roLimba
Acasă / Cunoştinţe / Conţinut

Cunoştinţe

Extractul placentar porcin mărește nivelurile de NAD celular în cheratinocitele epidermice umane Ⅱ

Jun 25, 2023

Discuţie

Multe studii au arătat căscăderea NADdin cauza îmbătrânirii este corelată cudeclinul funcțional al țesuturilorsidezvoltarea bolilor legate de vârstă și a cancerului11,22. În epidermă, iradierea UV, cel mai important factor extrinsec al îmbătrânirii pielii, cauzează epuizarea NAD, precum șiîmbătrânirea cronologică23. Deoarece pielea este expusă în mod constant la iradierea UV în viața de zi cu zi, aplicarea locală a agenților de stimulare a NAD pare a fi o abordare rezonabilă pentru prevenirea reducerii NAD și pentru protejarea pielii de deteriorarea UV. Într-adevăr, s-a demonstrat că creșterea NAD în piele previne cancerul de piele indus de UV și imunosupresia la șoareci24. Jacobson şi colab. au raportat că derivații topici de acid nicotinic au crescut conținutul de NAD al pielii și au îmbunătățit funcția de barieră25.

KSL12

Faceți clic aici pentru a obține Cistanche - Cele mai bune plante anti-îmbătrânire

Buy Cistanche

În plus, mai multe studii clinice au arătat că aplicarea locală a precursorului NAD NAM reducesemne de îmbătrânire a pielii26,27. Aceste date in vivo și clinice susțin posibilitatea ca nivelurile crescute de NAD să previnădeteriorarea pielii și întârzierea îmbătrânirii. De asemenea, am raportat anterior că menținerea nivelurilor adecvate de NAD este esențială pentru protecția celulelor epidermice umane de stresul UV21. În acest studiu, am demonstrat că PPE mărește nivelurile intracelulare de NAD în keratinocite. De asemenea, am constatat că ingredientele sale active au LMW de mai puțin de 3 kDa, ceea ce este eficient atât pentru modelele de cultură a epidermei monostrat, cât și 3-dimensionale. Aceste descoperiri sugerează că ingredientele active ale PPE ar putea fi absorbite transdermic și, prin urmare, evidențiază potențiala aplicare ca agent topic pentru creșterea nivelurilor de NAD la nivelul pielii.

cistanche anti-aging herbs

Figura 3. Fracția activă a LMW-PPE conține mai mulți precursori NAD. (A) LMW-PPE (1 mg) a fost separat și monitorizat la lungimi de undă multiplă (200-600 nm) folosind HPLC. (B) Eluanții au fost colectațipe 2 min și testat pentru activitatea de recuperare a NAD în fiecare fracție. (C) Fracția 3 a fost analizată folosind LC–MS/DOMNIȘOARĂ. Toți compușii au fost detectați în modul ion pozitiv.


image


Tabelul 1. Conținutul de precursori NAD al EIP.

În piele, deficitul de NAD scade funcția principalelor căi metabolice energetice, cum ar fi glicoliza și fosforilarea oxidativă. Glicoliza este indispensabilă pentru menținerea unui echilibru între proliferarea și diferențierea keratinocitelor28. Expunerea la UV scade nivelurile de NAD și, prin urmare, poate accelera acest dezechilibru. S-a observat că raportul dintre diferențiere și proliferare a crescut profund în pielea expusă la soare, comparativ cu pielea protejată de soare29. Tan şi colab. a constatat că tratamentul cu FK866 a accelerat diferențierea și a scăzut activitatea metabolică în NHEK și că NAM a inversat aceste evenimente induse de FK{866-restabilind nivelurile NAD celulare28.

cistanche anti-aging herbs


Figura 4. EIP topic prezintă activitate de recuperare a NAD, dar nu afectează activitatea metabolică a celulei, în RHE. (A) Ilustrare schematică a modelului RHE. (B) PPE (2 mg/mL) a fost aplicat pe partea stratului cornos al RHE și incubat timp de 48 de ore în prezența sau absența FK866 (5 nM). Nivelurile totale de NAD ale țesuturilor au fost determinate folosind un kit de testare NAD plus/NADH. (C) PPE (0, 1, 2 sau 10 mg/mL) sau 1% TX-100 (ca martor pozitiv) a fost aplicat pe partea stratului cornos al RHE și incubat timp de 48 de ore . Activitatea metabolică a celulei a fost determinată prin test MTT. **p<0.01, the comparison to the control.

În studiul de față, am constatat că PPE a restabilit epuizarea NAD indusă de FK866-. Prin urmare, determinarea dacă EIP poate susține diferențierea și proliferarea în epiderma epuizată de NAD poate oferi o mai bunăînțelegerea acesteiamecanism anti-imbatranire.

cistanche anti-aging herbs

Recent, Aioi et al. a arătat că utilizarea locală a EIP a redus foarte mult ridurile faciale și a îmbunătățit hidratarea pielii17. Testul nostru clinic anterior a arătat că aplicarea locală a cremei PPE a dus la o îmbunătățire semnificativă aparametrii anti-imbatranire a pielii, cariduri,hidratarea pielii, slăbire, și eyebags (date nepublicate). Concluziile acestui studiu pot contribui la înțelegerea mecanismului de bază prin care PPE reduce ridurile și îmbunătățește hidratarea pielii. Un raport anterior a arătat că nivelurile totale de NAD intracelulare sunt corelate pozitiv cu expresia componentelor matricei extracelulare, cum ar fi procolagenul și elastina, în fbroblastele pielii umane30. Tratamentul fibroblastelor cu PPE are ca rezultat creșterea producției de colagen de tip I17. În combinație cu aceste fapte, EIP poate promova producția de colagen prin creșterea conținutului de NAD din fibroblaste, ceea ce poate duce la atenuarea ridurilor pielii observate în studiile clinice. Hidratarea pielii este strâns asociată cu funcția de barieră a stratului epidermic. Mai multe studii au sugerat că NAD este un co-factor esențial pentru menținerea funcției de barieră a pielii. Ming şi colab. a arătat că deacetilaza SIRT1 dependentă de NAD reglează expresia filagrinei, care joacă un rol critic ca proteină precursoare a factorilor naturali de hidratare în integritatea barierei pielii31. În plus, un studiu clinic a demonstrat că aplicarea topică a unui agent de stimulare a NAD a scăzut semnificativ pierderea de apă transepidermică, împreună cu o creștere a grosimii stratului cornos în pielea fotodeteriorată25. Aceste rapoarte sugerează că EIP poate îmbunătăți funcția de barieră a pielii prin creșterea nivelurilor de NAD celular în epidermă, ceea ce duce probabil la îmbunătățirea hidratării pielii observată în studiile clinice.


În ultimii ani, amplificatorii NAD s-au dovedit a fi utili în îmbunătățirea efectelor antioxidante și antiinflamatorii. În modelele de șoareci diabetici și septici, administrarea NR a redus semnificativ inflamația creierului indusă de dieta bogată în grăsimi și a prevenit stresul oxidativ endotelial indus de lipopolizaharide, respectiv 32,33. Similar cu NR, s-a demonstrat că suplimentarea cu NMN la șoarecii în vârstă inversează profilul de exprimare a ARNm proinflamator în unitatea neurovasculară și îmbunătățește funcția cardiovasculară prin scăderea stresului oxidativ34,35. În plus, un studiu clinic pe bărbați în vârstă a arătat că NR oral a scăzut nivelurile de citokine inflamatorii circulante36. Luate împreună, aceste studii in vivo și clinice susțin ideea că aplicarea agenților de stimulare a NAD oferă efecte antioxidante și antiinflamatorii. Activitatea SIRT îmbunătățită a fost sugerată ca unul dintre mecanismele plauzibile prin care acești amplificatori NAD exercită efecte antiinflamatorii și antioxidante. EIP este cunoscut ca având efecte antioxidante și antiinflamatorii15; cu toate acestea, explorarea mecanică relativ limitată a fost efectuată până în prezent. Prezentul studiu oferă cel puțin o explicație parțială a efectelor PPE.


Se știe că PPE conține proteine ​​abundente care favorizează creșterea celulară, cum ar fi laminina, citokinele și factorii de creștere. Studiile recente, inclusiv ale noastre, au implicat că nivelurile celulare de NAD sunt asociate cu creșterea celulară în keratinocitele epidermice21,28. Prin urmare, am speculat că unele dintre aceste proteine ​​ar putea contribui la creșterea conținutului de NAD. Cu toate acestea, contrar așteptărilor noastre, am constatat că o porțiune care conține molecule cu greutate moleculară mică de mai puțin de 3 kDa a promovat producția de NAD în keratinocite. În mod interesant, fracționarea porțiunii PPE folosind HPLC a dezvăluit că producția de NAD a fost observată doar în fracția 3. De asemenea, am constatat că precursori ai NAD, cum ar fi NMN, NR și NAM, au fost prezenți în această fracție, sugerând că ar putea explica efectul. de EIP pentru producția de NAD, cel puțin parțial. Cu toate acestea, deoarece fiecare constituent conținut în PPE a fost detectat la concentrații foarte scăzute, pare dificil de explicat că acești constituenți singuri sunt responsabili pentru capacitatea PPE de a promova conținutul de NAD în keratinocite. Rapoarte recente au arătat că formele reduse ale acestor precursori NAD, NRH și NMNH, au o capacitate mai mare de a produce NAD decât NR și NMN37-40. Deși sunt necesare analize suplimentare pentru a determina dacă PPE conține NRH și NMNH, capacitatea de creștere a NAD a PPE observată în acest studiu poate fi atribuită mai multor amplificatori NAD, inclusiv NMN, NR, NMNH, NRH și alți precursori NAD necunoscuți.

cistanche best anti-aging herbs

În concluzie, descoperirile noastre deschid posibilitatea utilizării PPE pentru a îmbunătăți diferite boli și simptome prin creșterea nivelurilor intracelulare de NAD, un cofactor esențial implicat în diferite reacții biochimice celulare.



Materiale și metode

Pregătirea EIP. PE a fost izolat din placenta porcină congelată. După îndepărtarea tuturor urmelor de sânge și cordon ombilical, placenta porcină a fost spălată, omogenizată și supusă la trei cicluri de îngheț-dezgheț. Omogenatul de țesut a fost centrifugat la 120 x g timp de 1 min și supernatantul a fost colectat și utilizat ca PPE. Pentru a calcula conținutul de solid uscat, PPE a fost concentrat și uscat la 105 grade timp de 5 ore. După răcire în cameră

temperatura într-un desicator, greutatea a fost măsurată cu o balanță de precizie. Conținutul solid uscat al PPE a fost de 10,98 mg/mL.

best anti-aging herbs

Culturi celulare.

NHEK (nou-născut/masculin, Termo Fisher Scientifc, Waltham, MA, SUA) au fost cultivate în mediu EpiLife™ care conține 60 μM calciu suplimentat cu supliment de creștere a keratinocitelor umane (ambele de la Termo Fisher Scientifc) la 37 de grade într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2 . Mediul a fost schimbat în fiecare zi alternativă până când cultura a ajuns la aproximativ 50% confluență, după care a fost schimbat în fiecare zi. Celulele au fost trecute când au ajuns la 80-90 la sută confluență. NHEK-urile nu au fost folosite dincolo de pasajul 5.



Test de cuantificare și recuperare a NAD.

Cantitatea de NAD a fost măsurată folosind kit-ul de testare NAD plus/NADH-WST (Laboratoarele Dojindo, Kumamoto, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 1,0× 105 NHEK au fost însămânțate în 12-plăci de godeuri. După 24 de ore, celulele au fost tratate cu PPE la diferite opțiuni de concentrat (0, 0.25, 0,5 și 1 mg/mL) și cultivate timp de 1-24 de ore în prezența sau absența a 5 nM FK866 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, SUA). Celulele au fost lizate cu tamponul de extracție NAD plus/NADH furnizat și ultrafiltrate folosind un dispozitiv de filtrare centrifugal Ultracel-10 K (Merck, Darmstadt, Germania). Pentru a calcula concentrația NADH, jumătate din filtrate au fost incubate la 60 de grade timp de 60 de minute pentru a descompune NAD plus. Toate filtratele au fost supuse reacției enzimatice la 37 de grade timp de 1 oră. Apoi, absorbanța probelor a fost măsurată la 450 nm folosind un cititor de plăci Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Elveția). Conținutul de NAD plus a fost calculat prin scăderea conținutului de NADH din conținutul total de NAD. Nivelurile de NAD plus/NADH au fost normalizate la concentrațiile de proteine ​​respective determinate folosind testul de proteine ​​Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific).


Testul MTT. Te NHEK au fost însămânțate într-o placă de {{0}}godeuri la 0,5 × 105 celule per godeu și incubate timp de 24 de ore. Celulele au fost apoi tratate cu PPE (0,5, 1, 2 și 5 mg/mL) sau 0,2 procente TX-100 timp de 24 de ore. Celulele au fost incubate

cu 300 μL de soluție MTT (Thermo Fisher Scientific) de 1 mg/mL la 37 de grade și 5% CO2 timp de 3 ore. După spălare de trei ori cu PBS, formazanul infiltrat în NHEK a fost extras cu 200 μL de dimetil sulfoxid la temperatura camerei timp de 2 ore. Absorbția optică la 560 nm a fost determinată folosind un cititor de plăci Infnite 200 Pro (Tecan).


Ultrafiltrarea PPE. PPE (500 μL) a fost aplicat pe un dispozitiv de filtrare centrifugal Ultracel-3K (Merck Millipore) și centrifugat la 16.100 xg la 4 grade timp de 60 de minute. Filtratele au fost utilizate ca o fracție LMW a PPE. Pentru a recupera reziduurile de pe filtru, dispozitivele de filtrare au fost plasate cu susul în jos într-un tub de centrifugă nou și centrifugate la 1000 x g la 4 grade timp de 5 minute. Reziduurile au fost reconstituite cu 500 μL de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și utilizate ca fracție HMW de PPE.


Fracționarea HPLC. Pentru fracţionarea LMW-PPE, am folosit un sistem de gradient HPLC echipat cu un injector de probă cu seringă, pompe duble, un detector MD-2010 multi-UV (Jasco, Tokyo, Japonia) și
o coloană C 18 cu fază inversă (Inertsil ODS-3, 5 μm, 4,6×250 mm, GL Science, Tokyo, Japonia). Pentru o reproductibilitate ridicată, a fost folosită o coloană analitică pentru fracţionare, mai degrabă decât una preparativă. Solvenții HPLC
au fost 0,05% acid trifluoracetic în apă (A) și acetonitril de calitate HPLC (B). O sută de microlitri de LMW-PPE au fost aplicați pe coloana HPLC și separati folosind următorul gradient la o rată de flux de 1 ml/

min: mențineți la 100 procente de solvent A de la 0 la 10 min, apoi un gradient liniar de la 0 la sută B în 10 min la 95 la sută B în 30 de minute. Eluanții au fost colectați în tuburi de probă la fiecare 2 minute și uscați folosind un evaporator centrifugal CVE-3100 (EYELA, Tokyo, Japonia). Reziduurile au fost reconstituite cu 100 μL de PBS și filtrate printr-o membrană de 0,22 μm înainte de a utiliza testul de recuperare a NAD.


Analize ale precursorilor NAD.

NMN, NR și NAM au fost detectate și cuantificate prin diluție izotopică LC-MS/MS. Analizele au fost efectuate folosind un sistem ACQUITY UPLC H-Class cuplat cu un spectrometru de masă TQS-micro triplu cvadrupol (Waters, Milford, MA, SUA) cu ionizare electrospray operat în modul ion pozitiv. O coloană Capcell Pak ADME HR (2 μm, 2,1×100 mm, Osaka Soda, Osaka, Japonia) a fost utilizată pentru a separa fiecare probă. Fazele mobile A–B au fost apă-metanol (conținând {{10}},1% acid formic și 10 mM formiat de amoniu). Condiția de gradient a fost următoarea: 0–0,5 min (99 la sută A), 0,5–3 min (99–60 la sută A), 3–5 min (60–2 la sută A) și 5–7 min (2 la sută A). Debitul a fost de 0,2 ml/min. Tensiunea capilară a fost de 0,75 kV, temperatura sursei a fost de 150 de grade, iar temperatura de desolvatare a fost de 500 de grade. Debitul de gaz conic a fost de 50 L/h, iar debitul de gaz de desolvatare a fost de 1100 L/h. Pentru a cuantifica fiecare precursor NAD, NAM-13C6 a fost adăugat la probe la o concentrație de 78 nM ca standard intern. Ionii au fost monitorizați folosind monitorizarea reacțiilor multiple (MRM) cu următoarele tranziții: m/z 335→123 pentru NMN, m/z 255→123 pentru NR, m/z 123→80 pentru NAM și m/z 129→85 pentru NAM-13C6. NMN a fost achiziționat de la Oriental Yeast (Tokyo, Japonia). NR și NAM-13C6 au fost obținute de la Merck (Darmstadt, Germania). NAM a fost achiziționat de la Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japonia).



RHE. Modelul RHE in vitro EpiDerm™ (EPI-200) a fost achiziționat de la MatTek (Ashland, MA, SUA) și cultivat în mediu EPI-100-ASY (MatTek) la 37 de grade și 5% CO2. S-au aplicat o sută de microlitri de PPE (1, 2 și 10 mg/mL) sau 1% TX-100 pe partea stratului cornos al RHE. RHE a fost incubat timp de 48 de ore într-un mediu EPI-100-ASY în prezența sau absența FK866 (5 nM). După incubare, RHE a fost spălat de trei ori cu PBS. Pentru analiza de recuperare a NAD, nivelurile totale de NAD din RHE au fost cuantificate utilizând kit-ul de testare NAD plus /NADH-WST. Pentru analiza activității metabolice celulare, RHE a fost transferat pe o placă de 24-godeuri și incubat cu 300 μL de soluție MTT (Thermo Fisher Scientific) de 1 mg/mL la 37 de grade și 5% CO2 timp de 3 ore. După spălare de trei ori cu PBS, formazanul infiltrat în RHE a fost extras cu 2 mL de dimetil sulfoxid la temperatura camerei timp de 2 ore. Absorbția optică la 560 nm a fost determinată folosind un cititor de plăci Infnite 200 Pro (Tecan). Absorbanța cu 1% RHE tratată cu TX-100 a fost utilizată ca control pozitiv pentru testul activității metabolice celulare.

Analize statistice. Datele sunt prezentate ca medie ± eroarea standard a mediei a cel puțin trei experimente independente. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul EZR versiunea 1.55 (Saitama Medical

Centru, Universitatea de Medicină Jichi, Saitama, Japonia). Înainte de compararea datelor, normalitatea distribuției a fost confirmată de testul Shapiro-Wilk. Omogenitatea varianțelor a fost evaluată cu testul F (două grupuri) și
Testul Bartlett (grupe multiple). Diferențele dintre mai multe grupuri au fost determinate folosind ANOVA unidirecțional urmată de testul post-hoc al lui Tukey. Testul t al lui Student a fost folosit pentru a testa diferențele semnificative între cele două
grupuri. Semnificația statistică a fost stabilită la p<0.05 and p<0.01. Asterisks and daggers indicate statistical significance compared to the control (*p<0.05, **p<0.01) and indicated (†p<0.05 and ††p<0.01) groups, respectively.
Aprobare etică. Nu se aplică. Placentele porcine care au fost luate și congelate imediat în 3 ore după nașterea spontană a fetușilor au fost achiziționate de la o fermă din Hokkaido, Japonia, cu acordul proprietarului. Niciun animal viu nu a fost implicat în acest studiu


Referințe

1. Imai, Si. & Guarente, L. NAD plus și sirtuine în îmbătrânire și boală. Trends Cell Biol. 24, 464–471 (2014).
2. Chaleckis, R., Murakami, I., Takada, J., Kondoh, H. & Yanagida, M. Variabilitatea individuală a metaboliților din sângele uman identifică diferențele legate de vârstă. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 113, 4252–4259 (2016).
3. Massudi, H. şi colab. Modificări asociate cu vârsta în stresul oxidativ și NAD plus metabolismul în țesutul uman. PLoS ONE 7, e42357 (2012).
4. Camacho-Pereira, J. et al. CD38 dictează declinul NAD legat de vârstă și disfuncția mitocondrială printr-un mecanism dependent de SIRT3-. Cell Metab. 23, 1127–1139 (2016).
5. Braidy, N. și colab. Modificări legate de vârstă ale NAD plus stresul oxidativ al metabolismului și activitatea sirt1 la șobolanii Wistar. PLoS ONE 6, e19194 (2011).
6. Guest, J., Grant, R., Mori, TA și Croft, KD Modificări ale daunelor oxidative, inflamației și [NAD(H)] cu vârsta în lichidul cefalorahidian. PLoS ONE 9, e85335 (2014).
7. Rajman, L., Chwalek, K. & Sinclair, DA Potențialul terapeutic al moleculelor de stimulare a NAD: dovezi in vivo. Cell Metab. 27, 529–547 (2018).
8. Yaku, K., Okabe, K. & Nakagawa, T. Metabolismul NAD: Implicații în îmbătrânire și longevitate. Imbatranire Res. Apoc. 47, 1–17 (2018).
9. Revollo, JR, Grimm, AA & Imai, SI Calea de biosinteză a NAD mediată de nicotinamid fosforiboziltransferaza reglează activitatea Sir2 în celulele de mamifere. J. Biol. Chim. 279, 50754–50763 (2004).
10. Yoshino, J., Baur, JA & Imai, SI NAD plus intermediari: Te biologia și potențialul terapeutic al NMN și NR. Cell Metab. 27.513–528 (2018).
11. Garrido, A. & Djouder, N. NAD plus deficite în boli legate de vârstă și cancer. Trends Cancer 3, 593–610 (2017).
12. Pogozhykh, O., Prokopyuk, V., Figueiredo, C. & Pogozhykh, D. Placenta și derivații placentari în terapii regenerative: studii experimentale, istorie și perspective. Celulele Stem Int. 2018, 4837930 (2018).
13. Kong, MH şi colab. Efectul extractului placentar uman asupra simptomelor menopauzei, oboselii și factorilor de risc pentru bolile cardiovasculare la femeile coreene de vârstă mijlocie. Menopauza 15, 296–303 (2008).
14. Yoshikawa, C. Efectul extractului placentar porcin asupra producției de colagen în fibroblastele pielii umane in vitro. Ginecol. Obstet. 03, 0–4 (2013).
15. Heo, JH, Heo, Y., Lee, HJ, Kim, M. & Shin, HY Efecte antiinflamatorii și antioxidante topice ale extractelor de placentă porcină asupra dermatitei de contact induse de 2,4-dinitroclorobenzen. Complement BMC. Altern. Med. 18, 331 (2018).
16. Tiwary, SK și colab. Efectul gelului și cremei cu extract placentar asupra rănilor care nu se vindecă. J. Wound Care 15, 325–328 (2006).
17. Aioi, A. et al. Extractul de placenta porcină a redus formarea ridurilor prin potențarea hidratării epidermice. J. Cosmet. Dermatol. Sci.

Aplic. 11, 101–109 (2021).

Cere mai mult:


E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950













S-ar putea sa-ti placa si