PRAT 1 Cistanches Deserticola PhG-RE prin mecanismul de inhibare a apoptozei ERS pentru a proteja apoptoza celulelor miocardice de stresul reticulului endoplasmatic indus de H2O2-

Pentru mai multe informații, vă rugăm contactați:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

Departamentul de Farmacie, Spitalul Unirii China-Japonia al Universității Jilin, Changchun 130033, China

Corespondența ar trebui să fie adresată lui Qian Yu; yuqian@jlu.edu.cn

Primit 9 iunie 2020; Revizuit la 15 iulie 2020; Acceptat 24 iulie 2020; Publicat 25 septembrie 2020

Editor academic: Michel Mansur Machado

Copyright © 2020 Tianwei Lan și Qian Yu. Acesta este un articol cu ​​acces liber distribuit sub Licența de Atribuire Creative Commons, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea fără restricții pe orice mediu, cu condiția ca lucrarea originală să fie citată în mod corespunzător.

PlantaCistanchedeserticolaare unele efecte protectoare miocardice. Acest studiu a încercat să explice mecanismul prin care PhG-RE protejează celulele miocardice și să verifice dacă această protecție are loc prin reglarea mecanismului de apoptoză asociat cu stresul reticulului endoplasmatic (ERS). Celulele miocardice de șobolan au fost expuse la 150 ug mL-1 PhG-RE timp de 24 de ore și apoi la 100 μmol mL-1 H2O2 timp de 18 ore pentru a induce ERS și a stabili un model de deteriorare celulară. Thapsigargin (TG), un activator specific ERS și 4- acid fenilbutiric ({4-PBA), un inhibitor ERS, au fost utilizate pentru a valida acuratețea experimentului. Rezultatele noastre au demonstrat că PhG-RE a îmbunătățit semnificativ viabilitatea celulelor, a protejat celulele și a redus deteriorarea celulelor și apoptoza. PhG-RE a jucat un rol similar cu cel al inhibitorului ERS 4-PBA în protejarea celulelor miocardice împotriva apoptozei și a leziunilor induse de stresul ER. În plus, PhG-RE a atenuat în mod semnificativ expresia ARNm a factorilor apoptotici asociați ERS GRP78, CHOP și Caspaza-12 și expresia proteinei factorilor apoptotici asociați ERS GRP78, CHOP, Caspaza-12, și p-JNK. Luate împreună, aceste descoperiri sugerează că PhG-RE poate proteja în mod eficient celulele miocardice și poate reduce apoptoza și deteriorarea celulelor, care pot fi legate de reglarea apoptozei asociate cu ERS.

1. Introducere

Cistanche deserticola(C. deserticola) este una dintre plantele pe bază de plante folosite în medicina tradițională chineză care crește în medii deșertice. Thefeniletanoidglicozidă-extractul bogat (PhG-RE) este principala componentă activă aC. deserticola. Cercetările au descoperit că PhG-RE poate proteja miocardul împotriva leziunilor de ischemie-reperfuzie (I/R) [1].

Când ERS începe să apară în celulele miocardice, nivelul proteinei 78 reglate de glucoză (GRP78) crește pentru a antagoniza o leziune indusă de ERS. Pe măsură ce ERS progresează, este inițiată apoptoza și expresia proteinei omoloage CCAAT/proteinei omoloage de legare a intensificatorului (CHOP), kinazei N-terminale c-Jun (JNK) și proteinazei specifice de cisteinil aspartat-12 (Caspaza{{8) }}) crește. De exemplu, expresia GRP78, CHOP și ATF6 scindat (c-ATF6) în celulele miocardice ale șobolanilor cu IC este semnificativ crescută, iar PERK (p-PERK), IRE1 (p-IRE1) și p-JNK sunt activate [2]. În plus, ERS indusă de leziunea I/R crește expresia GRP78 și CHOP [3]. Nivelurile de fosforilare ale PERK și eIF2 sunt crescute [4]. Expresia proteinelor pro-apoptotice Bax și Caspaza-3 este crescută, provocând ruptură celulară și remodelare miocardică [5], iar aria de infarct miocardic și activitatea enzimatică miocardică este crescută [3]. S-a descoperit în timpul cercetărilor noastre anterioare că PhG-RE poate proteja miocardul împotriva leziunilor de ischemie-reperfuzie și poate reduce semnificativ aria infarctului miocardic indus de I/R [1]. Cu toate acestea, nu este clar dacă PhG-RE poate inhiba apoptoza asociată ERS și, prin urmare, poate reduce pierderea și apoptoza de celule miocardice. În acest studiu, celulele au fost pretratate cu PhG-RE pentru a observa dacă PhG-RE poate inhiba ERS indus de H2O2-și, prin urmare, reduce pierderea celulelor miocardice și apoptoza. Thapsigargin (TG), un activator specific ERS și 4-acidul fenilbutiric ({4-PBA), un inhibitor ERS, au fost utilizate pentru a verifica în continuare dacă mediarea ERS poate reduce eficient apoptoza celulară și dacă acest proces este legată de nivelurile de expresie ale GRP78, CHOP, JNK și Caspaze-12, care s-a dovedit că mediază ERS asociatapoptoza.

Cistanche poate preveni apoptoza celulară

2. Materiale și metode

2.1. Reactivi.

Secțiunea materiale și metode ar trebui să fie exhaustivă, astfel încât toate procedurile să poată fi repetate. Poate fi împărțit în subsecțiuni cu titluri dacă sunt descrise mai multe metode. Celulele miocardice de șobolan H9c2 au fost obținute de la Banca de celule a Academiei Chineze de Științe (Shanghai, China).C. deserticolaCistanchedeserticolaPhG-RE a fost obținut de la Changchun Medicinal Material Co. (Changchun, China), identificat de Dr. Zhong-ying Liu (Școala de Științe Farmaceutice, Universitatea Jilin) ​​și depus în herbarul Departamentului de Farmacie, Universitatea Jilin (exemplar de voucher număr: YQCD2014). Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) a fost obținut de la GIBCO (Grand Island, NY). Thapsigargin și 4-PBA au fost obținute de la Sigma (St. Louis, MO). Un kit de analiză a activității lactat dehidrogenazei (LDH) și un kit CCK-8 au fost achiziționate de la Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japonia). Serul fetal bovin (FBS) a fost achiziționat de la HyClone (Utah, SUA). Un kit de analiză a apoptozei celulare Annexin V-FITC a fost achiziționat de la Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). Tripsina a fost achiziționată de la Beijing Solarbio Life Sciences (Beijing, China). Un kit ReverTra Ace qPCR RT a fost achiziționat de la TOYOBO (Tokyo, Japonia). FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Rox) a fost achiziționat de la Roche (Basel, Elveția).

2.2. Anticorpi.

Abs policlonal de iepure GADD153/CHOP și GRP78/HSPA5 policlonal de iepure au fost achiziționați de la Novus (Colorado, SUA). Ab policlonal purificat prin afinitate cu caspaza de șoarece/șobolan -12 a fost achiziționat de la R&D Systems (Minnesota, SUA). Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) și mAb de iepure -actin (13E5) au fost achiziționate de la Cell Signaling Technology (Massachusetts, SUA). Abs secundare fluorescente au fost achiziționate de la LI-COR Biosciences (Nebraska, SUA).

2.3. Grupări și tratament.

Celulele H9c2 în faza de creștere logaritmică au fost selectate și tratate în următoarele grupuri: (1) grup martor: celulele miocardice H9c2 au fost cultivate într-un mediu complet; (2) Grupa PhG-RE: celulele au fost tratate timp de 24 de ore într-un mediu care conține 150 ug mL-1 PhG-RE; (3) Grup model de leziuni induse de ERS (grup H2O2): celulele au fost tratate timp de 18 ore într-un mediu care conține 100 μmol mL-1 H2O2; (4) Grupa (PhG-RE) –H2O2: celulele au fost tratate timp de 24 de ore într-un mediu care conține 150 ug mL-1 PhG-RE și apoi timp de 18 ore în 100 μmol mL-1 H2O2; (5) (4-PBA)

Grupa –H2O2: celulele au fost tratate timp de 24 ore într-un mediu de cultură care conține 5 mmol·mL-1 4-PBA și apoi timp de 18 ore în 100 μmol·mL-1 H2O2; (6) Grupa TG: celulele au fost tratate pentru

18 h într-un mediu care conține 50 nmol·mL-1 TG; și (7) (PhG-RE) -TG: celulele au fost tratate timp de 24 de ore într-un mediu care conține 150 ug·mL-1 PhG-RE și apoi timp de 18 ore în 50 nmol·mL-1 TG.

2.4. Cultură de celule.

Celulele miocardice H9c2 au fost cultivate în DMEM care conține 10% FBS și 1% penicilină-streptomicină la 37 de grade într-un incubator cu 5% CO2. Mediul complet a fost înlocuit la fiecare 2 zile. Celulele au fost observate la microscop și au crescut bine într-o formă fuziformă. Când densitatea de creștere a atins 70% -85%, celulele au fost subcultivate într-un raport de 1: 4.

2.5. CCK-8 Evaluarea viabilității celulare.

Celulele H9c2 au fost examinate microscopic și au fost selectate celulele în faza de creștere logaritmică. Suspensia celulară a fost obținută printr-o digestie cu tripsină și centrifugată timp de 5 minute într-un tub de centrifugă de 5 ml la 1000 r min-1. După ce lichidul rezidual a fost aruncat, s-au folosit 3 ml de mediu complet DMEM pentru a resuspenda peletele celulare în 100 μL per godeu și

5.0 103 celule au fost numărate la microscop. Celulele au fost transferate pe o placă de 96-godeuri și cultivate într-un incubator (37 grade, 5% CO2) timp de 24 de ore pentru a obține celule complet aderente. Densitatea optică (OD) a fost măsurată la o lungime de undă de 450 nm.

Viabilitatea celulară (procent) (grup experimental OD - grup martor OD)/(grup martor OD - grup martor OD) × 100 la sută.

2.6. Măsurarea spectrofotometrică a leziunii celulare.

Lactat dehidrogenaza (LDH) este o enzimă din citoplasmă care este eliberată în urma leziunii celulare, care apoi există stabil în mediul de cultură. Gradul de leziune celulară poate fi determinat prin măsurarea activității LDH în mediu. Acest experiment a fost efectuat conform instrucțiunilor pentru trusă. OD a fost măsurat la o lungime de undă de 490 nm. În fiecare grup erau trei puțuri.

2.7. Detectarea apoptozei cu colorare cu anexină V-FITC/PI.

Supernatantul a fost îndepărtat și transferat într-un tub de citometrie în flux. O suspensie celulară a fost preparată cu celule aderente la fundul vasului de digestie cu tripsină. După ce suspensia a fost centrifugată timp de 6 minute la 1.2 103 r min-1, supernatantul a fost aruncat, iar peletele celulare au fost spălate de trei ori cu PBS. Acest experiment a fost efectuat conform instrucțiunilor pentru trusa de apoptoză celulară Annexin V-FITC. După ce celulele au fost cultivate timp de 15 minute la temperatura camerei în întuneric, celulele au fost analizate cu un citometru de flux.

2.8. Măsurarea RT-qPCR a expresiei ARNm relative a GRP78, CHOP, JNK și caspazei-12.

ARN-ul celular total a fost extras cu un reactiv TRIzol. Doi microlitri de ARN total au fost separați prin electroforeză pe gel pentru a evalua integritatea extracției. Un spectrofotometru a fost utilizat pentru a măsura și calcula valoarea OD (260)/OD (280). ARN-ul total a fost transcris invers pentru a produce ADNc conform instrucțiunilor pentru kitul TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT. Tabelul 1 prezintă lista primerilor. Conform instrucțiunilor pentru mixul principal Roche FastStart Universal SYBR Green (Rox), condițiile de reacție au fost următoarele: denaturare inițială la 95 de grade timp de 10 minute, 95 de grade pentru 10 s, 58 de grade pentru 30 s și 72 de grade pentru 30 s. s pentru un total de 45 de cicluri.

2.9.Analiza Western Blot a expresiei proteinei GRP78, CHOP, JNK, p-JNK și caspazei-12.

Lizat de proteine ​​(50 ug) a fost separat prin electroforeză pe un gel de separare de 10%, urmat de transfer pe o membrană PVDF. Membrana PVDF a fost blocată în TBS-Resolution care conține 5% lapte degresat la temperatura camerei timp de 90 de minute. Membrana PVDF blocată a fost incubată peste noapte cu anticorpii 1, 2, 3 și 4 la 4 grade și apoi timp de 90 de minute cu IgG anti-iepure de capră (1: 1000) la temperatura camerei. În cele din urmă, membrana a fost dezvoltată cu un sistem de imagistică cu laser în infraroșu în două culori.

2.10. Metode statistice și analitice.

Datele din acest studiu au fost procesate cu software-ul SPSS 24.0, iar rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD. Datele din mai multe grupuri au fost comparate cu ANOVA, în timp ce datele din două grupuri au fost comparate cu teste t. O valoare de P < 0.05="" a="" fost="" considerată="" a="" avea="" semnificație="" statistică.="" software-ul="" imagej="" a="" fost="" folosit="" pentru="" a="" analiza="" cantitativ="" valorile="" tonurilor="" de="" gri="" ale="" benzilor="" de="">

FeniletanoidGlicozideîncistanche

3. Rezultate

3.1. Influența PhG-RE asupra viabilității celulare.

După cum se arată în Figura 1, în comparație cu cea a grupului de control, viabilitatea celulelor H9c2 din grupul PhG-RE nu s-a schimbat semnificativ (P > 0.05), dar viabilitatea celulele din ambele grupe H2O2 și TG au scăzut semnificativ. În comparație cu cea a grupului H2O2, viabilitatea celulelor atât în ​​grupele (PhG-RE)-H2O2, cât și în (4-PBA)-H2O2 a crescut semnificativ. În comparație cu cea a grupului TG, viabilitatea celulară în grupul (PhG-RE)-TG a crescut semnificativ. Toate rezultatele au fost semnificative statistic (P <>

3.2. Influența leziunii celulare PhG-REon.

După cum se arată în Figura 2, deși celulele din grupul PhG-RE au fost deteriorate în comparație cu cele din grupul de control, această leziune nu a atins o semnificație statistică (P > 0.05). Leziunile celulare din grupele H2O2 și TG au crescut semnificativ. Comparativ cu grupul H2O2, leziunile celulare din grupele (PhG-RE)-H2O2 și (4-PBA)-H2O2 au scăzut semnificativ (P <0,01). comparativ="" cu="" grupul="" tg,="" leziunile="" celulare="" din="" grupul="" (phg-re)-tg="" au="" scăzut="" semnificativ="" (p=""><>

3.3. Influența PhG-RE asupra apoptozei celulare.

După cum se arată în Figura 3, în comparație cu cea a grupului de control, apoptoza celulară din grupul PhG-RE nu s-a schimbat semnificativ (P > 0.05), în timp ce cea din H2O2 și TG grupurile au crescut semnificativ (P < 0,01).="" în="" comparație="" cu="" cea="" a="" grupului="" h2o2,="" apoptoza="" celulară="" în="" (phg-re)-h2o2="" și="">

grupurile au scăzut semnificativ (P < {{0}}.01).="" în="" comparație="" cu="" cea="" a="" grupului="" tg,="" apoptoza="" celulară="" în="" grupul="" (phg-re)-tg="" a="" scăzut="" semnificativ="" (p=""><>

3.4. Influența PhG-RE asupra expresiei ARNm GRP78, CHOP, JNK și caspaze-12.

Expresia relativă a ARNm în fiecare grup experimental a fost măsurată cantitativ cu RT-qPCR. După cum se arată în Figura 4, în comparație cu cea a grupului de control, expresia relativă a ARNm a GRP78, CHOP și Caspaze-12 a crescut semnificativ (P <0.01) în="" h2o2="" și="" expresia="" arnm="" relativă="" a="" jnk="" a="" crescut,="" de="" asemenea="" (p=""><0.05). în="" grupul="" tg,="" expresia="" relativă="" a="" arnm="" a="" grp78,="" chop,="" jnk="" și="" caspazei-12="" a="" crescut="" semnificativ="" (p=""><0.01). în="" comparație="" cu="" cea="" a="" grupului="" h2o2,="" expresia="" relativă="" a="" arnm="" a="" grp78,="" chop="" și="" caspazei-12="" în="" grupele="" (phg-re)-h2o2="" și="" (4-="" pba)-h2o2="" a="" scăzut="" semnificativ="" (p="">< 0.01),="" în="" timp="" ce="" expresia="" arnm="" relativă="" a="" jnk="" nu="" sa="" schimbat="" semnificativ="" (p=""> 0,05). În comparație cu cea a grupului TG, expresia relativă a ARNm a GRP78, JNK și a caspazei-12 în grupul (PhG-RE)-TG a scăzut (P <0,01), iar="" expresia="" relativă="" a="" arnm="" a="" chop="" nu="" a="" scăzut="" se="" modifică="" semnificativ="" (p=""> 0,05).

3.5. Influența PhG-RE asupra expresiei proteinei GRP78, CHOP și caspazei-12.

Figura 5 arată nivelurile de expresie a proteinei GRP78, CHOP și Caspaze-12. În comparație cu cea a grupului de control, expresia acestor trei proteine ​​în grupurile H2O2 și TG a crescut semnificativ după ce celulele au fost tratate (P < 0.01).="" în="" comparație="" cu="" cea="" a="" grupului="" h2o2,="" expresia="" grp78,="" chop="" și="" caspaze-12="" a="" scăzut="" semnificativ="" în="" grupele="" (phg-re)-h2o2="" și="" ({4-pba)-h2o2="" (p="">< 0,01)="" .="" în="" comparație="" cu="" cea="" a="" grupului="" tg,="" expresia="" grp78,="" chop="" și="" caspaze-12="" în="" grupul="" (phg-re)-tg="" a="" scăzut="">

3.6. Influența PhG-RE asupra JNK și p-JNK.

După cum se arată în Figura 6, în comparație cu cea a grupului de control, expresia p-JNK în grupurile H2O2 și TG a crescut semnificativ (P <0.01). în="" comparație="" cu="" cea="" a="" grupului="" h2o2,="" expresia="" p-jnk="" în="" grupele="" (phg-re)-h2o2="" și="" (4-="" pba)-h2o2="" a="" scăzut="" semnificativ="" (p="">< 0.{{24}="" }1).="" în="" comparație="" cu="" cea="" a="" grupului="" tg,="" expresia="" p-jnk="" în="" grupul="" (phg-re)-tg="" a="" scăzut="" semnificativ="" (p="">< 0,01).="" în="" ceea="" ce="" privește="" expresia="" jnk,="" nu="" au="" existat="" modificări="" semnificative="" în="" niciunul="" dintre="" grupurile="" experimentale="" (p=""> 0,05).

Cistanchepoate prevenicelulăapoptoza