Izolarea preparativă și purificarea a patru compuși din Cistanches Deserticola YC Ma prin cromatografie în contracurent de mare viteză

1. Introducere

Cistanches deserticolaYC Ma, o specie deCistancicare aparțineOrobanchaceaefamilie, este o Medicină Tradițională Chineză bine-cunoscută pentru tratamentul deficienței renale, infertilității feminine, leucoreei morbide, neurapraxiei și constipației senile [1]. Este o plantă parazită care este larg răspândită în nord-vestul Chinei. Până acum, mai mulți compuși, inclusivglicozide feniletanoide (PhG), iridoizii și lignanii au fost izolați de la această specie [2]. S-a raportat că unele dintre PhG posedă activități antioxidante, hepatoprotectoare și neuroprotectoare [3-6]. Cu toate acestea, procedura de izolare și purificare a PhG este dificilă și necesită timp. Mai mult, metodele clasice de cromatografie multiplă nu numai că folosesc o cantitate mare de solvenți organici, dar oferă și o recuperare mai mică a probei. Cromatografia în contracurent de mare viteză (HSCCC), o tehnică cromatografică de partiție lichid-lichid fără suport, oferă o recuperare excelentă a probei în comparație cu unele metode convenționale și a fost utilizată pe scară largă pentru separarea și purificarea diferitelor produse naturale [7–9] . Deși mai multe PhG au fost purificate dinCistancigen și altele de HSCCC [10–14], nicio lucrare nu a raportat purificarea actozidei, izoacteozidei, siringalidei A 3'- -L-ramnopiranozidă și 2'-acetillacteozidă într-un sistem bifazic.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

În această lucrare, raportăm o metodă simplă pentru separarea și purificarea a patru PhG din C. deserticola. În cele din urmă, s-au obținut 30},9 mg de aceozidă, 13,0 mg de izoacteozidă, 12,5 mg de siringalidă A 3'{- -L-ramnopiranozidă și 7,2 mg de 2'-acetilaceozidă într-o separare într-o singură etapă de la 297 mg de fracție cu purități de 99%, 95%, 99% și, respectiv, 98%. Structurile lor au fost caracterizate pe baza datelor spectrale 1 H- și 13C-RMN și a spectrelor HR-MS. Structurile celor patru PhG identificate în această investigație sunt prezentate în Figura 1.

2. Rezultate și discuții

2.1. Analiza HPLC a extractului brut

Fracția îmbogățită cu constituenți a extractului de n-butanol din C. deserticola a fost analizată prin HPLC-UV. Coloana folosită a fost un Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, oraș, prescurtare de stat, SUA), faza mobilă a fost metanol-apă (30:70, v/v). Debitul a fost de 1 ml/min. Lungimea de undă a detectorului a fost setată la 254 nm. Cromatograma HPLC este prezentată în Figura 2. Picurile 1 până la 4 corespund actozidei (1), izoacteozidei (2), siringalidei A 3'- -L-ramnopiranozidei (3) și, respectiv, 2'-acetilacteozidei (4). .

2.2. Selectarea sistemului de solvenți bifazici

Separarea reușită prin HSCCC depinde în mare măsură de selecția unui sistem de solvenți bifazici adecvat, sistemul de solvenți în două faze a fost selectat în funcție de valorile coeficientului de partiție (K) ale fiecărei componente țintă și un interval optim de K ar trebui să fie de la {{ 2}}.5 la 2.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂȚAREA IMUNITĂȚII PHGS75% ECH 30% ACT 12%

În experiment, valorile K pentru componentele țintă ale mai multor sisteme de solvenți în două faze sunt prezentate în Tabelul 1 (deși puțin mai mari pentru vârful 4, rezultatele s-au dovedit a fi acceptabile). Printre acestea, acetat de etil-n-butanol-etanol-apă (40:6:6:50, v/v/v/v) a dat coeficienți de partiție adecvați pentru compușii țintă. În cele din urmă, sistemul de solvenți compus din acetat de etil-n-butanol-etanol-apă (40:6:6:50, v/v/v/v) a fost folosit pentru a izola și purifica patru compuși ai C. deserticola, așa cum se arată în Figura 3. După cum se arată în Figura 2, analiza HPLC a fiecărei fracțiuni HSCCC a arătat că patru PhG pure (acteozidă, 99%; izoacteozidă, 95%; siringalidă A 3′- -L-ramnopiranozida 99% și 2′- acetillacteozida 98%) a putut fi obținută din fracția brută.

3. Experimental

3.1. Aparatură HSCCC

Echipamentul folosit în studiul de față a fost un sistem de cromatografie în contracurent de mare viteză TBE{{0}}B (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, China) cu trei coloane de separare a bobinei multistrat pregătitoare conectate în serie (diametru tub=2,6 mm, volum total=300 mL) și o buclă de probă de 2{{1{0}} mL. Raza de rotație sau distanța dintre axa suportului și axa centrală a centrifugei (R) a fost de 5 cm, iar valoarea a variat de la 0,5 la terminalul intern până la 0,8 la terminalul extern (=r/R, unde r este distanța de la bobină la arborele suport). Un instrument de circulație cu temperatură constantă HX 105 (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Beijing, China) a fost folosit pentru a controla temperatura în experiment. Sistemul HSCCC a fost echipat cu o pompă cu debit constant de presiune medie model TBP-5002, un detector UV model TBP-2000 care funcționează la 254 nm și o stație de lucru model V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument Companie, Shanghai, China).

Echipamentul de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) folosit a fost un sistem Agilent 1200, care constă dintr-o pompă binară G1312A, un autosampler G1329A, un detector cu lungime de undă variabilă (VWD) G1314A, un compartiment de coloană termostat G1316A, un desertor G1379B și un dispozitiv Agilent. . Un alltech 3300 ELSD a fost folosit pentru detectarea purităților. Spectrometrele Agilent 6520 Q-TOF și Bruker AVANCE III 500-RMN au fost utilizate pentru identificarea structurală a compușilor. Spectrele 1H și 13C-RMN (la 500 și, respectiv, 125 MHz) au fost măsurate la temperatura camerei (22 grade/295,1 K).

3.2. Reactivi și materiale

Acetatul de etil, n-butanolul și etanolul au fost de calitate analitică, iar metanolul a fost de calitate HPLC. Toți solvenții au fost achiziționați de la Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, China). Apa Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, SUA) a fost utilizată pentru toate soluțiile și diluțiile. Rizomul de C. deserticola a fost colectat din provincia Mongolia Interioară, Republica Populară Chineză, în iunie 2009. Planta a fost identificată de prof. Lijuan Zhang, iar un exemplar de voucher (nr. 20091001) a fost depus în laboratorul nostru.

3.3. Pregătirea probei brute

Tulpinile cărnoase pulbere uscate la aer de C. deserticola (1 kg) au fost refluxate de două ori cu etanol apos (8 L, 60% v/v) timp de 2 ore de fiecare dată. Extractul a fost evaporat sub presiune redusă și la o temperatură de 60 de grade până la evaporarea totală a etanolului. Reziduul a fost suspendat în apă şi extras succesiv de trei ori cu cloroform, acetat de etil şi n-butanol, obţinându-se 5,16 g de extract de n-butanol după evaporare la sec sub presiune redusă. Extractul n-butanoic a fost apoi separat pe o coloană de silicagel (200–300 mesh) folosind eluare cu gradient progresiv (CHCl3–MeOH, 10:1 → 1:1) pentru a da opt fracții. Fracția 6 (297 mg) a fost utilizată pentru izolarea și separarea ulterioară a HSCCC.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA MEDICAMENTE TRADIȚIONALE CHINEZE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Selectarea sistemelor de solvenți în două faze

Sistemele de solvenți în două faze au fost selectate în funcție de coeficientul de partiție (K) al componentelor țintă din fracția de C. deserticola. Valorile K au fost determinate prin analiză LC după cum urmează: O cantitate adecvată de pulbere de extract brut (fracțiunea 6) a fost dizolvată în faza inferioară a sistemului de solvent și analizată prin HPLC. Zonele vârfurilor au fost înregistrate ca A1. Apoi, volum egal al fazei superioare a fost adăugat la soluție și amestecat bine pentru a ajunge la echilibrul de partiție. Faza inferioară a fost apoi analizată din nou prin HPLC. Aceste din urmă zone de vârf au fost înregistrate ca A2. Valorile K au fost calculate conform următoarei ecuații: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Prepararea unui sistem de solvenți bifazici și a unei soluții de probă

În studiul de față, sistemul de solvenți în două faze compus din acetat de etil-n-butanol-etanol-apă (40:6:6:50, v/v/v/v) a fost utilizat pentru separarea HSCCC. Fiecare solvent a fost adăugat într-o pâlnie de separare și echilibrat complet la temperatura camerei. Faza superioară și faza inferioară au fost separate și degazate prin sonicare timp de 30 de minute cu puțin timp înainte de utilizare. Soluția de probă a fost preparată prin dizolvarea a 297 mg de Fracție 6 în 15 ml de faza inferioară de acetat de etil-n-butanol-etanol-apă (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. Procedura de separare HSCCC

HSCCC a fost efectuat după cum urmează. Coloana spiralată multistrat a fost mai întâi umplută cu faza staționară organică superioară. Faza mobilă apoasă inferioară a fost apoi pompată în capătul de cap al coloanei la un debit de 1,5 ml/min și, în același timp, aparatul HSCCC a fost rulat la o viteză de rotație de 900 rpm. După ce s-a stabilit echilibrul hidrodinamic, așa cum este indicat de o fază mobilă clară care eluează la ieșirea din coadă (aproximativ două ore mai târziu), o soluție de probă de 15 ml care conține 297 mg de extract brut (fracțiunea 6) a fost injectată prin supapa de injecție. Efluentul coloanei a fost monitorizat continuu sub 254 nm. Patru fracții de vârf au fost colectate conform cromatogramei și apoi evaporate sub presiune redusă. Temperatura aparatului a fost setată la 25 de grade.

3.7. Analiza HPLC și identificarea fracțiilor de vârf HSCCC

Fracțiile de vârf din HSCCC au fost analizate prin HPLC-ELSD. Coloana utilizată a fost un Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm), iar faza mobilă a fost metanol-apă (30:70, v/v). Debitul a fost de 1 ml/min. ELSD a fost operat în următoarele condiții: Temp 45 grade, gaz 1,6 L/min. Identificarea structurală a celor patru fracții de vârf HSCCC a fost efectuată prin spectroscopie HR-ESI-MS, 1 H și 13C-RMN.

3.8. Identificarea structurală

Fracția I: HR-ESI-MS observată la m/z 623,2001 (M-H)-, calculat pentru C29H35O15, 623,1981. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 al ramnozei), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH{24}}), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucoză), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34) }} de ramnoză), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH{=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, H aromatic). 13C-RMN (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C{-2), 146,2 (C{-3), 144,7 (C{-4 ), 116,4 (C{-5), 121,3 (C{-6), 72,4 (C- ), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf{-1), 115,3 (Caf{{{89} }}), 146,9 (Caf{-3), 149,8 (Caf{-4), 116,6 (Caf{-5), 123,2 (Caf{-6), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf- ), 148,1 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc{-2), 81,7 (Glc{-3), 70,5 (Glc{-4 ), 76,3 (Glc{-5), 62,4 (Glc{-6), 103,1 (Rha{-1), 72,3 (Rha{-2), 72,1 (Rha{-3 ), 73,9 (Rha{-4), 70,7 (Rha{-5), 18,5 (Rha{-6). În comparație cu datele date în literatură [17], fracția I corespunde actozidei.

Fracția II: HR-ESI-MS observată la m/z 623,1987 (M-H)-, calculat pentru C29H35O15, 623,1981. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 de ramnoză), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH{2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucoză), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 de ramnoză), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH{=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH{=CH-), 6,5–7,0 (6H, H aromatic). 13C-RMN (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C{-2), 146,2 (C{-3), 144,7 (C{-4 ), 116,5 (C{-5), 121,3 (C{-6), 72,4 (C- ), 36,7 (C- ), 127,8 (Caf{-1), 115,2 (Caf{{{89} }}), 146,8 (Caf{-3), 149,7 (Caf{-4), 116,6 (Caf{-5), 123,2 (Caf{-6), 169,2 (Caf-), 115,0 (Caf- ), 147,3 (Caf- ), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc{-2), 84,2 (Glc{-3), 70,1 (Glc{-4 ), 75,7 (Glc{-5), 64,7 (Glc{-6), 102,8 (Rha{-1), 72,4 (Rha{-2), 72,4 (Rha{-3 ), 74,1 (Rha{-4), 70,5 (Rha{-5), 17,9 (Rha{-6). Datele spectrale 1H-RMN și 13C-RMN au fost în acord cu cele ale izoacteozidei, așa cum este raportat în literatură [18].

Fracția III: HR-ESI-MS observată la m/z 6{{108}}7,2032 (M-H)-, calculat pentru C29H35O14, 607,2032. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 de ramnoză), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucoză), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{ {35}} de ramnoză), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH{=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6–7,1 (7H, H aromatic). 13C-RMN (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C{-2), 130,9 (C{-3), 156,8 (C{-4 ), 130,8 (C{-5), 116,2 (C{-6), 72,4 (C-), 36,4 (C- ), 127,8 (Caf{-1), 114,8 (Caf{{{88) }}), 149,8 (Caf{-3), 146,9 (Caf{-4), 116,6 (Caf{-5), 123,2 (Caf{-6), 168,3 (Caf-), 115,4 (Caf- ), 148,0 (Caf- ), 104,3 (G{-1), 76,3 (Glc{-2), 81,7 (Glc{-3), 70,4 (Glc{-4 ), 76,1 (Glc{-5), 62,5 (Glc{-6), 103,0 (Rha{-1), 72,3 (Rha{-2), 72,2 (Rha{-3 ), 73,9 (Rha{-4), 70,7 (Rha{-5), 18,4 (Rha{-6). Conform literaturii [18], fracția III corespundea siringalidei A 3'- -L-ramnopiranozidei.

Fracția IV: HR-ESI-MS observată la m/z 665,21{{20}} (M-H)-, calculat pentru C31H37O16, 665,2087. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J{16}},5 Hz, CH3 de ramnoză), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucoză), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H{-1 de ramnoză), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH{=CH-), 7,62 (1H, d , J=15,5 Hz, Ar-CH{=CH-), 6,5–7,0 (6H, H aromatic). 13C-RMN (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C{-2), 146,1 (C{-3), 144,7 (C{-4 ), 116,4 (C{-5), 121,4 (C{-6), 72,7 (C- ), 36,4 (C- ), 127,7 (Caf{-1), 115,4 (Caf{{{93} }}), 146,9 (Caf{-3), 149,9 (Caf{-4), 116,6 (Caf{-5), 123,2 (Caf{-6), 168,1 (Caf-), 114,7 (Caf- ), 148,2 (Caf- ), 101,8 (G{-1), 75,3 (Glc{-2), 80,3 (Glc{-3), 70,8 (Glc{-4 ), 76,2 (Glc{-5), 62,3 (Glc{-6), 103,3 (Rha{-1), 72,0 (Rha{-2), 71,8 (Rha{-3 ), 73,7 (Rha{-4), 70,8 (Rha{-5), 18,5 (Rha{-6), 171,5 (C{=O), 20,9 (OAC). Datele spectrale 1H-RMN și 13C-RMN au fost în acord cu cele ale 2’-acetilacteozidei [17].

4. Concluzii

A fost stabilită o metodă HSCCC pentru separarea și purificarea preparativă a actozidei, izoacteozidei, siringalidei A 3'- -L-ramnopiranozidei și 2'-acetilacteozidei din Cistanches deserticola YC Ma. Prezentul studiu indică faptul că HSCCC este o tehnică foarte puternică pentru separarea și purificarea preparativă a componentelor bioactive din materiale vegetale. De asemenea, compușii pot fi izolați la o scară suficient de mare cu purități ridicate și pot fi apoi utilizați ca substanțe de referință pentru cromatografie sau studii de bioactivitate. Metoda este o tehnică fezabilă, economică și eficientă pentru izolarea rapidă pregătitoare a produselor naturale complicate.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%