Potențiali biomarkeri lacrimali pentru diagnosticarea bolii Parkinson – Un studiu pilot Ⅰ

Rezumat: Boala Parkinson (BP) este a doua cea mai frecventă boală neurodegenerativă după boala Alzheimer. În acest studiu, profilul de proteom lacrimal al pacienților cu PD idiopatică (iPD, n=24), purtători ai mutației E46K-SNCA (n=3) și control sănătos (CT, n {{4} }}) subiecții au fost analizați pentru a identifica biomarkeri candidați pentru diagnosticul PD. A fost efectuat un studiu pilot observațional, prospectiv și caz-control, care a explorat mostrele de lacrimi ale participantului prin cromatografie nano-lichidă-spectrometrie de masă (nLC-MS/MS) și evaluând afectarea neurologică a acestora. Datele proteomice obținute sunt disponibile la ProteomeXchange cu identificatorul 10.6019/PXD028811.

Faceți clic pentru a folosi Amway pentru boala Parkinson

Aceste analize au condus la identificarea a 560 de proteine ​​lacrimale, dintre care unele au fost dereglate la pacienții cu PD și care au fost implicate în răspunsurile imune, inflamație, apoptoză, degradarea colagenului, sinteza proteinelor, apărare, transportul lipidelor și modificarea funcției lizozomale. Dintre aceste proteine, șase au fost legate de procese neurodegenerative și au arătat o capacitate excelentă de a clasifica pacienții și controalele. Aceste descoperiri au arătat că anumite proteine ​​au fost reglate în sus în lacrimile pacienților cu PD, în principal proteine ​​implicate în funcția lizozomală. Astfel, în acest studiu, proteinele lacrimale au fost identificate ca fiind implicate în neurodegenerarea care poate fi legată de un fenotip de boală agresiv la pacienții cu PD.

Cuvinte cheie: biomarkeri; Boala Parkinson; film lacrimal; lizozom

1. Introducere

Boala Parkinson (PD) este a doua cea mai frecventă boală neurodegenerativă după boala Alzheimer (AD) și se caracterizează prin încetinirea mișcării (bradikinezie), creșterea tonusului muscular (rigiditate), tremurături (tremor) și controlul postural afectat. În PD confirmată patologic, există o cantitate variabilă și o depunere de alfa-sinucleină (-syn) pliată greșit sub formă de corpi Lewy (LB) și neuriți Lewy în sistemul nervos central (SNC). Această variabilitate în acumularea acestor structuri este probabil să reflecte eterogenitatea clinică în această boală [1-3]. Într-adevăr, mai multe tulburări clinice se află în spectrul bolilor cu corp Lewy (LBD), inclusiv pacienții cu PD idiopatică (IPD) și genetică și pacienții care suferă de demență cu LB. Una dintre principalele provocări în tratarea bolilor neurodegenerative este găsirea de markeri clinici care să permită clasificarea timpurie a pacienților și să ajute la monitorizarea progresiei bolii.

Factori precum stresul oxidativ, proteoliza și concentrațiile modificate de acizi grași sau fosfolipide au fost asociați cu modificări structurale ale -syn, iar modificările post-translaționale pot, de asemenea, modifica dimensiunea, structura sau încărcarea proteică a -syn [4]. Mutațiile și multiplicarea dereglării în gena -syn (SNCA) provoacă forme familiale autosomal-dominante ale PD [5]. Poate că cea mai patogenă mutație cunoscută pentru a induce PD este mutația E46K în -syn (E46K-SNCA), care stă la baza unui grup de LBD genetice agresive, cu caracteristici clinice și patologice care amintesc de demența cu LBs [6,7]. Deși mutațiile în -syn sunt rare, ele oferă o oportunitate unică de a identifica pacienții cu PD și de a înțelege mai bine progresia acestor patologii.

Se știe că pacienții cu PD dezvoltă halucinații, modificări în mișcarea ochilor și a pleoapelor și compoziția lacrimală alterată în cantități reduse [8,9]. În plus față de afectarea suprafeței ochiului, acești pacienți pot prezenta modificări în acomodarea, acuitatea vizuală redusă, formarea de scotom (zone în care câmpul lor vizual este parțial diminuat sau complet degenerat) și o subțiere a straturilor retiniene, în special datorită unei reduceri. în numărul de fibre nervoase [10,11]. Deficiențele în neurotransmisie și metabolismul monoaminei influențează, de asemenea, modificările patologice ale sistemului vizual al pacienților cu PD [12].

Aceste modificări sunt destul de tipice, deoarece monoaminele sunt implicate în transmiterea informațiilor vizuale în retină [13]. Mai mult, pacienții cu PD pot prezenta modificări ale inervației părții anterioare a ochiului care pot modifica în cele din urmă compoziția lacrimilor. Mulți neurotransmițători și substanțe trofice sunt secretate în lacrimi, provenind din umoarea apoasă sau din nervii care trec prin cornee [14].

Cu toate acestea, mecanismele celulare și moleculare care stau la baza acestor asocieri nu au fost încă pe deplin elucidate. Deoarece PD afectează mai multe sisteme non-motorii și nervi periferici, secreția lacrimală ar putea fi alterată la acești pacienți, iar compoziția proteinei lacrimale ar putea prezenta un profil caracteristic la acești pacienți care ar putea servi ca biomarker de diagnostic. În acest sens, analiza proteinelor lacrimale ale pacienților cu E46K-SNCA și iPD ar putea ajuta la identificarea biomarkerilor candidați utili pentru diagnosticul și progresia PD.

Prin urmare, studiul de față și-a propus să analizeze profilul proteomului lacrimal la pacienții cu iPD și purtătorii mutației E46K-SNCA pentru a găsi un biomarker care ar putea ajuta la diagnosticarea viitoare a PD, folosind probe non-invazive.

2. Materiale și metode

2.1. Cohorta de studiu

Am proiectat un studiu pilot observațional, prospectiv, caz-control, în care au fost înrolați 24 de pacienți cu iPD, 3 purtători ai mutației E46K-SNCA și 27 de subiecți sănătoși (CT). Această cercetare a fost efectuată de personal calificat din punct de vedere medical după ce a primit aprobarea de la Comitetul de etică OSI Ezkerralde-Enkaterri-Cruces CEIC E18/47. Studiul a fost realizat în strictă conformitate cu principiile Declarației de la Helsinki privind cercetarea biomedicală care implică subiecți umani. Înainte de colectarea probei, a fost obținut consimțământul informat semnat de la toți subiecții după ce s-a explicat natura și posibilele consecințe ale studiului. Pacienții au fost recrutați la Unitățile Serviciului de Neurologie și Oftalmologie ale Spitalului Universitar Cruces (Barakaldo, Bizkaia, Spania) în timpul consultațiilor ambulatoriu, pe baza criteriilor de includere și excludere convenite. Pacienții cu IPD au îndeplinit criteriile Parkinson’s UK Brain Bank pentru diagnosticul de PD și nu prezentau nicio mutație cunoscută.

Criteriile de includere pentru CT au fost să aibă vârsta de peste 40 de ani, indiferent de sex și fără antecedente clinice de vreo tulburare neurologică. Persoanele cu (sau cu antecedente de) orice tulburare/afecțiune sistemică sau oculară au fost incluse în studiu. Criteriile de excludere au constat în intervenții chirurgicale oculare în ultimele trei luni, medicație cronică pentru ochi (de exemplu, pentru glaucom), antecedente de alergii, utilizarea oricărui medicament local (altul decât lacrimile artificiale) sau medicamente orale care conțineau corticosteroizi, atopie și pacienții cu Sjögren. sindrom.

Utilizatorii de lentile de contact au fost, de asemenea, excluși pentru a evita orice posibilă interferență cu interpretarea rezultatelor. Testele oculare preliminare și recoltarea de probe au fost efectuate în aceeași zi, în timp ce pacienții cu PD au fost, de asemenea, văzuți într-o zi separată de membrii echipei de cercetare, experți în tulburări de mișcare pentru a evalua Scala Parkinson.

2.2. Examen oftalmologic

Examenul clinic oftalmologic a inclus testul Schirmer I (SCH), care determină dacă ochiul produce suficiente lacrimi pentru a-l menține umed. Testul permite apei în lacrimi să se deplaseze pe lungimea unei benzi de testare de hârtie, iar valorile normale sunt mai mari sau egale cu 10 mm de umezire a hârtiei după 5 minute. Instabilitatea filmului lacrimal a fost evaluată prin utilizarea timpului de rupere a lacrimilor (TBUT) cu fluoresceină. TBUT este timpul necesar pentru ca primul loc uscat să apară pe cornee după o clipire completă. O valoare mai mică de 10 s reflectă de obicei o anumită instabilitate a filmului lacrimal. Orice boală sistemică sau orice altă afecțiune/utilizare de medicamente care ar putea interfera cu interpretarea rezultatelor a fost considerată un criteriu de excludere.

2.3. Examen neurologic

Un expert neurolog în domeniul tulburărilor de mișcare a înregistrat vârsta pacienților cu PD la colectarea lacrimilor, durata bolii și scorul lor pe Scala unificată de evaluare a bolii Parkinson (UPDRS) și scala Hoehn Yahr. Aceste teste servesc ca criterii de stratificare pentru a urmări progresia bolii. Confidențialitatea datelor pacienților a fost asigurată prin utilizarea Băncii Basce.

2.4. Colectarea de mostre lacrimale

Toate probele de lacrimă au fost colectate utilizând tuburi microcapilare din sticlă calibrate de 10 µL (BLAUBRAND intraMark, Wertheim, Germania). Probele de lacrimă au fost obținute din meniscul lacrimal temporal inferior, minimizând iritația suprafeței oculare sau a marginii pleoapelor și fără instalarea anesteziei. Probele de lacrimă au fost colectate de la ambii ochi ai fiecărui participant și plasate imediat în tuburi Eppendorf prerăcite. După colectarea lacrimilor, probele au fost păstrate la -80 ◦C până la analizele lor.

2.5. Analize proteomice

Analizele proteomice au fost efectuate la Serviciul CIC bioGUNE Proteomics (Derio, Bizkaia, Spania), utilizând protocolul Filter Assisted Sample Preparation (FASP) [15] pentru procesarea și digestia probei. S-a adăugat tripsina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SUA) la un raport tripsină: proteină de 1:50, iar amestecul a fost incubat peste noapte la 37 ◦C, uscat într-un RVC{{4} } Concentrator Speedvac (Hristos, Viena, Austria). Peptidele obținute au fost desarate și resuspendate în acid formic (FA) 0,1 procente (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SUA) folosind vârfuri de etapă C18 (Millipore, St. Louis, MO, SUA).

Probele au fost analizate într-un nou spectrometru hibrid de spectrometrie de mobilitate ionică prin timp de zbor quadrupol (timsTOF Pro cu PASEF, Bruker Daltonics, Bremen, Germania), cuplat online la un cromatograf lichid nanoElute (Bruker, Coventry, Marea Britanie). Acest spectrometru de masă profită de un nou mod de scanare numit fragmentare în serie de acumulare paralelă (PASEF), care multiplică viteza de secvențiere fără nicio pierdere a sensibilității și s-a dovedit că oferă o viteză analitică și o sensibilitate remarcabile pentru analizele proteomice [16].

Probele (200 ng) au fost încărcate direct pe o coloană analitică Bruker nano eluată de 15 cm C18 (Bruker, Coventry, Marea Britanie) și s-au rezolvat la 400 nL/min. Coloana a fost încălzită la 50 °C într-un cuptor. Identificarea și cuantificarea proteinelor au fost efectuate utilizând software-ul PEAKS (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, CA, SUA). Căutările au fost efectuate pe o bază de date de intrări umane canonice Uniprot/Swissprot (fără izoforme considerate), cu toleranțe la precursori și fragmente de 20 ppm și 0,05 Da.

O cuantificare a proteinei fără etichete bazată pe zonă a fost efectuată utilizând modulul PEAKS Q disponibil în software-ul PEAKS. Doar proteinele identificate cu cel puțin două peptide la o rată de descoperire falsă (FDR) < 1 la sută și prezente în cel puțin 70 la sută din probele de la unul dintre grupurile experimentale analizate au fost luate în considerare pentru analize ulterioare. Datele au fost încărcate pe platforma Perseus [17] și prelucrate în continuare (transformare log2, imputare) înainte de aplicarea testului t Student pentru analiza diferențială a expresiei proteinelor. Datele de proteomică sunt rezumate în Supplementary Materials File S1, iar datele de proteomică de spectrometrie de masă au fost depuse la ProteomeXchange Consortium prin intermediul depozitului partener PRIDE [18], cu identificatorii setului de date PXD028811 și 10.6019/PXD028811.

2.6. Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate utilizând pachetul IBM SPSS Statistics pentru Windows, 23.0v (IBM-SPSS, Armonk, New York, NY, SUA). Normalitatea datelor continue a fost evaluată cu un test Shapiro-Wilk. Valorile p calculate determină probabilitatea ca asocierea dintre proteinele din setul de date și o anumită cale canonică, rețea funcțională sau regulator din amonte să fie explicată doar întâmplător, pe baza unui test exact al lui Fisher, cu o valoare p < {{5 }}.05 fiind considerat semnificativ.

Regresiile logistice univariate au fost utilizate pentru a identifica caracteristicile semnificative statistic asociate cu discriminarea PD-pacient. După selecția variabilelor, regresiile logistice multivariate au fost utilizate pentru a construi un model de discriminare PD și pentru a identifica variabilele clinice și proteomice relevante pentru identificarea PD. Modelele logistice permit estimarea relației dintre o variabilă dependentă discretă și un set de variabile independente continue sau discrete. Modelele permit clasificarea pacienților cu sau fără PD, calculând probabilitatea de apartenență la fiecare grup. Valoarea p a fiecărei covariate descrie semnificația statistică a asocierii dintre răspuns și fiecare termen inclus în model.

pentru mai multe informații: Ali.ma@wecistanche.com