Leziuni ale podocitelor prin interacțiunea dintre Tlr8 și ligandul său endogen MiR-21 în rinichiul obstrucționat și colateral

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche disfuncție erectilă legate de rinichi

În timp ce boala cronică de rinichi este răspândită la adulți, nefropatia obstructivă (ON) a fost raportată atât la pacienții tineri, cât și la cei bătrâni. În ON, leziunile tubulointerstițiale (TIL) au fost investigate pe scară largă, dar leziunile glomerulare (GL) au fost în mare măsură neglijate. Aici, prezentăm un mecanism nou care stă la baza dezvoltării GL în ON la șoareci tineri și bătrâni. TIL-urile se dezvoltă mai devreme decât GL din cauza infiltrării celulelor inflamatorii în tubulointerstițiu, dar GL se dezvoltă în urma activării receptorului Toll-like 8 (Tlr8) chiar dacă absența celulelor inflamatorii care infiltrează glomerulul. Proteinele TLR8 și interleukina 1 beta (IL1b) se colocaliză cu markeri reducători ai funcției podocitelor (PFM), indicând activarea semnalizării TLR8 în podocitele lezate. În plus, nivelurile glomerulare și serice ale miR-21, un ligand endogen pentru Tlr8, au fost mai mari în modelul de șoarece ON decât în ​​controlul simulat. Expresia glomerulară a Tlr8 se corelează pozitiv cu miR-21 și citokinele din aval Il1b și Il6 și corelată negativ cu PFM (Nphs1 și Synpo). De asemenea, arătăm colocalizarea proteinelor TLR8 și IL1b cu reducerea PFM-urilor atât în ​​​​obstrucții, cât și încolateralrinichide şoareci tineri şi bătrâni. În plus, rezultatele studiului in vitro au evidențiat o expresie mai mare a Tlr8 și a citokinelor sale din aval în glomeruli din obstrucție.rinichidupă tratamentul cu miR- 21 mimic decât în ​​martor. În concluzie, supraexprimarea Tlr8 poate servi ca un mecanism plauzibil care stă la baza dezvoltării GL în ON prin lezarea podocitelor.

Cuvinte cheie: boală cronică de rinichi,nefropatie obstructivă, podocite, TLR8, rinichi obstrucționat și colateral

INTRODUCERE

Boala cronică de rinichi (CKD), o problemă majoră de sănătate publică, este răspândită la 8 la sută – 13 la sută din populația generală (1). Este frecventă la persoanele în vârstă din cauza îmbătrânirii societății. Nefropatia obstructivă (ON) prezintă un mare interes pentru clinicieni, deoarece a fost raportată la pacienți din diferite grupe de vârstă. ON este tratabil și reversibil, spre deosebire de alte BRC (2, 3). La copii, apare la unul dintre cei 1500 indivizi tineri, iar prevalența sa este de 1% –5% în țările dezvoltate (4, 5). La adulți, prevalența ON variază de la 5 la 1000 la 5 la 10000 de persoane. În plus, prevalența ON cronică unilaterală este de aproximativ 0,5%, în timp ce cea a ON acută unilaterală și cronică bilaterală este de aproximativ 0,1% (4-7).

ON poate duce la leziuni renale acute sau CKD, care implică o scădere progresivă a funcției renale și modificări ale structurilor renale cu o durată mai mare de 3 luni (8, 9). Obstrucția ureterală unilaterală (UUO) este o strategie utilizată pe scară largă pentru a studia ON cronică. ON într-un rinichi UUO se caracterizează prin hipertrofie, hidronefroză, recrutarea celulelor inflamatorii în zona interstițială, moartea celulelor tubulare din hipoxie și depunerea de colagen în tubulointerstitium, urmată de dezvoltarea fibrozei tubulointerstițiale (TF) (10).

TF este o caracteristică importantă a bolii renale în stadiu terminal și un determinant major al leziunii renale progresive (11). TF a fost investigat pe larg în modelele ON, dar datele privind leziunile glomerulare, în special anomaliile barierei sânge-urină (BUB), sunt rare (8, 9, 12). Mai mult, studiile au investigat leziunile tubulointerstițiale (TIL) în rinichiul colateral în ON unilateral, dar leziunile glomerulare (GL) au fost în mare măsură neglijate (12). Mai multe rapoarte au relevat implicarea capilarelor peritubulare în progresia TIL-urilor în ON experimental (13, 14). Cu toate acestea, glomerulul și capilarul glomerular se scurg în segmentele tubulare ale nefronului și, respectiv, capilarelor peritubulare. Prin urmare, sugerăm că glomerulonefrita poate afecta și tubulointerstitiul. Studiile noastre anterioare au evidențiat contribuția leziunii celulelor intrinseci glomerulare, în principal podocitelor, la GL și dezvoltarea ulterioară a TIL într-un model de șoarece cu boală autoimună din cauza supraexprimării diferiților receptori Toll-like (TLR) (15-18).

Endoteliul capilar glomerular și podocitele sunt gardieni importanți care cuprind BUB. Între aceste două epitelii, podocitele sunt expuse continuu la semnale de pericol, inclusiv liganzii TLR, cum ar fi modelele moleculare asociate pericolului (DAMP) sau modelele moleculare asociate patogenului (PAMP), datorită localizării lor unice în glomeruli (15). Prin urmare, se crede că interacțiunea dintre TLR din podocite și liganzii lor endogeni contribuie la lezarea podocitelor în condiții neinfecțioase. În studiul de față, ne-am concentrat asupra dezvoltării GL atât în ​​rinichii obstrucționați, cât și în cei colaterali ai șoarecilor tineri și bătrâni, deoarece ON se găsește frecvent atât la oamenii tineri, cât și la cei mai în vârstă. Am clarificat că GL a fost dezvoltat în ON din cauza rănirii podocitelor prin supraexpresia Tlr8 în podocite din rinichii obstrucți și colaterali ai șoarecilor tineri și bătrâni.

MATERIALE ȘI METODE

Declarație etică și adăpostire experimentală a animalelor Toate experimentele care au folosit animale de laborator au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Facultății de Medicină Veterinară, Universitatea Hokkaido (nr. de aprobare 16- 0124). Autorii au urmat ghidul aprobat pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator al Universității Hokkaido, Facultatea de Medicină Veterinară (aprobat de Asociația pentru Evaluarea și Acreditarea Laboratorului Animal Care International). Șoarecii C57BL/6N în vârstă de șase săptămâni au fost achiziționați de la Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japonia) și menținuți în condiții specifice fără patogeni într-un mediu de lumină-întuneric 1:1. Animalelor experimentale li sa oferit hrană și apă potabilă ad libitum.

Design experimental Am folosit atât șoareci tineri (9 săptămâni), cât și bătrâni (12 luni). Șoarecii din fiecare grupă de vârstă (n=4) au fost supuși fie unei operații simulate (grupul de control) fie UUO (2, 7, 11 și 21 de zile) pentru a stabili un rinichi model ON, așa cum este descris în studiul nostru anterior (13).

Pregătirea probei Șoarecii au fost anesteziați profund cu un amestec de agenți anestezici așa cum s-a descris anterior (16) și eutanasiați prin luxație cervicală. Au fost colectate probe de sânge prin artera femurală pentru analiza markerului seric. Atât UUO, cât și rinichii colaterali au fost colectați și tăiați în felii subțiri. Feliile de rinichi au fost fixate cu 10% formalină tampon neutră (NBF), 4% paraformaldehidă (PFA) și 2,5% glutaraldehidă (GTA) pentru studii histopatologice, imunohistochimice și, respectiv, microscopie electronică.

Imunohistochimie și imunoffluorescență Blocurile de parafină fixate cu NBF au fost tăiate la 2 mm grosime și colorate cu acid periodic Schiff-hematoxilină (PAS-H) pentru a examina histopatologia renală. Imunodetecția markerilor celulari a fost efectuată așa cum sa raportat anterior (16) pentru celulele B (B220), celulele T (CD3), endoteliul capilar (CD31), IL1b, macrofage (Iba1), podocite (podocină și sinaptopodină) și TLR8. Condițiile de colorare sunt enumerate în tabelul 1.

Histoplanimetria PAS-H și secțiunile de rinichi imunocolorate au fost convertite în lame virtuale folosind Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japonia). Celulele pozitive au fost numărate din 20 de glomeruli sau 20 de focare selectate aleatoriu din tubulointerstitium la o mărire de 400x utilizând software-ul NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Imaginile a 20 de glomeruli din secțiuni colorate cu PAS-H au fost, de asemenea, capturate la 400x de la fiecare șoarece folosind un microscop cu fluorescență All-in-One BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japonia). Zona și dimensiunea mezangială glomerulară au fost măsurate din imaginile capturate folosind un analizor BZ-X (Keyence).

Izolarea glomerulului pentru extracția ARN și cultura Glomerulii din rinichi operați simulat și UUO au fost izolați așa cum s-a descris anterior (16). Pe scurt, șoarecii au fost profund anesteziați și perfuzați prin ventriculul stâng cu 40 ml de soluție echilibrată de sare Hank (HBSS) care conține Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA). Rinichiul a fost excizat

și tăiate în bucăți mici. Celulele au fost apoi digerate cu colagenază A (1 mg/mL; Roche, Basel, Elveția) și dezoxiribonuclează I (100 U/ml; Life Technologies) în HBSS la 37 de grade timp de 30 de minute. Suspensia care conține țesut digerat a fost presată ușor printr-o sită celulară de 100-mm (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, SUA) folosind un pistil turtit. Suspensia de celule rezultată a fost centrifugată la 200 xg timp de 5 minute, iar peletul celular a fost resuspendat în 2 ml de HBSS. Glomerulii care conțin Dynabeads au fost colectați folosind un concentrator de particule magnetice (Life Technologies) și folosiți pentru izolarea ARN-ului.

Transcriere inversă și PCR în timp realARN-ul total a fost izolat din glomeruli folosind un kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). ADNc a fost sintetizat din ARN total prin transcripție inversă utilizând enzima de transcriptază inversă ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japonia) și primeri dT aleatoriu (Promega). ADNc a fost utilizat în PCR în timp real cu amestecul principal Brilliant III SYBR Green QPCR și Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, SUA). Expresia genei glomerulare a fost normalizată la expresia Actb. Perechile de primeri utilizate sunt prezentate în Tabelul 2.

Transcriere inversă și PCR în timp real bazată pe TaqManARN total, inclusiv microARN (miARN) în glomeruli izolați, a fost izolat folosind un kit miRNeasy (Qiagen). Primerii RT stem-loop specifici miARN, transcriptaza inversă, tampon de transcripție inversă, dNTP și inhibitorul de RNază au fost utilizați pentru a transcrie invers ARN total conform instrucțiunilor producătorului (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). PCR în timp real a fost efectuată cu ADNc rezultat folosind primeri TaqMan specifici miR-21- și sonde specifice (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) și Mx3000P (Agilent Technologies).

Tratamentul in vitro al glomerulilor izolați cu mimiceGlomerulii au fost izolați din operați simulat și UUOrinichidupă 11 zile de obstrucție. Mediul Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) (Fujifilm Wako, Japonia) care conține 300 de glomeruli a fost distribuit în fiecare godeu al unei 96-plăci de cultură pentru godeuri (TPP, Trasadingen, Elveția) și tratat cu PBS, control negativ și miR-21 (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Coreea de Sud) la 1 pmol/µL timp de 4 ore la 37 de grade în 5 procente de CO2. Expresia Tlr8 și a citokinelor sale din aval a fost măsurată așa cum este descris în secțiunea anterioară.

Microscopie prin scanare electronicaPentru microscopia electronică cu scanare de rutină (SEM), micrinichi feliiau fost fixate cu 2,5% GTA timp de 4 ore și post-fixate cu 1% tetroxid de osmiu timp de 1 oră, urmate de tratament cu 1% acid tanic timp de 1 oră. Probele au fost apoi fixate cu 1% tetroxid de osmiu timp de 1 oră și tratate cu 0,5% și 1% acid tanic timp de 10 minute și, respectiv, 1 oră.Rinichifeliiau fost deshidratate cu gradele crescătoare de alcool, transferate în 3-acetat de metil butii și, în final, uscate cu un uscător cu punct critic HCP-2 (Hitachi, Tokyo, Japonia). Specimenele au fost supuse pulverizării ionice și apoi examinate la un microscop electronic cu scanare S-4100 la o tensiune accelerată de 12 kV.

Analize statisticeValorile sunt exprimate ca medie ± eroare standard (se). Rezultatele au fost analizate statistic folosind un test U Mann-Whitney neparametric (P <0.05). testul="" kruskal-wallis="" a="" fost="" folosit="" pentru="" a="" compara="" trei="" sau="" mai="" multe="" populații="" și="" s-au="" efectuat="" comparații="" multiple="" folosind="" metoda="" scheffe="" odată="" ce="" au="" fost="" observate="" diferențe="" semnificative="" (p="">< 0.05).="" corelația="" dintre="" cei="" doi="" parametri="" a="" fost="" analizată="" utilizând="" testul="" coeficientului="" de="" corelare="" a="" rangului="" lui="" spearman="" (p=""><>

REZULTATE

TIL și GL în rinichii obstrucționați ai șoarecilor tineriAm examinat mai întâi TIL-urile și GL-urile în rinichii operați simulat și UUO ai șoarecilor tineri supuși obstrucției pentru diferite perioade de timp. În timp ce rinichii operați de simulare au prezentat tubulointerstițiu normal (Figura 1A), rinichii obstrucționați după 2 zile de UUO au prezentat TIL și s-au caracterizat prin dilatarea tubilor; unii tubuli conţineau şi gipsuri urinare. Astfel de leziuni au crescut odată cu avansarea obstrucției (Figura 1A). GL, în principal glomeruloscleroza, au fost observate în stadiul târziu la 21 de zile după UUO și s-au caracterizat prin depunerea de materiale pozitive pentru acidul periodic Schiff (PAS). Structura glomerulară a fost normală atât în ​​rinichii simulați, cât și în UUO timpurii (2, 7 și 11 zile) (Figura 1B). Numărul de celule glomerulare a avut tendința de a crește până în ziua-11 după obstrucție și a avut tendința de a scădea în ziua-21 în rinichii UUO (Figura 1C). Acumularea mezangială glomerulară a avut tendința de a crește de la 7 zile după obstrucție (Figura 1D).

a fost absent în centrul glomerulilor rinichilor UUO la 21 de zile după obstrucție (Figura 1F). Reacția în lanț a polimerazei a evidențiat o scădere semnificativă a PFM (Nphs1 și Synpo) în rinichii UUO la 21 de zile după obstrucție (Figura 1G). Mai mult, analiza SEM a evidențiat procese normale ale piciorului podocitelor (PFP) în rinichii operați de simulare; cu toate acestea, ștergerea PFP și structuri asemănătoare microviloase au fost raportate în rinichii UUO la 21 de zile după obstrucție (Figura 1H). Împreună, aceste rezultate sugerează apariția leziunii podocitelor în rinichiul obstrucționat la 21 de zile după obstrucție.

Celulele imune infifiltrante sunt absente în rinichiul obstrucționat. Am arătat anterior că leziunea podocitelor se corelează cu celulele imune infifiltrante din glomerul (13, 16, 18). Prin urmare, am examinat infifiltrarea celulelor B și T, precum și a macrofagelor în TIL-uri și GL-uri ale rinichilor operați de simulare și UUO (Figura 2). Numeroase celule B, T și macrofage infifiltrante au fost observate în TIL-urile rinichilor UUO în toate zilele după obstrucție, dar acestea au fost aproape absente sau puține în glomerulii rinichilor simulați și ai rinichilor UUO (Figurile 2A-E). Numărul de celule B, T și macrofage a fost foarte puțin în glomerul (datele nu sunt prezentate), dar semnificativ mai mare în

tubulointerstitiul rinichilor 2-, 7-, 11- și 21-zi în comparație cu cel al rinichiului simulat (Figura 2F). Prin urmare, infiltrarea celulelor imune poate contribui la dezvoltarea TIL-urilor în rinichiul obstrucționat. Cu toate acestea, alți factori pot fi legați de dezvoltarea GL.

Exprimarea diferiților membri ai familiei TLR și a citokinelor din aval în rinichii operați prin simulare și obstrucționați ai șoarecilor tineri Studiile anterioare au evidențiat o expresie mai mare a diferitelor TLR în podocitele rinichilor bolnavi (15, 16, 19, 20). Interesant, datele noastre au relevat o expresie semnificativ mai mare a Tlr8 și Tlr9 în glomerulii izolați din grupul de zile UUO 21- decât în ​​glomerulii grupului simulat (Figura 3A). În plus, am examinat expresia citokinelor din aval ale membrilor familiei TLR în glomeruli din grupurile de zi simulate și UUO 21-și am găsit o reglare semnificativă în sensul exprimării genelor care codifică atât interleukina 1 beta (Il1b) cât și interleukina 6. (Il6) în grupul UUO în comparație cu cel din grupul simulat (Figura 3B).

TLR8 co-localizat cu PFM Deoarece expresia Tlr8 și Tlr9 a fost ridicată în glomeruli izolați din rinichiul obstrucționat, am examinat localizarea acestora prin colorare prin imunofluorescență. Proteina TLR8 nu a fost detectată în rinichii operați de simulare (Figura 4A), dar a fost colocalizată cu sinaptopodina PFM în rinichiul UUO (Figura 4B). În plus, nu am reușit să detectăm expresia proteinei TLR9 în rinichi, fie de la șoareci operați în mod simulat, fie de la șoareci UUO (datele nu sunt prezentate).

Producția IL1b din podocite în rinichiul obstrucționat al șoarecilor tineri Așa cum se arată în Figura 3B, expresia Il1b glomerulară (o citokină în aval a familiei TLR) a fost semnificativ mai mare în rinichiul UUO la 21 de zile decât în ​​rinichiul simulat. Prin urmare, am examinat sursa IL1b în glomerulii rinichilor UUO prin colorare prin imunofluorescență. Expresia proteinei IL1b nu a fost detectată în glomerulii rinichilor simulați, dar a fost observată în glomerulii rinichilor UUO (Figurile 4C, D). În plus, IL1b s-a colocalizat cu podocină PFM (Figura 4D).

în UUOrinichila 21 de zile decât asta în simulacrorinichi.Prin urmare, am examinat sursa IL1b în glomerulii rinichilor UUO prin colorare prin imunofluorescență. Expresia proteinei IL1b nu a fost detectată în glomerulii de simularerinichidar a fost observată în glomerulii UUOrinichi(Figurile 4C, D). În plus, IL1b s-a colocalizat cu podocină PFM (Figura 4D).

Nivel crescut al ligandului Tlr8 endogen presupus la șoarecii model ON Un studiu anterior a arătat că miR-21 servește ca ligand pentru TLR8 (21). Prin urmare, am comparat atât nivelurile glomerulare, cât și cele serice ale miR-21 între grupurile de zile simulate și UUO 21-. Interesant este că grupul UUO 21-zi a arătat niveluri semnificativ mai mari de miR-21 glomerulară decât cel din grupul simulat (P <0.05), cu="" toate="" acestea,="" o="" tendință="" de="" creștere="" a="" mir{{="" serice.="" {10}}="" a="" fost="" observat="" în="" primul="" grup="" decât="" în="" ​​cel="" din="" urmă="" (p="0.06)" (figura="">

Corelația expresiei Tlr8 cu ligandul său miR-21 și PFM-urile în obstrucțiaRinichiDupă cum se arată în Tabelul 3, am observat o corelație pozitivă semnificativă între expresia glomerulară a ARNm Tlr8 și ligandul său endogen (miR-21), precum și citokinele din aval Il1b și Il6. Pe de altă parte, a fost evidentă o corelație negativă între ARNm Tlr8 și PFM-urile Nphs1 și Synpo.

Stimularea in vitro a glomerulilor cu miR{{0}} Mimic activează expresia Tlr8 și a citokinelor sale din aval Expresia Tlr8 a avut tendința de a crește (P=0.06) dar citokinele sale din aval (Ifng și Il1b) au fost semnificativ crescute (P < 0,05 și 0,01) în glomerulii șoarecilor simulați după

tratamentul cu miR -21 mimic în comparație cu cel din glomerulii șoarecilor tratați cu PBS și mimic de control negativ (Figura 5A). Cu toate acestea, nu a fost observată nicio corelație semnificativă între expresia lui Tlr8 și citokinele sale din aval în glomerulii șoarecilor simulați după tratamentul cu imitatori (Tabelul 4). Expresia Tlr8 și a citokinelor sale din aval a fost semnificativ mai mare în glomerulii UUOrinichi, în urma tratamentului cu miR-21 mimic decât cei din glomerulii UUOrinichitratat cu PBS și mimic de control negativ (Figura 5B). A fost detectată o corelație semnificativă între expresia Tlr8 și citokinele sale din aval în glomerulii rinichilor UUO în urma tratamentului cu mimice, ceea ce indică activarea mai mare a căii factorului nuclear kappa B (NF-kB) mediat de Tlr8- și secreția de citokine proinflamatorii în rinichiul obstrucționat (Tabelul 4).

Localizarea TLR8 și lezarea podocitelor în rinichii colaterali ai șoarecilor tineriRinichii operați simulat au prezentat glomerul normal, în timp ce rinichii colaterali prezentau hipertrofie glomerulară, număr crescut de celule glomerulare și dilatarea capilarelor glomerulare (Figura 6A). Glomerulii de la rinichi operați simulat au fost pozitivi pentru expresia sinaptopodinei și nu au avut expresia TLR8 (Figura 6B). Pe de altă parte, rinichii colaterali au pierdut expresia sinaptopodinei în centrul glomerulilor, dar au arătat expresia TLR8 de-a lungul ratei glomerulare (Figura 6C). Mai mult, proteina TLR8 a fost co-localizată cu sinaptopodina (Figura 6C). Rinichii operați simulat au prezentat expresie normală a podocinei, dar nicio expresie a IL1b în glomeruli (Figura 6D). Cu toate acestea, glomerulii din rinichiul colateral și-au pierdut expresia podocinei în centru, dar au avut expresie IL1b de-a lungul ratei glomerulare (Figura 6E). În plus, proteina IL1b a fost colocalizată cu podocină (Figura 6E). Analiza SEM a dezvăluit PFP-uri normale în rinichii de șoarece operați de simulare, dar ștergerea PFP și structurile asemănătoare microviloase au fost vizibile în rinichii colaterali (Figura 6F).

Localizarea TLR8 și lezarea podocitelor în rinichii obstrucționați și colaterali ai șoarecilor în vârstăRinichii operați de simulare au arătat o expresie normală a sinaptopodinei, dar nu au evidențiat nicio colorare pentru proteina TLR8 în glomeruli lor (Figura 7A). Interesant, atât rinichii colaterali, cât și rinichii UUO au prezentat pierderea expresiei sinaptopodinei în centrul glomerulilor, dar au menținut expresia TLR8 de-a lungul retelei glomerulare (Figurile 7B, C). Proteina TLR8 a fost colocalizată cu sinaptopodina în rinichii colaterali și UUO (Figurile 7B, C). Rinichii operați simulat au prezentat în mod similar expresie normală a podocinei, dar nu au avut expresie IL1b în glomeruli lor (Figura 7D). Pe de altă parte, atât rinichii colaterali, cât și rinichii UUO au pierdut expresia podocinei în centrul glomerulilor, dar au arătat expresia IL1b de-a lungul retelei glomerulare (Figurile 7E, F). S-a constatat că colorarea pozitivă este colocalizată cu podocină în glomerulii rinichilor colaterali și UUO (Figurile 7E, F). Examinarea SEM a evidențiat PFP-uri normale în rinichii de șoarece operați de simulare, ștergerea PFP și structuri asemănătoare microviloase atât în ​​rinichii colaterali, cât și în rinichii UUO ai șoarecilor bătrâni (Figura 7G).

DISCUŢIEPE

prevalența este frecventă la sugari, precum și la persoanele în vârstă (4–7). Prin urmare, am supus șoareci tineri și bătrâni la UUO pentru a imita starea ON a indivizilor de diferite grupe de vârstă și am examinat TIL și GL. În rinichiul obstrucționat, progresia TIL a fost evidentă într-un stadiu mai precoce al obstrucției (2 zile); cu toate acestea, progresia GL-urilor împreună cu leziunea podocitelor a fost observată într-o etapă ulterioară. Rinichiul colateral a arătat GL și leziuni podocite în același timp. Această observație indică faptul că leziunea podocitelor apare atât în ​​rinichii obstruați, cât și în cei colaterali, deși insulta inițială poate varia. Studiile noastre anterioare au evidențiat corelația dintre leziunea podocitelor și infiltrarea celulelor imune în glomerul (13, 16, 18). Cu toate acestea, infiltrarea celulelor imune în glomeruli fie a rinichilor simulați, fie a rinichilor obstrucționați nu a fost observată în studiul de față. Prin urmare, am luat în considerare implicarea altor factori în leziunea podocitelor din rinichiul obstrucționat. Am emis ipoteza că semnalele de pericol (DAMP-uri sau PAMP-uri), fie de origine circulatorie, fie care provin din epiteliul tubular deteriorat, pot contribui la lezarea podocitelor în ON, datorită locației sale unice în glomerul. Foarte important, s-a demonstrat că interacțiunea dintre DAMP și TLR joacă un rol important în patogeneza bolilor neinfecțioase (15). Diferiți membri ai familiei TLR sunt exprimați pe membrana plasmatică celulară sau veziculele intracelulare (22) și sunt caracterizați ca senzori imuni înnăscuți care recunosc eficient DAMP-urile sau PAMP-urile. La activarea prin DAMP-uri sau PAMP-uri corespunzătoare, TLR-urile au îmbunătățit expresia citokinelor din aval prin calea NF-kB și au indus sistemul de apărare al gazdei (22). Mai mult, DAMP-urile transmit prezența leziunilor tisulare la celulele imune sau la celulele intrinseci locale și, în consecință, agravează leziunile tisulare (23-26). Important este că toate TLR-urile activează calea NF-kB care controlează expresia unei serii de gene de citokine inflamatorii (27). În plus, activarea TLR-urilor semnalează căile lor din aval pentru a activa NF-kB, care este responsabil pentru inflamație și este legat de patogeneza țesuturilor deteriorate (28). Shichita et al. au evidențiat interacțiunile patologice dintre liganzii endogeni și TLR2 sau TLR4, care contribuie la leziunea cerebrală ischemică (25). Studiile anterioare au demonstrat, de asemenea, capacitatea membrilor familiei TLR de a induce TIL în rinichi (TLR2, 4, 5, 7 și 11) și GL (TLR1-6, 8 și 9) (17, 29-33). ). În studiul de față, am găsit leziuni podocite în rinichii obstrucți și colaterali și am clarificat

rolurile diferiților membri ai familiei TLR care pot contribui la lezarea podocitelor (15, 16, 19, 20). După cum am emis ipoteza, expresia glomerulară a Tlr8 și Tlr9 a fost mai mare la glomerulii izolați din rinichiul UUO decât la cei de la șoarecii operați simulat. Mai mult, expresia glomerulară a citokinelor inflamatorii legate de calea NF-kB, inclusiv Il1b și Il6, a fost mai mare în rinichiul UUO la 21 de zile după obstrucție. Prin urmare, am ajuns la concluzia că calea NF-kB mediată de TLR joacă un rol important în patogeneza GL în rinichiul obstructiv. Spre deosebire de alți membri ai familiei TLR, TLR8 și TLR9 sunt detectați în endozomii celulelor. TLR8 recunoaște ARN monocatenar și ARN dublu catenar scurt de la microorganisme și activează producerea mai multor citokine mediate de NF-kB (22). Pe de altă parte, TLR9 recunoaște ADN-urile dublu catenar și activează calea NF-kB pentru a produce citokine în aval (16, 34). În acest studiu, am recunoscut doar colocalizarea proteinei TLR8 împreună cu sinaptopodina PFM în glomeruli. Studiile noastre anterioare au arătat, de asemenea, că atât TLR8, cât și TLR9 se colocalizează cu PFM-uri și activează producția de citokine inflamatorii mediată de NF-kB pentru a induce leziuni podocite (15, 16). Mai mult, alte studii au arătat corelația patologică dintre căile mediate de TLR și leziunea podocitelor in vitro (34, 35). Banas et al. a relevat interacțiunea TLR4 în podocite cu sistemul imunitar în timpul dezvoltării GL (35). Astfel, podocitele pot contribui la supravegherea imună prin căi mediate de TLR. În acest studiu, am arătat atât expresia genei TLR8, cât și localizarea proteinei în podocitele rinichiului obstrucționat, precum și expresia mai mare a citokinelor din aval în glomerul. Prin urmare, concluzionăm că căile mediate de TLR8-contribuie la dezvoltarea GL prin leziuni ale podocitelor din rinichiul obstrucționat.

Un studiu anterior a arătat că miR-21, un ligand endogen al TLR8, poate ajunge și se leagă de TLR8 în endozomii celulari, în care poate induce activarea mediată de TLR8-a căii NFkB și secreția de citokine proinflamatorii. (21). În studiul de față, am găsit niveluri semnificativ mai mari de miR glomerular-21, precum și niveluri crescute de miR-21 seric în rinichiul UUO decât cele din martorii simulați și am demonstrat corelarea acesteia cu expresia glomerulară a Tlr8. . Interesant, glomerulii din rinichii UUO tratați cu miR-21 au arătat o expresie mai mare a Tlr8 și a citokinelor sale din aval în comparație cu cei din glomerulii de la șoareci simulați tratați cu miR-21, indicând o disponibilitate crescută a miR endogen. -21 din țesuturile deteriorate din rinichiul obstrucționat și activarea supraexpresiei Tlr8 în rinichii UUO se compară cu cea a unui simulator. Împreună, concluzionăm că un volum mai mare de miR-21 în rinichiul obstrucționat ajunge la endozomi din podocite și induce activarea mediată de Tlr8-a căii NF-kB și secreția de citokine proinflamatorii. Aceste citokine, la rândul lor, participă la dezvoltarea GL prin lezarea podocitelor.

IL1b este una dintre citokinele importante din aval ale căii NF-kB, produsă în principal de podocite din glomerul în condiții de boală. Studiile anterioare au arătat că IL1b induce leziuni podoccite ​​prin reducerea PFMs (36, 37). În studiul de față, am arătat o expresie glomerulară mai mare a Il1b și colocalizarea acesteia cu PFM, care a arătat o expresie redusă. Mai mult, expresia glomerulară a Il1b s-a corelat cu Tlr8 și a avut tendința de a se corela cu expresia PFM-urilor (Nphs1 și Synpo). Prin urmare, aceste rezultate indică faptul că factorii în aval de Tlr8, inclusiv Il1b și Il6, pot provoca leziuni ale podocitelor în rinichiul obstrucționat prin reducerea expresiei PFM.

Rinichii colaterali ai șoarecilor tineri au prezentat, de asemenea, GL și pierderea PFM. Acest rezultat a fost confirmat de SEM, care a evidențiat leziuni podocice în rinichiul colateral. De asemenea, am găsit niveluri mai ridicate de miR seric-21 în modelul de mouse ON. În plus, proteina IL1b s-a co-localizat cu PFM. Aceste rezultate indică faptul că miR-21 seric interacționează cu TLR8 în podocitele rinichiului colateral și activează producția de citokine în aval, care, la rândul său, reduce funcția podocitelor și leziunile podocitelor. Leziunea podocitelor a fost observată și în rinichii obstrucționați și colaterali ai șoarecilor bătrâni printr-un mecanism similar cu cel observat la șoarecii tineri.

În concluzie (Figura 8), expresia glomerulară miR-21 este crescută în urma obstrucției ureterale unilaterale, în care interacționează cu TLR8 în podocite și induce producerea de citokine în aval (Il1b și Il6) sugerând activarea căii NF-kB. Niveluri mai ridicate de citokine reduc PFM, ducând la leziuni ale podocitelor și dezvoltarea ulterioară a GL. Niveluri crescute de miR-21 seric activează TLR8 în podocitele rinichiului colateral și induc GL prin lezarea podocitelor. Prin urmare, acest studiu arată în mod clar dezvoltarea GL în rinichii obstrucționați și colaterali prin leziuni podocite după supraexprimarea Tlr8.