CTPG-W (nr. cat. SGJG20170410) a fost achiziționat de la Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, China). Compușii majori ai CTPG au fost calificați și cuantificați prin HPLC conform studiului nostru anterior (24). Pe scurt, HPLC a fost efectuată pe o coloană ZORBAX SB-C18 (250x4,6 mm; 5 µm) la 30°C și a fost eluată cu soluție de acid formic 0,2% și un gradient de metanol începând de la 23%, deoarece s-a adăugat 1 ml la fiecare minut. timp de 45 min până se ajunge la 31%. Un total de 10 pl de probă a fost injectat și detectat la 330 nm. Standardul de echinacozidă a fost achiziționat de la Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China), iar standardul de acteozidă a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Standardele au fost utilizate pentru a analiza componentele CTPG-W.

Testul MTT.

Proliferarea celulară a fost măsurată cu un test MTT. Celulele Eca{{0}} au fost inoculate în 96-plăci de godeuri la o densitate de 5x1{03 celule în 1{00 µl RPMI{{5 }} mediu/godeu și cultivat la 37˚C timp de 24 de ore, apoi tratat cu diferite concentrații (0, 200, 400, 600 și 800 µg/ml) de CTPG-W sau 0,4% dimetil sulfoxid (DMSO) timp de 24, 48 și 72 ore. DMSO a fost utilizat ca control solvent (800 ug/ml CTPG-W conţinând 0,4% DMSO). Cisplatină (20 pg/ml) a fost utilizată ca martor pozitiv. Ulterior, supernatantul a fost aruncat după centrifugare la 225 xg timp de 5 minute la temperatura camerei și 100 µl soluție MTT (0,5 mg/ml în mediu RPMI-1640 fără FBS) a fost adăugată la fiecare godeu și incubat la 37°C timp de 3 h. Cristalele de formazan formate au fost dizolvate în 200 ui DMSO. Valorile densității optice (OD) au fost măsurate la o lungime de undă de 490 nm cu un cititor de microplăci 96-godeuri (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA). Viabilitatea relativă a celulei a fost calculată conform formulei: Viabilitatea celulară (%)=(ODtratat/ODnetratat)x100%. Morfologia celulelor Eca-109 a fost observată cu un microscop cu fluorescență inversată (mărire, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokyo, Japonia).

Pentru proliferarea splenocitelor, șoarecii C57BL/6 au fost eutanasiați prin dislocare cervicală, iar splinele au fost izolate. S-a făcut suspensia unicelulară și splenocitele au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri la o densitate de 1x105 celule/godeu în 100 µl mediu RPMI-1640 și apoi tratate cu diferite concentrații (0, 200, 400, 600 și 800 ug/ml) de CTPG-W timp de 24, 48 și 72 de ore la 37°C cu 5% CO2. Proliferarea splenocitelor a fost măsurată prin test MTT, conform protocolului menționat mai sus. Index stimulator=ODtratat/ODnetratat.

Măsurarea apoptozei și a ciclului celular. Celulele Eca{{{0}} au fost cultivate în vase de 6{0 mm la o densitate de 2,5x1{05 celule/vaș timp de 24 de ore și tratate cu diferite concentrații ({{31} }, 200, 400, 600 și 800 ug/ml) de CTPG-W sau 0,4% DMSO timp de 24 de ore la 37°C cu 5% CO2. Celulele au fost colectate și colorate cu un kit de detectare a apoptozei de iodură de propidiu (PI)/izotiocianat de anexină V-fluoresceină (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), conform protocoalelor producătorului. Probele au fost colectate prin citometrie în flux (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SUA) și analizate prin FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, SUA). Pentru a analiza efectul CTPG-W asupra ciclului celular, 2,5x105 celule Eca-109 au fost însămânțate în vase de cultură de 60 mm și tratate cu CTPG-W (0, 100, 200 și 400 µg/ml) sau 0,4 % DMSO timp de 24 ore la 37˚C cu 5% CO2. Toate celulele au fost recoltate și spălate de două ori cu PBS rece cu gheață (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), apoi fixate în etanol 70% rece la gheață la 4 °C timp de 30 de minute. După spălarea de două ori cu PBS rece cu gheață, celulele au fost resuspendate în 300 pl tampon de colorare PI/RNază (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) timp de 10 minute la temperatura camerei. Distribuția ciclului celular a fost analizată cu software-ul ModFit LT 3.0 prin citometrie în flux (BD FACSCalibur).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSAAnti obosealăProtejează ficatul PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza potențialului membranei mitocondriale (Δψm) și a speciilor reactive de oxigen (ROS).Pentru a analiza Δψm, celulele Eca{{{0}} au fost tratate cu CTPG-W ({0, 400, 600 și 800 µg/ml) sau 0,4% DMSO pentru 24 de ore la 37˚C cu 5% CO2 și colorat cu trusa de testare a potențialului membranei mitocondriale cu JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China), conform protocolului producătorului, timp de 20 de minute la 37˚ C. După spălare de două ori cu tampon de spălare JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), probele au fost resuspendate cu 300 µl tampon de spălare JC-1 și analizate prin citometrie în flux (BD FACSCalibur). Fluorescența colorantului JC-1 în celulele Eca-109 a fost de asemenea observată cu un microscop cu fluorescență inversată (mărire, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Pentru analiza ROS, celulele Eca-109 au fost tratate cu CTPG-W (0, 400, 600 și 800 µg/ml) timp de 2, 4, 6, 12 și 24 de ore și colorate cu testul speciilor reactive cu oxigen kit (Beyotime Institute of Biotechnology), conform protocolului producătorului, timp de 20 min la 37˚C. După spălare de trei ori cu PBS rece cu gheața, probele au fost colectate prin citometrie în flux (BD FACSCalibur) și analizate cu software-ul FlowJo 7.6.

Figura 1. Controlul calificat al CTPG-W. Componentele CTPG-W au fost analizate calitativ și cantitativ prin cromatografie lichidă de înaltă performanță și comparate cu standardele echinacozidei și acteozidei. CTPG-W, glicozide feniletanoide solubile în apă aleC. Tubulos.

Activitatea de captare a radicalilor 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Activitatea de captare a radicalilor liberi a CTPG-W a fost determinată cu un test de radicali liberi DPPH conform protocolului publicat cu o modificare minoră, deoarece metanolul a fost substituit cu etanol pentru a dizolva DPPH (25,26). Pentru măsurătorile la starea de echilibru, 150 µl DPPH (100 mmol/l) în etanol au fost amestecați cu diferite concentrații de CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 și 600 ug/ml) în 50 ui PBS și incubate la întuneric timp de 30 de minute la temperatura camerei. Absorbanța la 517 nm a fost detectată în prezența și absența CTPG-W. Un total de 50 pl de vitamina C a fost utilizat ca martor pozitiv. Activitatea de captare a radicalilor DPPH a fost calculată utilizând formula: Scavenging (%)=[{1-(Asample-Ablank)/A0] x100, unde Ablank este absorbanța controlului (fără DPPH), Asample este absorbanța probei și A0 este absorbanța PBS cu DPPH.

Analiza Western blot. Celulele Eca{{{0}} au fost tratate cu CTPG-W (0, 200, 600 pg/ml) sau 0,4% DMSO timp de 24 de ore la 37°C cu 5% CO2. Următoarea spălare de două ori cu PBS, celule 

Figura 2. Efectul CTPG-W asupra creșterii celulelor Eca-109 și splenocitelor. (A) Celulele Eca-109 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG-W timp de 24, 48 și 72 de ore, iar apoi viabilitatea celulară a fost detectată cu un test MTT. (B) Modificările morfologice ale celulelor Eca-109 după tratamentul CTPG-W la 24 de ore. (C) Splenocitele de șoareci C57BL/6 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG-W timp de 24, 48 și 72 de ore, iar apoi proliferarea a fost analizată cu un test MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulos.

au fost lizate în tampon de liză pentru testarea radioimunoprecipitării (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China) timp de 20 de minute pe gheață. După centrifugare la 10,000 xg timp de 10 minute la 4˚C, supernatanții au fost colectați și concentrațiile de proteine ​​au fost detectate cu un kit de acid bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) conform protocoalelor producătorului. Analiza Western blot a fost efectuată conform descrierii noastre anterioare (24). Anticorpii împotriva caspazei-7 (nr. cat. D120077), caspazei-8 (nr. cat. D155240), caspazei-9 (nr. cat. D220078), limfom cu celule B{{ {13}} (Bcl-2) asociat cu X (Bax) (nr. cat. D220073) și Bcl-2 (nr. cat. D260117) și peroxidază de hrean anti-șoarece IgG (HRP ) (cat. nr. D111050) și anti-iepure IgG-HRP (cat. nr. D110058) au fost achiziționate de la BBI Life Sciences (Shanghai, China). Anticorpii împotriva caspazei-3 (cat. nr. E-AB-10050) și caspazei active{-3 (cat. nr. E-AB{-22115) au fost cumpărați de la Elabscience ( Wuhan, China). Alți anticorpi împotriva caspazei-7 (cat. nr. 9492), poli (ADP-riboză) polimerază (PARP) (cat. nr. 9542), citocromului c (cat. nr. AC909), c-Jun NH{ {37}}kinaza terminală (JNK) (nr. cat. 9252S) și -actina (nr. cat. 58169) au fost obținute de la Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, SUA). Toți anticorpii primari și secundari au fost diluați la 1:1,000. Anticorpii primari au fost incubați la 4 °C peste noapte, iar anticorpii secundari au fost incubați la 37 °C timp de 1 oră.

Figura 3. Apoptoza celulelor Eca-109 indusă de CTPG-W. Celulele au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG-W timp de 24 de ore. (A) Celulele Eca-109 apoptotice și necrotice au fost analizate prin citometrie în flux. Panoul superior prezintă graficele individuale cu puncte, iar panoul inferior prezintă datele rezumative. *P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulos.

Proteinele țintă au fost detectate folosind un kit de testare cu chemiluminiscență îmbunătățită (Beyotime Institute of Biotechnology), conform protocolului producătorului.

Analiza statistica. Semnificația statistică a fost calculată prin analiza unidirecțională a varianței cu testul post-hoc al lui Tukey, iar rezultatele au fost analizate utilizând software-ul GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SUA) printre grupurile de tratament și de control. Toate datele au fost prezentate ca medie ± abatere standard. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

EXTRACT DE CISTANCHE TUBULOSĂ PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI RINCHII PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultate

CTPG-W suprimă creșterea celulelor Eca-109.

Componentele CTPG-W au fost calificate și cuantificate prin HPLC (Fig. 1), care au fost comparate cu standardele de echinacozidă și acteozidă. Conform timpilor de retenție de vârf și zonelor de vârf, CTPG-W a conținut 39,16% echinacozidă și 2,44% actozidă. În primul rând, efectul CTPG-W asupra viabilității celulelor Eca-109 a fost determinat cu un test MTT. CTPG-W a fost dizolvat în DMSO la 200 mg/ml și diluat cu mediu RPMI-1640 care conține 10% FBS inactivat la căldură la concentrațiile indicate. Celulele Eca-109 au fost tratate cu CTPG-W și viabilitatea celulară a fost analizată cu un test MTT la momentele de timp indicate. Tratamentul CTPG-W a redus semnificativ viabilitatea celulelor Eca-109 într-o manieră dependentă de doză și timp (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Figura 4. Efectul CTPG-W asupra distribuției ciclului celular în celulele Eca-109. Au fost utilizate diferite concentrații de CTPG-W pentru a trata celulele Eca-109 timp de 24 de ore și distribuția ciclului celular a fost analizată prin citometrie în flux. *P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulos.

CTPG-W induce apoptoza în celulele Eca-109. Pentru a investiga dacă CTPG-W a suprimat creșterea celulelor Eca-109 prin inducerea apoptozei sau a necrozei, celulele au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG-W. După 24 de ore, apoptoza și necroza celulelor Eca-109 au fost detectate cu colorarea cu anexină V/PI. După cum este descris în Fig. 3A, celulele anexinei V-/PI+ au fost încadrate ca celule necrotice, iar celulele anexinei V+/PI+ și anexine V+/PI- au fost încadrate ca celule apoptotice. CTPG-W a indus în primul rând apoptoza celulelor Eca-109 într-o manieră dependentă de doză, deși celulele Eca-109 necrotice au crescut, de asemenea, semnificativ sub tratamentul cu 600 și 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W induce oprirea ciclului celular la faza S în celulele Eca-109. Perturbarea ciclului celular canceros va suprima creșterea celulelor și va promova apoptoza (27). Distribuția ciclului celular în celulele Eca-109 a fost detectată cu colorare PI după tratamentul CTPG-W timp de 24 de ore. S-a observat că celulele din faza S au crescut, iar celulele din fazele G0/G1 au indicat o scădere semnificativă generală la tratamentul cu CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W scade Δψm și induce eliberarea citocromului c. Apoptoza poate fi indusă printr-o cale mitocondrială dependentă (28,29). Membrii pro- și anti-apoptotici ai familiei de proteine ​​BCL-2 au roluri importante în reglarea integrității membranei mitocondriale (30,31). După tratamentul CTPG-W timp de 24 de ore, Δψm a fost evaluat folosind colorarea JC-1. Agregatul JC-1 (fluorescența roșie detectată în FL-2) se va dezintegra în monomer (fluorescența verde detectată în FL-1) când Δψm se reduce (32). Așa cum este prezentat în Fig. 5A, frecvențele celulelor FL-1+ FL{-2-/+ au crescut semnificativ într-o manieră dependentă de doză, indicând faptul că Δψm celulelor Eca-109 a scăzut. Modificările de fluorescență în celulele Eca-109 au fost observate și cu un microscop cu fluorescență inversată (Fig. 5B). Odată cu creșterea concentrațiilor de CTPG-W, fluorescența roșie a scăzut și fluorescența verde a crescut, ceea ce este în concordanță cu datele din citometria în flux. Sa observat, de asemenea, că nivelul de citocrom c din citosol a fost semnificativ crescut (Fig. 5C), ceea ce este rezultatul unei reduceri a Δψm. Acest lucru întărește concluzia trasă din numărul crescut de celule FL-1+ FL{-2-/+ că Δψm a scăzut ca urmare a tratamentului CTPG-W. S-a raportat că JNK poate regla activarea familiei de proteine ​​BCL-2 provocând eliberarea citocromului c (33-35). S-a determinat, de asemenea, că nivelul JNK a fost în mod semnificativ suprareglat după tratamentul CTPG-W (Fig. 5C). Rezultatele au indicat că CTPG-W poate induce apoptoza celulelor Eca-109 printr-o cale dependentă de mitocondrii.

Figura 5. Reducerea Δψm și reglarea în sus a citocromului c și JNK. Celulele Eca-109 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG-W timp de 24 de ore. (A) Δψm a fost detectat prin colorare JC-1 și probele au fost analizate prin citometrie în flux. Graficele cu puncte individuale descriu modificările fluorescenței JC-1. Frecvențele celulelor FL-1+ FL{-2-/+ sunt prezentate în panoul inferior. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Figura 6. Nivelurile de ROS în celulele Eca-109 după tratamentul cu CTPG-W și activitatea antioxidantă a CTPG-W. (A) Celulele Eca-109 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG-W, iar nivelurile de ROS au fost analizate prin citometrie în flux la momentele de timp indicate. *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Efectul CTPG-W asupra generării intracelulare de ROS.ROS ar putea reduce Δψm pentru a induce apoptoza (36). Pentru a investiga dacă CTPG-W poate crește producția de ROS, celulele Eca-109 au fost tratate cu diferite concentrații de CTPG-W. Celulele au fost colectate la momentele de timp indicate și colorate cu DCFH-DA. Producția de ROS intracelular în celulele Eca-109 a fost determinată prin citometrie în flux. După cum este descris în Fig. 6A, 800 ug/ml CTPG-W a crescut semnificativ producția de ROS de la 2-6 h și a scăzut de la 12-24 h. În plus, 400 µg/ml CTPG-W a crescut semnificativ producția de ROS de la 12-24 h. În plus, 200 ug/ml CTPG-W nu a modificat în mod semnificativ producția de ROS. Modificările dinamice ale producției de ROS pot fi asociate cu apoptoza celulelor Eca-109. S-a determinat, de asemenea, că CTPG-W a avut activitate de captare a radicalilor liberi (Fig. 6B), care poate fi asociată cu scăderea producției de ROS în celulele Eca-109 tratate cu 800 ug/ml CTPG-W după 12 ore.

Figura 7. Nivelurile clivate-caspaze și clivate-PARP după tratamentul CTPG-W. Proteinele au fost izolate din celulele Eca-109 tratate cu CTPG-W timp de 24 de ore și nivelurile de caspaze clivate și clivate-PARP au fost detectate cu analiza Western blot. DMSO, dimetil sulfoxid; CTPG-W, glicozide feniletanoide solubile în apă aleC. Tubulos; PARP, poli (ADP-riboză) polimerază.

CTPG-W reglează activitatea caspazei-3, caspazei-7, caspazei-9 și PARP. Eliberarea citocromului c datorită reducerii Δψm ar putea activa proteazele caspaze pentru a induce apoptoza (29,30,37). După tratamentul cu CTPG-W timp de 24 de ore, activarea caspazei-3, 7, 8, 9 și PARP a fost detectată prin analiza Western blot. În comparație cu controlul, nivelurile de caspază clivată-9, caspază clivată-7, caspază clivată-3 și PARP clivată, dar nu nivelurile de caspază clivată{{20} }}, au fost suprareglate prin tratamentul CTPG într-o manieră dependentă de doză (Fig. 7). Aceste rezultate au indicat că CTPG-W a redus Δψm și a promovat eliberarea citocromului c pentru a activa caspazele care induc apoptoza celulelor Eca-109.

Discuţie

CHM tradițional ar putea induce apoptoza celulelor canceroase esofagiene prin diferite căi, inclusiv receptorul de moarte extrinsecă și căile de stres intrinseci mitocondriale și reticulului endoplasmatic (29). Studiul nostru anterior a demonstrat că CTPG, ca componentă majoră a C. tubulosa, a inhibat creșterea celulelor melanomului B{16-F1{{0 prin inducerea apoptozei printr-o cale dependentă de mitocondrie (24). În studiul de față, a fost investigat efectul antitumoral al CTPG-W asupra celulelor Eca-109 și s-a determinat că CTPG-W a suprimat creșterea celulelor Eca{-109, a indus apoptoza și oprirea ciclului celular, a redus Δψm, a crescut eliberarea citocromului c și a activat caspazele. CTPG și CTPG-W ar putea induce apoptoza și oprirea ciclului celular în celulele canceroase. Cu toate acestea, mecanismele precise sunt diferite din cauza diferitelor componente ale CTPG (26,64% echinacozidă, 10,19% actozidă și 1,71% izoacteozidă) și CTPG-W (39,16% echinacozidă și 2,44% actozidă). CTPG a oprit celulele B16-F10 la fazele G0/G1, dar CTPG-W a oprit celulele Eca{-109 la faza S (24). Producția de ROS a fost crescută în funcție de doză de CTPG, dar a indicat o schimbare într-o manieră dependentă de timp printr-o doză mare de CTPG-W, care a crescut semnificativ la începutul tratamentului cu CTPG-W (2-6 h) și a scăzut semnificativ după 12 ore, comparativ cu martor. Un posibil motiv este că componenta majoră a CTPG-W este echinacozidul. Mai multe studii au raportat că echinacozidul ar putea inhiba producția de ROS și apoptoza indusă de ROS pentru a-și exercita efectele neuroprotective și anti-îmbătrânire (38-40). În mod similar, activitatea de captare a radicalilor liberi a fost observată în studiul de față. Prin urmare, s-a speculat că unele componente, inclusiv verbascozida, izo-verbascozida și salidrozida într-o doză mare de CTPG-W ar putea induce imediat generarea de ROS pentru a provoca apoptoza celulelor Eca-109 (41, 42), și apoi ROS a fost eliminat de echinacoside. Un alt motiv posibil pentru diferențele în producția de ROS de către CTPG și CTPG-W este că au fost utilizate linii celulare diferite în acest studiu și în studiul anterior (24). Dong și colab. (43) au raportat că echinacozidul ar putea induce apoptoza celulelor umane de cancer colorectal SW480 prin generarea de leziuni oxidative ADN fără niveluri crescute de ROS.

Tratamentul CTPG-W a redus Δψm și a provocat eliberarea citocromului c, care promovează scindarea caspazei-9 (28). În mod constant, nivelurile de caspază scindată-9 au fost reglate în plus prin tratamentul CTPG-W. Ulterior, caspaza activă-9 poate activa caspaza-3 pentru a induce apoptoza (44). Nivelurile de caspază scindată-3 au fost, de asemenea, suprareglate prin tratamentul CTPG-W. Cu toate acestea, caspaza-8 nu a fost activată de CTPG-W, ceea ce indică faptul că calea receptorului de moarte extrinsecă nu a fost implicată în apoptoza indusă de CTPG-W. Aceste observații indică faptul că CTPG-W induce apoptoza celulelor Eca-109 prin activarea unei căi dependente de mitocondrii.

PARP joacă roluri importante în stabilitatea genomică și poate fi scindată de caspazele active, în special caspaza-3 și -7 (45). S-a determinat că tratamentul cu CTPG-W a activat caspaza-3 și -7, care pot scinda PARP pentru a inhiba repararea ADN-ului și a provoca apoptoza.

CTPG-W suprimă, de asemenea, în funcție de doză și de timp, creșterea celulelor BEL-7404 de carcinom hepatocelular uman (date nepublicate). Deși CTPG-W inhibă creșterea celulelor Eca-109 și BEL{-7404, promovează proliferarea splenocitelor, care se poate datora conținutului de polizaharide (~50%) din CTPG-W (46). ). În mod similar, mai multe studii au raportat că polizaharidele pot promova proliferarea splenocitelor (46-49). În modelul de șoarece, s-a determinat că CTPG-W a crescut semnificativ indicele splinei, în comparație cu grupul de control, dar nu a afectat greutatea corporală și ceilalți indici de organe, inclusiv inima, ficatul, rinichiul și plămânul (date nepublicate), indicând faptul că CTPG-W nu are efect citotoxic asupra celulelor normale.

În mod colectiv, datele au indicat că CTPG-W inhibă creșterea celulelor Eca-109 prin inducerea apoptozei printr-o cale dependentă de mitocondrii.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%