Proprietăți foto-protectoare și anti-melanogenice ale diferitelor extracte de Kadsura Coccinea

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Radiația solară ultravioletă (UV), caracterizată prin UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) și UVC (100–280 nm), este cel mai critic factor de mediu care provoacă cancer de piele și fotoîmbătrânire care rezultă din citotoxicitate, genotoxicitate și fototoxicitatea. Mai exact, radiațiile UVA și UVB cuprind peste 95% și, respectiv, 3% din iradierea UV zilnică [8]. Iradierea UVA și UVB poate induce specii reactive de oxigen (ROS) indirect sau direct prin pătrunderea în straturile epidermice și/sau dermice ale pielii, ducând la deteriorarea oxidativă și moartea celulelor. În ultimele decenii, radiațiile UV au devenit o problemă serioasă pentru sănătatea pielii și încă se răspândesc periculos în întreaga lume [9-11]. Iradierea UV este un stimulent direct și consistent al keratinocitelor, care reprezintă aproximativ 95% din masa celulelor epidermice ale pielii. Keratinocitele acționează ca prima barieră împotriva pericolelor microbiene, chimice și fizice și ajută la apărarea împotriva radiațiilor UVA și UVB. Când keratinocitele sunt expuse la UVA și UVB, se generează ROS intracelular, declanșând astfel apoptoza [12-14].

Melanocitele sunt responsabile de producerea și cantitatea de pigmenți de melanină, care sunt jucători importanți în apărarea biologică a epidermei pielii; dereglarea lor poate provoca hiperpigmentare sau tulburări de hipopigmentare [15,16]. Melanocitele sunt distribuite în stratul bazal al epidermei pielii, care este, de asemenea, afectat de expunerea la soare, specii reactive de oxigen (ROS) și hormoni stimulatori ai melanocitelor (-MSH) [17,18]. Tirozinaza, un membru al familiei de proteine ​​de tip-3 cupru, este o metaloproteină conservată evolutiv care joacă un rol crucial în melanogeneză și în activitățile monofenol monooxigenazei, catecolazei și difenolilor. Reglarea în jos a tirozinazei, a proteinei înrudite cu tirozinaza-1 (TRP-1) și a proteinei înrudite cu tirozinaza-2 (TRP{-2) au efecte catalitice distincte. TRP-1 este o 5,6-dihidroxiindol-2-oxidază a acidului carboxilic, iar TRP-2 este o DOPAcrom tautomerază [19,20]. În plus, factorul de transcripție legat de mioftalmoză (MITF) și proteina de legare a elementelor care răspunde la cAMP (CREB) sunt factori de transcripție care reglează în primul rând melanogeneza și codifică informații despre modul și intensitatea stimulării [17,21]. Mai multe studii au afirmat că căile MITF și CREB reglează melanogeneza. MITF este un factor cheie în transcrierea enzimelor legate de melanogeneză și regulatorul central al melanogenezei. -MSH duce la exprimarea MITF printr-un mecanism de semnalizare care implică proteina de legare legată de cAMP (CREB). Apoi, MITF intră în nucleu cu secvența M-box (AGTCATGTGCT) pentru a promova transcripția genelor și enzimelor melanogene specifice. Se știe, de asemenea, că CREB fosforilat este stimulat de -MSH, care se leagă de elementul de consens CRE din promotorul Mitf pentru a regla transcripția Mitf [21–24].

În acest studiu, extractele de rădăcină KC (KCR), tulpină (KCS), frunze (KCL) și fructe (KCF) au fost comparate în mod cuprinzător și au fost efectuate evaluări multiple ale proprietăților lor fotoprotectoare și anti-melanogenice.

2. Materiale și metode

2.1. Prepararea extractelor KC

O plantă KC 15 de trei ani a fost cultivată într-un vas de plastic de 9 L în campusul Miryang al Universității Naționale Pusan. KC a fost identificat de profesorul Young Whan Choi, autorul acestui studiu. Aceste eșantioane au fost depuse sub formă de exemplare voucher (număr de acces KC-PDRL-1) la herbarul Departamentului de Bioștiințe Horticole, Colegiul de Resurse Naturale și Știința Vieții, Universitatea Națională Pusan. Plantele au fost udate suficient folosind o soluție nutritivă completă cu un nivel de conductivitate de 1,0 mS·cm−1 și care conține următoarele elemente (în me·L−1): NO{3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; și S, 4. Roba KC din port a fost recoltată în decembrie 2020 prin clasificarea rădăcinilor, tulpinilor, frunzelor și fructelor (Figura 1A). Probele recoltate au fost imediat liofilizate într-un liofilizator și depozitate în pungi de vinil la 20 ◦ C până la analiză. Rădăcinile, tulpinile, frunzele și fructele uscate de KC (20 g) au fost măcinate până la o pulbere fină și extrase la temperatura camerei cu alcool etilic. Pe scurt, filtrarea și evaporarea extractelor EtOH de KC au fost efectuate sub presiune redusă la 45 °C, urmată de liofilizare. În cele din urmă, extractul solid (50 mg/mL) a fost dizolvat în dimetil sulfoxid (DMSO) pentru experimente ulterioare.

cistancheherba epimedium sagittatumextrage

2.2. Conținutul total de polifenolici și flavonoizi al extractelor de KC

După cum s-a descris anterior [25], conținutul total de polifenoli și flavonoizi din extractele de rădăcină, tulpină, frunze și fructe de KC a fost măsurat folosind metodele colorimetrice Folin-Ciocalteu (polifenol total) și clorură de aluminiu (flavonoid). Absorbanța a fost măsurată la 700 nm (polifenol total) utilizând Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Marea Britanie) și la 510 nm (flavonoid) folosind VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Waltham, MA, SUA) .

Curbele standard au fost construite folosind acid galic (polifenol total) și quercetină (flavonoid) ca standarde, iar rezultatele au fost exprimate ca echivalenți de acid galic per gram (GAE/g) de extracte de rădăcină, tulpină, frunze și fructe KC și echivalent de quercetină. pe gram (QE/g) de extracte de rădăcină, tulpină, frunze și, respectiv, de fructe KC.

2.3. Testul DPPH și ABTS

Activitățile de captare a radicalilor DPPH și ABTS ale extractelor de rădăcină, tulpină, frunze și fructe KC ({{0}},5 mg/mL) au fost măsurate conform unei metode descrise anterior [25] cu ușoare modificări. Extractele de rădăcină, tulpină, frunze și fructe de KC (0,5 mg/mL) au fost amestecate cu soluție de DPPH (60 µM) în microplăci. După ce probele au fost agitate energic, acestea au fost ținute la întuneric la 25 ◦ C timp de 0,5 ore. Soluțiile stoc de 7 mM ABTS și 2,6 persulfat de potasiu au fost preparate în apă distilată la temperatura camerei în întuneric timp de 18 ore. Extractele de rădăcină, tulpină, frunze și fructe de KC (0,5 mg/mL) au fost amestecate cu soluția de lucru și apoi lăsate să stea timp de 0,5 ore la temperatura camerei în întuneric. Absorbanța amestecurilor de probe a fost monitorizată la 510 nm (DPPH) sau 734 nm (ABTS).

2.4. Cultură de celule

Keratinocitele aderate (HaCaT) și melanocitele aderate (B16F10) au fost inoculate în soluție de cultură DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, SUA) care conține 10% FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, SUA) și 1% penicilină/streptomicina (Invitrogen). Corporation, Carlsbad, CA, SUA) și cultivate la 37 ◦C cu 5% CO2. Creșterea celulelor HaCaT și B16F10 aderate a fost observată în mod regulat, iar mediul a fost schimbat la fiecare două până la trei zile. Celulele din faza de creștere logaritmică au fost utilizate pentru experimentele ulterioare.

2.5. Iradierea UVA și UVB

Keratinocitele au fost expuse la iradierea UVA sau UVB (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Germania) cu tuburi 5 8 W care emit cea mai mare parte a energiei lor la un vârf de emisie la 365 nm ( UVA) sau 312 nm (UVB). Dozele de iradiere UVA au fost de 20 J/cm2 iar dozele de iradiere UVB au fost de 50 mJ/cm2.

2.6. Măsurarea viabilității celulare și a citotoxicității prin analiza CCK-8 și LDH

Pentru analiza viabilității celulare, la keratinocitele HaCaT s-a adăugat soluție Cell Counting Kit-8 (CCK{-8) din trusa de testare CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). și suspensii de celule de melanom B16F10 conform instrucțiunilor producătorului și incubate la 37 ◦ C timp de 4 ore. Pe scurt, celulele 2 104 au fost însămânțate în fiecare godeu al unei plăci de 24-godeuri și incubate cu 5% CO la 37 ◦C timp de 24 de ore. Pe scurt, celulele 2 104 au fost însămânțate în fiecare godeu al unei plăci de 24-godeuri și incubate cu 5% CO la 37 ◦C timp de 24 de ore. După 24 de ore de incubare, reactivul CCK-8 a fost adăugat în fiecare godeu, iar celulele au fost incubate în continuare timp de 4 ore. Un kit de detectare a citotoxicității (Roche Applied Science, Elveția) a fost utilizat pentru a determina eliberarea extracelulară de lactat dehidrogenază (LDH) în mediul de cultură de keratinocite HaCaT. Absorbanța a fost analizată la 450 nm (CCK-8) și 490 nm (LDH) utilizând un cititor de plăci cu mai multe etichete VICTOR.

2.7. Evaluarea producției intracelulare de ROS în keratinocite

Nivelurile intracelulare de ROS au fost analizate folosind {{0}}(și-6)-clorometil-2′,7′-diclorura-hidrofluorescein diacetat acetil ester (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Toate procedurile au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, după tratamentul cu alte extracte parțiale cu KC (0,5 mg/mL), Keratinocitele (HaCaT) au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și incubate cu CM-H2DCFDA (5 µM) timp de 0,5 ore în întunericul. După aceea, generarea de ROS intracelular a fost vizualizată utilizând microscopul cu fluorescență Carl Zeiss; intensitatea fluorescenței a fost măsurată pe baza unui colorant fluorescent (CM-H2DCFDA) folosind un citometru de flux (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, SUA).

2.8. Analiza apoptozei

După expunere și tratament, keratinocitele HaCaT au fost tripsinizate și centrifugate. Ulterior, apoptoza celulelor obținute a fost evaluată utilizând kitul Annexin V/Dead CellApoptosis izotiocianat de fluoresceină (FITC) (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, keratinocitele au fost clătite de două ori cu PBS, iar keratinocitele din tamponul de legare a anexinei au fost obținute și amestecate cu soluție de lucru FITC/Anexină V (componenta A) și iodură de propidiu (PI). După incubare la temperatura camerei timp de 15 minute în întuneric, a fost măsurată apoptoza keratinocitelor și procentul de celule apoptotice a fost calculat utilizând un citometru în flux (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, SUA). Au fost detectate semnale pentru canalele FL1 (FITC/Nexin V) și FL3 (PI) și au fost stabilite colorarea markerului de cadran și graficele cu puncte ale celulelor colorate.

2.9. Analiza conținutului de melanină intracelulară și a activității tirozinazei

Conținutul de melanină intracelulară și testele activității tirozinazei au fost măsurate explicând unde diferă procedura ușor modificată [24]. Melanocitele au fost tratate cu o concentrație finală de 0,5 pM -MSH și cu 0,5 mg/mL KC alte extracte parțiale timp de 48 de ore. Peletele de melanocite au fost lizate cu NaOH 1 N în 10 procente de DMSO la 80 ◦C timp de 1 oră. Conținutul relativ de melanină a fost determinat prin măsurarea absorbanței la 475 nm folosind un cititor de plăci VICTORMultilabel. Activitatea tirozinazei intracelulare a fost determinată prin măsurarea ratei de producție de dopacrom folosind L-DOPA. Melanocitele au fost spălate cu PBS rece cu gheață și lizate în PBS care conține 1% (g/v) Triton X-100. Substratul de tirozinază L-DOPA (2 mg/mL) a fost preparat în același tampon de liză fosfat. Fiecare extract a fost plasat într-o placă de 96-godeuri și analiza enzimatică a fost inițiată prin adăugarea unei soluții de L-DOPA. După incubare timp de 1 oră, absorbanța a fost măsurată la 475 nm folosind un cititor de plăci VICTOR Multilabel pentru a analiza producția de dopacrom. Valoarea fiecărei măsurători a fost exprimată ca procent din control. Arbutina (A, 0,5 mg/ml) a fost utilizată ca martor pozitiv.

Cistancheechinacozideste un inhibitor al tirozinazei.

2.10. PCR cantitativ în timp real

ARN-ul total a fost izolat din fiecare grup de melanocite folosind kitul RNeasy Mini (QIAGEN, Hilden, Germania). Transcripția inversă a fost efectuată utilizând kitul de transcripție inversă ADNc de mare capacitate (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, SUA), conform instrucțiunilor producătorului, pentru a obține prima catenă de ADNc. Șuvițele au fost apoi utilizate ca șabloane pentru PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) folosind un instrument Bio-Rad Chromo4TM și mixul principal SYBR Green qPCR (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, SUA). PCR a fost efectuată sub pre-denaturare la 95 ◦ C timp de 5 minute, denaturare la 95 ◦ C timp de 15 s și recoacere la 55-58 ◦ C timp de 30 s. ARNm GAPDH a fost folosit ca referință internă pentru ARNm de tirozinază, TRP-1 și TRP-2. Valoarea relativă a expresiei genei țintă=2−∆∆CT. Secvențele de primer au fost după cum urmează: tirozinaze-sens (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), tirozinaze-anti-sens (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc{-3′), TRP-1-sens (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-anti-sens (5′-ggtctccctacatttccagc{-3′), TRP-2-sens (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-antisens (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sens (5′-aggtggtctcctctgacttc{-3′) și GAPDH-antisens (5′-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. Western Blotting

Melanocitele au fost recoltate și lizate folosind un reactiv de extracție a proteinelor de mamifere (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Toate procedurile au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Toate concentrațiile de proteine ​​au fost determinate folosind un kit de testare a proteinelor Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). Apoi, tamponul de încărcare a fost adăugat la supernatantul proteic și amestecat. Amestecul a fost fiert timp de 10 minute, iar proteinele au fost separate folosind geluri prefabricate Mini-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) și transferate pe o membrană de difluorură de poliviniliden Hybond (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SUA). Imunodetecția a fost efectuată folosind tirozinaza (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), CREB fosforilat (p-CREB 1: 1000), CREB (1:1000) și -tubulină (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, SUA) utilizând kitul SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Membrana a fost incubată peste noapte cu anticorpii primari la 4 ◦C. Anticorpul secundar de capră anti-iepure (IgG) (1:5000, Cell Signaling Technology) a fost adăugat la membrană și incubat la temperatura camerei timp de 1 oră. Benzile de proteine ​​au fost observate folosind un substrat de western blotting Pierce ECL îmbunătățit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) și s-au cuantificat ca raport dintre intensitatea benzii proteice țintă și intensitatea benzii -tubulină.

2.12. Analize statistice

Toate testele au fost repetate independent de cel puțin trei ori. Toți parametrii statistici sunt prezentați ca eroare standard medie a mediei (SEM). Analizele statistice au fost efectuate folosind analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul post-hoc al lui Dunn. O valoare de p < 0.01="" sau="" p="">< 0,05="" a="" fost="" considerată="">

test pentru flavonoide

3. Rezultate

3.1. Comparația proprietăților antioxidante ale mai multor extracte parțiale de KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 la sută) > KCF (8,7 ± 1,1 la sută) (Figura 1E).

3.2. Comparația dintre cheratinocite viabile și deteriorate tratate cu mai multe extracte parțiale de KC în prezența UVA, UVB sau non-iradiere

Am efectuat următoarele experimente pentru a explora efectele onkeratinocitelor KCR, KCS, KCL și KCF. În primul rând, toate extractele au fost aplicate pe keratinocite HaCaT în prezența UVA, UVB sau non-iradiere. Analiza CCK-8 a arătat că extractele nu au modificat semnificativ viabilitatea keratinocitelor la concentrații de 0,5 mg/mL. Mai târziu, keratinocitele au fost tratate cu KCR, KCS, KCL și KCF în prezența iradierii UVA sau UVB. Iradierea UVA și UVB a inhibat semnificativ viabilitatea keratinocitelor, așa cum se arată prin analiza CCK-8 din Figura 2A. Cu toate acestea, am constatat că viabilitatea keratinocitelor iradiate cu UVA și UVB a crescut în următoarea ordine: KCL, KCR, KCS și KCF (Figura 2A). De asemenea, am monitorizat keratinocitele deteriorate prin măsurarea eliberării extracelulare de LDH. Rezultatele au arătat că iradierea UVA sau UVB a facilitat în mod semnificativ eliberarea de LDH; cu toate acestea, KCL, KCR, KCS și KCF au atenuat semnificativ eliberarea de LDH cu expunerea la UVA sau UVB în această ordine (Figura 2B). Rezultatele experimentale de mai sus au arătat că efectele anti-proliferative și citotoxice ale iradierii UVA sau UVB asupra keratinocitelor au fost atenuate în ordinea KCL, KCR, KCS și KCF. În special, KCL poate restabili viabilitatea celulelor la niveluri de control.

Figura 2. Viabilitatea keratinocitelor și efectele de citotoxicitate ale extractului KCR, KCS, KCL și KCF în prezența UVA, UVB sau non-iradiere.

3.3. Comparația producției intracelulare de ROS în cheratinocite tratate cu mai multe extracte parțiale de KC în prezența sau absența iradierii UVA și UVB

Deoarece producția intracelulară de ROS provoacă leziuni severe ale keratinocitelor, acestea sunt considerate potențiali mediatori ai daunelor induse de radiațiile UVA sau UVB. Mai multe studii au sugerat că iradierea UVA sau UVB induce producția endogenă de ROS [12,14]. Ne-am propus să determinăm dacă a existat o creștere a nivelurilor endogene de ROS în keratinocitele iradiate cu UVA sau UVB. În consecință, am analizat intensitatea fluorescenței intracelulare a sondei CM-H2DCFDA utilizând microscopia cu fluorescență și citometria în flux. Ca urmare a microscopiei cu fluorescență, imaginile de colorare cu CM-H2DCFDA au arătat o ușoară colorare în cheratinocite tratate cu KCR, KCS, KCL și KCF și colorare semnificativă în keratinocitele iradiate cu UVA sau UVB (Figura 3A). Conform rezultatelor cuantificate ale citometriei în flux, iradierea UVA și UVB a crescut nivelurile intracelulare de ROS în keratinocite cu 27,2 ± 4,5 la sută și, respectiv, 34,1 ± 4,2 la sută, comparativ cu cea din control (5,7 ±0,2 procente). În plus, similar cu rezultatele microscopiei cu fluorescență, s-a confirmat că nivelul ROS intracelular a fost suprimat de extractele KC în ordinea KCL > KCR > KCS > KCF în prezența iradierii UVA sau UVB (Figura 3B). Aceste rezultate indică faptul că mai multe extracte parțiale de KC au inhibat semnificativ deteriorarea keratinocitelor prin reducerea nivelurilor endogene de ROS.

Figura 3. Efectul extractului KCR, KCS, KCL și KCF asupra producției intracelulare de ROS în UVA, UVB sau keratinocite neiradiate

3.4. Comparația apoptozei keratinocitelor tratate cu mai multe extracte parțiale de KC în prezența sau absența iradierii UVA și UVB

Pentru a detecta apoptoza, care este un indicator de încredere al deteriorarii keratinocitelor, keratinocitele au fost colorate cu anexină V în combinație cu iodură de propidiu. Kitul de apoptoză cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit a fost utilizat pentru a testa viteza de apoptoză în keratinocite. Iradierea UVA și UVB a facilitat activitatea de colorare a anexinei V, în timp ce KCR, KCS, KCL și KCF au scăzut rata activității de colorare a anexinei V în prezența iradierii UVA și UVB. Numai KCR, KCS, KCL și KCF (0,5 mg/mL) nu au indus activitate de colorare a anexinei V. Datele cuantificate din citometria în flux au arătat că iradierea UVA și UVB a crescut nivelurile de apoptoză ale keratinocitelor cu 46,3± 1,5 la sută și 48,7 ± 1,0 la sută, respectiv, în comparație cu cea a controlului (5,0 la sută ± 0,7 la sută). Important, s-a confirmat că nivelul de apoptoză a fost suprimat de extractele KC în ordinea KCL > KCR > KCS > KCF în prezența iradierii UVA sau UVB (Figura 4A, B). În general, iradierea UVA și UVB a cauzat leziuni ale keratinocitelor și câteva extracte parțiale de KC au atenuat daunele keratinocitelor induse de iradierea UV.

Figura 4. Efectul extractelor KCR, KCS, KCL și KCF asupra apoptozei în UVA, UVB sau keratinocite neiradiate.

3.5. Comparația conținutului de melanină intracelulară și a activității tirozinazei a melanocitelor tratate cu mai multe extracte parțiale de KC în prezența sau absența tratamentului -MSH

Înainte de a investiga potențialul biologic al KCR, KCS, KCL și KCF asupra melanogenezei induse de MSH, viabilitatea celulară după tratamentul cu KCR, KCS, KCL și KCF (0.5 mg/mL) a fost evaluată folosind testul CCK-8 în melanocitele B16F10 cu sau fără -MSH. KCR, KCS, KCL și KCF (0,5 mg/mL) nu au modificat viabilitatea celulară în prezența sau absența -MSH (Figura 5A). -MSH este un agent melanogenic important care poate crește conținutul intracelular de melanină prin legarea de receptorul melanocortin 1 și activarea adenilat-ciclazei. Pentru a investiga efectul KCR, KCS, KCL și KCF asupra melanogenezei în melanocite, conținutul de melanină intracelular a fost determinat prin observație vizuală și măsurători biochimice. După cum se arată în Figura 5B, conținutul de melanină intracelular a fost crescut semnificativ de -MSH. Cu toate acestea, co-tratamentul cu KCR, KCS, KCL și KCF a arătat o reducere remarcabilă a conținutului de melanină intracelulară în comparație cu tratamentul -MSH. Secvența măsurătorilor biochimice care indică inhibarea conținutului de melanină intracelulară a fost următoarea: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 5B). Analiza activității tirozinazei intracelulare a fost efectuată conform testului de conținut de melanină intracelulară. Activitatea tirozinazei intracelulare a melanocitelor stimulate de -MSH a crescut, în timp ce cea a melanocitelor stimulate de -MSH tratate cu KCR, KCS, KCL și KCF a scăzut. Secvența măsurătorilor biochimice care indică inhibarea activității tirozinazei intracelulare a fost următoarea: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 5C). Aceste rezultate indică faptul că mai multe extracte parțiale de KC au redus semnificativ conținutul de melanină intracelulară și au inhibat activitatea tirozinazei fără a modifica viabilitatea celulară.

3.6. Comparația nivelurilor de transcripție și traducere ale tirozinazei, TRP-1 și TRP-2 în melanocite tratate cu mai multe extracte parțiale de KC în prezența sau absența-Tratament MSH

Pentru a explora efectul KCR, KCS, KCL și KCF asupra scăderii nivelurilor de expresie a proteinei și ARNm ale markerilor de melanogeneză (tirosinaza, TRP-1 și TRP-2), melanocitele au fost tratate cu KCR , KCS, KCL și KCF în prezența sau absența -MSH. După cum se arată în Figura 6A-C, nivelurile de ARNm ale tirozinazei, TRP-1 și TRP-2 au fost semnificativ crescute prin tratamentul cu -MSH. În schimb, în ​​comparație cu tratamentul -MSH, KCR, KCS, KCL și KCF au redus expresia ARNm a tirozinazei, TRP-1 și TRP-2. În plus, KCR, KCS, KCL și KCF nu au avut un efect semnificativ asupra nivelurilor de ARNm de tirozinază, TRP-1 și TRP-2. Analiza Western blot a fost efectuată în cooperare cu PCR în timp real. Rezultatele au arătat că tratamentul cu -MSH a crescut nivelurile de exprimare a proteinei ale tirozinazei, TRP-1 și TRP{-2 și că aceste niveluri au fost scăzute prin co-tratament cu KCR, KCS, KCL și KCF (Figura 6D). ). Secvența de PCR cantitativă în timp real și inhibarea western blot-indicating a tirozinazei, TRP-1 și TRP-2 ARNm și expresie a proteinei a fost următoarea: KCL > KCR=KCS > KCF (Figura 6). Aceste rezultate sugerează că mai multe extracte parțiale de KC au potențialul de a promova anti-melanogeneza, ceea ce a fost demonstrat prin reglarea în jos a markerilor de melanogeneză.

3.7. Comparație între expresia MITF și fosforilarea CREB a melanocitelor tratate cu mai multe extracte parțiale de KC în prezența sau absența tratamentului -MSH

Tirozinaza, TRP-1 și TRP-2 sunt esențiale în melanogeneză. Expresia lor este reglată de expresia MITF și fosforilarea CREB [17,21]. Analiza Western blot a indicat că KCR, KCS, KCL și KCF au inhibat eficient creșterea nivelului proteic al MITF cauzată de tratamentul cu -MSH. În plus, KCR, KCS, KCL și KCF au detectat cu greu expresia proteinei MITF. Secvența rezultatelor Western blot cuantificate care indică inhibarea nivelurilor de expresie a proteinei MITF a fost următoarea: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 7A). Mai mult, KCR, KCS, KCL și KCF au inversat efectele tratamentului cu -MSH asupra fosforilării CREB. Numai KCR, KCS, KCL și KCF au avut un efect redus asupra fosforilării CREB. Secvența rezultatelor Western blot cuantificate care indică inhibarea nivelurilor de fosforilare CREB a fost următoarea: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 7B). Aceste rezultate au indicat că mai multe extracte parțiale de KC au suprimat melanogeneza inmelanocitelor, cel puțin parțial, prin expresia MITF și fosforilarea CREB.

4. Discutie

Popularitatea albirii pielii este în creștere la nivel mondial datorită creșterii iradierii UV și este probabil să atingă proporții mari în următoarele decenii în scopuri estetice [8]. Numeroasele tipuri de înălbitor, cum ar fi acidul kojic și arbutina, au fost utilizate pe piețele cosmetice și farmaceutice. În plus, extractele naturale primesc o atenție din ce în ce mai mare datorită activităților lor potențiale antioxidante, antiinflamatorii, antitumorale, antibacteriene și alte activități [26,27]. Pe baza caracteristicilor antioxidanților și fotoprotector și anti-melanogeneză, au fost dezvoltați mai mulți candidați cosmetici și farmaceutici. Este bine cunoscut faptul că aceste proprietăți ale candidaților pentru albire contribuie indispensabil la cercetarea și dezvoltarea cosmetică și farmaceutică [28]. TDM are proprietăți multicomponente și multi-țintă și îmbunătățește considerabil eficacitatea biologică umană și calitatea vieții [29]. Cercetările fitochimice moderne arată că KC conține o varietate de ingrediente, lignanii și terpenoizii fiind ingredientele principale [30]. Au fost identificați mai mult de 202 de compuși, inclusiv lignani dibenzociclooctadien, lignani spirobenzofuranoid dibenzociclooctadien, lignani arilnaftalenă, triterpenoide Kadlongilactone și sesquiterpenoide [31,32]. Rădăcinile uscate, tulpinile și frunzele KC au o tradiție largă de utilizare în TDM pentru a trata artrita reumatoidă, ulcerul duodenal, tulburările gastrointestinale și problemele ginecologice. Rădăcinile uscate de KC, cu acțiuni de curățare a căldurii și eliminarea toxinelor, inducând diureza pentru îndepărtarea edemului. Fructele KC sunt consumate în mare parte sub formă de fructe proaspete, sucuri și vin din fructe, ceea ce indică faptul că sunt benefice pentru sănătatea umană [7,33,34]. Studiile anterioare au arătat, de asemenea, că este bogat în ingrediente bioactive, cum ar fi lignani, triterpenoizi, flavonoide, acizi fenolici, steroizi și aminoacizi, care au valoare nutrițională și medicinală ridicată [3,35]. În acest studiu, au fost extrase diferite părți ale KC. În special, conținutul total de polifenoli și flavonoide din frunzele și rădăcinile KC a fost mult mai mare decât cel al tulpinilor și fructelor. Frunzele și rădăcinile conțin de două ori mai mulți polifenoli și flavonoide decât tulpinile și fructele. Ca urmare, considerăm că polifenolii și flavonoidele totale au o contribuție semnificativă la efectele fotoprotectoare și anti-melanogenice ale KC.

Fototoxicitatea cutanată cauzată de radiațiile UV se datorează în primul rând citotoxicității celulare, acumulării intracelulare de ROS și apoptozei în keratinocite. Prin urmare, este mai rezonabil să ne concentrăm asupra inhibării citotoxicității celulare, acumulării intracelulare de ROS și apoptozei în keratinocitele iradiate cu UVA și UVB [36,37]. După cum este descris în acest studiu [10,38], rezultatele intervenției cu extracte de KC asupra foto-citotoxicității (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) au arătat că extractele de KC au redus semnificativ citotoxicitatea celulară, acumularea intracelulară de ROS și apoptoza. În concordanță cu rezultatele anterioare, efectele fotoprotectoare ale frunzelor și rădăcinilor KC au fost mult mai mari decât cele ale tulpinii și fructelor. În plus, rezultatele noastre au indicat că extractele de KC prezintă efectele menționate mai sus prin promovarea activității antioxidante. Melanogeneza este adesea observată după iradierea UV și este asociată în primul rând cu pigmentarea sau hiperpigmentarea [39]. Conform studiilor anterioare, metoda de inducere a melanogenezei folosind -MSH a fost recunoscută și aplicată pe scară largă. Prin urmare, acest studiu sa bazat pe construcția unui model de melanocite stimulat cu -MSH [24,39]. Am descoperit că extractele de KC au suprimat conținutul intracelular de melanină și activitatea tirozinazei stimulate de MSH. În plus, extractele de KC au redus transcripția și translația markerilor de melanogeneză, cum ar fi tirozinaza, TRP-1 și TRP-2 în melanocitele stimulate de -MSH. În plus, am investigat expresia proteinei MITF și fosforilarea CREB în melanocitele stimulate de -MSH. În mod similar, în acest studiu, am constatat că extractele KC au suprimat expresia proteinei MITF mediată de MSH și fosforilarea CREB în melanocite. În concordanță cu rezultatele fotoprotectoare, efectele anti-melanogenice ale frunzelor și rădăcinilor KC au fost mult mai mari decât cele ale tulpinilor și fructelor.

felii de cistanche

Pentru mai multe informații, vă rugăm să faceți clic aici.

5. Concluzii

În general, potențialele efecte fotoprotectoare și anti-melanogenice ale extractului KC au fost găsite în acest studiu. Extractul KC cu conținut ridicat de polifenoli și flavonoide poate exercita efecte foto-protectoare și anti-melanogenice asupra keratinocitelor și melanocitelor. Acest studiu oferă o rațiune și o strategie de cercetare pentru intervențiile cosmetice și farmaceutice pentru albirea naturală și agenți fotoprotectori.