Efectele preventive ale glicozidelor de feniletanol din Cistanche Tubulosa

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You, și colab

Abstract

Fundal:Cistanchetubuloasaeste un medicament tradițional chinezesc pe bază de plante care este utilizat pe scară largă pentru reglarea imunității.Feniletanolglicozide(CPhG) din această plantă sunt materialele în primul rând eficiente. Scopul acestui studiu a fost de a evalua efectele preventive și terapeutice ale CPhG asupra fibrozei hepatice induse de BSA la șobolani și a mecanismelor moleculare conexe care implică celulele stelate hepatice. Biejiarangan (BJRG), un alt medicament tradițional chinezesc din plante, a fost folosit ca control pozitiv.

Metode:În experimentele in vivo, 75 de șobolani SD au fost împărțiți aleatoriu în 6 grupuri: normali (tratați cu apă distilată), model (tratați cu BSA), medicament pozitiv (tratați cu BSA plus BJRG 600 mg/kg/zi) și tratați cu BSA. plus grupuri de CPhG (125, 250 și 500 mg/kg/zi). Indicii ficatului și splinei, nivelurile serice ale aspartat aminotransferazei (AST), alanin aminotransferazei (ALT), acidului hexadecenoic (HA), lamininei (LN), procolagenului de tip III (PCIII), colagenului de tip IV (IV-C), hidroxiprolinei (Hyp). ), și factorul de creștere transformator 1 (TGF- 1) au fost măsurate în ficatul de șobolan. Gradele histopatologice pentru fibroza hepatică au fost evaluate pentru fiecare grup utilizând colorarea tricrom H&E și Masson. Expresia TGF- 1, colagenul I (Col-I) și colagenul III (Col-III) au fost determinate printr-o metodă de colorare imunohistochimică. Aceste efecte au fost evaluate în continuare in vitro prin determinarea nivelurilor de expresie ale NF-kB p65 și Col-I prin analize PCR cantitative în timp real. Expresia proteinei Col-I a fost de asemenea examinată prin western blot.

Rezultate: Toate grupurile de doze (125, 250 și 500 mg/kg/zi) de CPhG au redus semnificativ indicele ficatului și splinei, au scăzut ALT, AST, HA, LN , PCIII, niveluri serice IV-C, conținut de TGF- 1 (P < 0.{01,="" p="">< 0,01="" și="" p="">< 0,01)="" și="" hyp="" conţinut.="" de="" asemenea,="" cphg="" au="" atenuat="" semnificativ="" umflarea="" celulelor="" hepatice="" și="" au="" prevenit="" eficient="" necroza="" hepatocitelor="" și="" infiltrarea="" celulelor="" inflamatorii.="" rezultatele="" imunohistochimice="" au="" arătat="" că="" cphg="" au="" redus="" semnificativ="" expresia="" tgf-="" 1="" (p=""><0,01, p=""><0,01 și="" p=""><0,01), col-i="" și="" col-iii.="" efectele="" in="" vitro="" ale="" cphg-urilor="" (100,="" 75,="" 50="" și="" 25="" ug/ml)="" asupra="" hsc-t6="" au="" arătat="" că="" cphg-urile="" au="" redus="" semnificativ="" expresia="" arnm="" a="" nf-kb="" p65="" și="" col-i,="" iar="" cphg-urile="" au,="" de="" asemenea,="" reglat="" în="" jos="" expresia="" proteinei="">

Concluzii:CPhG-urile au un efect semnificativ anti-fibroză hepatică și pot fi utilizați ca agenți hepatoprotectori pentru tratamentul fibrozei hepatice.

Cuvinte cheie:fibroza hepatica,Cistanche tubulosa,Feniletanolglicozidă,Chemokine BSA, Prevenire și terapie

FeniletanolglicozidăînCistanchetubuloasa

fundal

Fibroza hepatică este un răspuns de vindecare a rănilor la leziuni hepatice severe care apare în patogenia cronichepatitei induse de diverși factori. Acești factori sunt infecția virală, abuzul de alcool, colestaza și bolile metabolice și autoimune [1–3]. Acumularea progresivă a matricei extracelulare (ECM) și scăderea remodelării perturbă arhitectura normală a ficatului, ducând la fibroză hepatică [4]. Fibroza hepatică este critică pentru boala hepatică cronică și se dezvoltă adesea în ciroză ireversibilă și carcinogeneză. În prezent, nu există metode sau medicamente eficiente pentru tratamentul fibrozei hepatice. Prin urmare, este urgent să găsim un medicament anti-fibroză hepatică care să atenueze progresia leziunii hepatice la fibroză și cancer.

CistanchetubuloasaW (din familia Orobanchaceae) este o plantă parazită care este cultivată pe scară largă în regiunea de sud a Xinjiang din China [5]. Oamenii îl folosesc de obicei pentru a revigora rinichii, a hrăni sângele, a relaxa intestinul și a întârzia senescența. Este listat oficial în Farmacopeea Chineză [6].Cistanchetubuloasaconține o varietate de componente active. Acestea includFeniletanolglicozide(CPhG), iridoide și polizaharide. Ca unul dintre multele componente active dinCistanchetubuloasa, CPhGshave a prezentat efecte antioxidante convingătoare, anti-oboseală, neuroprotectoare și antiinflamatorii atât în ​​studii in vivo, cât și in vitro [7]. În ultimii ani, s-a raportat că CPhG-urile au efecte hepatoprotectoare. Mecanismele potențiale care stau la baza acestor efecte sunt eliminarea radicalilor liberi, protecția membranelor hepatice, imunoreglarea, inhibarea apoptozei, inhibarea exprimării AgHBs și AgHBe și inhibarea replicării ADN-ului HBV și altele [8-11]. Cu toate acestea, puține studii din literatură abordează efectul anti-fibroză hepatică al GPhC. Prin urmare, acest studiu și-a propus să investigheze efectul anti-fibroză hepatică al GPhC prin utilizarea unui model de fibroză hepatică indusă de albumină serică bovină (BSA) la șobolani. Mecanismele moleculare înrudite au fost investigate în celulele HSC-T6.

Metode

Produse chimice și reactivi

Un kit de hidroxiprolină (hidroliza alcalină) (Lot: 20140616) a fost achiziționat de la Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng (China). Trusele ELISA sandwich TGF- 1 pentru șobolani (Lot: 238240615) au fost achiziționate de la Lianke Biotech Co., Ltd. (China). Anticorpul Rabbit Anti-ColagenI (Lot: 140619), Anticorpul Rabbit Anti-Colagen III (Lot: 980788 W) și anticorpul Rabbit Anti-TGF- 1 (Lot: 140619) au fost furnizați de Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( China). Împreună cu ser normal de oaie (fluid de lucru) (Lot: WP141214), PV-6000(Lot: WK141225) și kit DAB (Lot: K136621D) au fost achiziționate de la Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (China). Detectarea anticorpilor primari a fost efectuată utilizând 2. Soluție de anticorpi (Alk-Phos.Conjugated, Anti-iepure) și 2. Soluție de anticorpi (Alk-Phos. Conjugat, Anti-șoarece) (lot: 272387) achiziționate de la Invitrogen Company (SUA) .

Albumina serică bovină (BSA) (Lot: SLBG8239V) a fost achiziționată de la Sigma (SUA). Înainte de utilizare, BSA a fost preparat la 18 g/L în soluție salină normală, bacteriile au fost îndepărtate prin filtrare și BSA a fost depozitată la 4 grade. Adjuvantul incomplet Freund care conține 1 g de lipide din păr de oaie (Lot: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co.,Ltd. (China)) a fost amestecat cu 2 g de parafină lichidă (Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (China), sterilizat într-o autoclavă cu abur și depozitat la 4 grade. Medicamentul pozitiv BJRG a fost obținut sub formă de tablete Biejiarangan de la Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (China). Stocurile de medicamente BJRG au fost preparate prin dizolvarea tabletelor BJRG în apă distilată în concentrație de 600 mg/kg.

Feniletanol glicozidăînCistancheare efecte preventive

Materiale vegetale

Cistanche tubuloasa(Familia Orobanchaceae) a fost achiziționată din regiunea Minfeng din Xinjiang din China. Materialul a fost autentificat de cercetătorul Jun Zhao, Laboratorul Cheie pentru Medicină Uighur, Institutul de Materia Medică din Xinjiang. Exemplare de voucher au fost depuse la Institutul de Materia Medica din Xinjiang.

Prepararea CPhG-urilor

Rizomi uscati si feliati deCistanchetubuloasa(6,0 kg) au fost extrase consecutiv sub reflux de trei ori cu etanol 70%, iar solventul a fost îndepărtat pentru a se obţine extractul etanolic. Extractele cu etanol au fost purificate utilizând rășină AB-8 pentru a obținefeniletanoidglicozide(CPhG-uri). Soluțiile stoc de CPhG utilizate pentru diferite grupuri de doze în studiile pe animale (500 mg/kg, 250 mg/kg și, respectiv, 125 mg/kg) au fost dizolvate în 0,5 procente (5 g/L) carboximetil celuloză ( sare de sodiu).

Cuantificarea CPhG

Conținutul a două componente (echinacozidă și actozidă) din CPhG a fost determinat prin HPLC utilizând o metodă raportată anterior (Zhang și colab. 2004)[12]. HPLC a fost efectuată utilizând un Shimadzu LC-10AHPLC echipat cu un detector UV. Coloana HPLC a fost o coloană Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). Faza mobilă izocratică a constat din metanol-acetonitril -1 procente de acid acetic (15:10:75, v/v/v). Eluarea a fost timp de 40 min și debitul a fost menținut la 0,6 mL/min. Temperatura coloanei a fost menținută constantă la 30 de grade. Detectarea UV a fost la 334 nm.

Animale și linie celulară HSC-T6

[Grad SPF] șobolani masculi adulți sănătoși Sprague–Dawley (SD) (180–220 g) au fost achiziționați de la Xinjiang MedicalUniversity Animal Center, numărul de licență: SCXK (nou) 2011–0004. Șobolanii au fost hrăniți cu mâncare fără agenți patogeni specifici (SPF). Toate procedurile legate de experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul de etică a animalelor al primului spital afiliat al Universității Medicale din Xinjiang. Șobolanii au fost găzduiți în cuști în condiții de mediu controlate (25 de grade și un ciclu lumină/întuneric de 12 ore) și au avut acces liber la hrana standard de peleți de șobolan și apă de la robinet. Sobolanii au fost aclimatizati inainte de tratament.

O linie de celule stelate hepatice imortalizate de șobolan, HSC-T6, a fost obținută de la Wuhan Procell Gene BiotechnologyCo., LTD. (Wuhan, China). Celulele HSC-T6 au fost cultivate în Mediu Vultur modificat de Dulbecco (Glucoză ridicată) (DMEM, Beijing, China) suplimentat cu 10% ser fetalbovin (Gibco, America de Sud), 100 UI/ml penicilină și 100 ug/ml streptomicina (Beijing, China). ) în incubator umidificat la 37 de grade cu 5 la sută CO2.

Leziuni hepatice induse de BSA și tratamente

Șaptezeci și cinci de șobolani SD au fost împărțiți aleatoriu în șase grupuri: normali (tratați cu apă distilată), model (tratați cu BSA), medicament pozitiv (tratați cu BSA plus BJRG 600 mg/kg/zi) și grupurile tratate cu BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/zi). Grupurile tratate cu BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/zi) au avut 13 șobolani în fiecare grup, iar celălalt grup a avut 12 șobolani în fiecare grup. Modelul de leziune hepatică indusă de BSA este împărțit în sensibilizare primară urmată de un atac imunologic) [13]. Cu excepția grupului normal, celorlalte grupuri li s-au administrat injecții subcutanate multiple cu 0,5 ml (9 mg/ml) adjuvant incomplet BSAFreund în ziua 1, ziua 15, ziua 22, ziua 29 și ziua 36 pentru sensibilizarea primară. La șapte zile după cea de-a cincea injecție, sângele a fost obținut prin plexul venos al retinei și a fost testat pentru anticorpi albumină serică. Anticorpul BSA în serul de șobolan a fost detectat prin metoda difuziei cu agar dublu. Injecția de atac a fost efectuată prin administrarea a 0,4 ml de BSA în soluție salină normală prin vena caudală la șobolani pozitivi la anticorpi BSA de două ori pe săptămână de zece ori. Concentrațiile și timpii de injecție au fost 5.00, 5.50, 6.00, 6.50,7.{00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 și 10.00 g/L în ziua 46 , ziua 50, ziua 53, ziua 57, ziua 60, ziua 64, ziua 67, ziua 71, ziua 74 și, respectiv, ziua 78. În grupul normal, soluția salină normală a fost utilizată pentru injecții imunologice primare (sensibilizare) și secundare (atac) în loc de BSA, iar alte condiții au fost aceleași cu cele din grupul model.

Grupului normal i s-a administrat oral apă distilată cu o doză de 10 ml/kg/zi. Grupului model i s-a administrat oral 10 ml/kg/zi 0,5% soluție CMC-Na. Grupului de medicament pozitiv i s-a administrat oral 600 mg/kg/zi BJRG. Grupurilor tratate cu BSA plus CPhG (125,250 și 500 mg/kg/zi) au fost administrate oral 125, 250 și, respectiv, 500 mg/kg/zi CPhG. La șobolani doza zilnică a continuat timp de două săptămâni după ultima injecție.

După perioada experimentală, șobolanii au fost ținuți timp de 12 ore înainte de hidrat de cloral 10% și apoi imediat eutanasiați. Probele de ser au fost colectate de la fiecare rata și imediat utilizate. Ficatii au fost recoltați în două scopuri: (1) conservarea în azot lichid pentru kiturile Hyp și (2) fixarea în formaldehidă 10% pentru examinări histologice și imunohistochimice. Întreaga durată a studiilor pe animale a fost de 93 de zile.

Feniletanol glicozidăînCistancheare efecte preventive

Indici hepatici și splinei

Ficatul și splina au fost disecate prin laparotomie și spălate cu soluție salină normală de 4 grade. După absorbția excesului de apă cu hârtie de filtru, ficatul și splina au fost cântărite pentru a calcula indicii corespunzători: greutatea relativă a organului=masa organului (g)/masa corporală individuală (g) × 100 la sută [14].

Analiza markerilor fibrozei hepatice

Efectul protector al CPhG împotriva leziunilor hepatice induse de BSA a fost evaluat prin măsurarea ALT și AST (analizor biochimic automat Mind ray, A086A0182). Dezvoltarea fibrozei hepatice și efectele tratamentului au fost determinate prin examinarea HA, LN, PC III și IV-C (analizor de chemiluminiscență, TaiGeKeXin, MP2808).

Conținut hyp și analiză TGF- 1

Nivelul de Hyp în țesutul hepatic a fost determinat printr-o metodă spectrofotometrică conform instrucțiunilor trusei. Nivelul de Hyp a fost exprimat ca Hyp (ug)/proteină (mg). Hyp (ug/mg)=(DO măsurată) - OD martor)/(OD blank OD standard)×5 (ug/ml) × 10/greutate umed țesut (ml/mg). Concentrația hepatică de TGF- 1 a fost detectată prin utilizarea truselor ELISA conform instrucțiunilor producătorului. Efectul inhibitor al CPhG asupra fibrozei a fost confirmat de nivelurile de expresie ale TGF- 1.

Examen histopatologic

Țesutul hepatic din aceeași parte a lobului stâng a fost rezecat și fixat în soluție de formaldehidă 10%. Țesuturile au fost colorate cu colorare convențională H&E și stricrom Masson pentru a observa modificările histopatologice la microscop cu lumină. Expresia colagenului de tip I, colagenului de tip III și TGF- 1 în țesuturile hepatice a fost analizată prin colorare imunohistochimică [15].

Imunohistochimia semi-cantitativă a fost efectuată conform metodelor raportate [16, 17]. Următoarele clasificări au fost utilizate pentru celulele pozitive TGF- 1: „-” indică aproape nicio expresie, 20=l; „plus” indică celule pozitive adunate individual în zona leziunii, 21=2; „plus plus” indică celule pozitive în grupuri mici adunate în jurul zonei leziunii, 22=4; „plus plus plus” indică celule pozitive dispersate exprimate ca 23=8. Rezultatele reprezintă o integrare ierarhică. Gradul cromogen de colagen de tip I și de tipul III de colagen au fost convertite în CRI pentru analiză statistică (grad cromogen × interval cromogen). Gradul cromogenic este împărțit în slab „plus”, moderat „plus plus” și puternic „plus plus plus”. Gama cromogenă este împărțită în „plus”, intervalul său cromogen < vizualizare="" 1/4;="" „plus="" plus”,="" gama="" sa="" cromogenă="" de="" vedere/4-2/4;="" „plus="" plus="" plus”,="" intervalul="" cromogen="" de="" vedere="" 2/4-3/4;="" „plus="" plus="" plus="" plus”,="" intervalul="" său="" cromogen=""> 3/4. Blinded scoring a fost efectuat de două persoane, unde „plus” este 1; „plus plus „este 2, „plus plus plus” este 3, iar „plus plus plus plus” este 4. Trei câmpuri de observare la microscop (mărire × 200) au fost selectate aleatoriu pentru fiecare secțiune, nivelul mediu al probelor fiind folosit ca un nivel semi-cantitativ.

Experimente cu celule

Celulele HSC-T6 au fost placate într-o placă de 96-godeuri. Inițial, celulele au fost cultivate cu DMEM care conține 10 procente FBS timp de 48 de ore. Mediul a fost apoi înlocuit cu DMEM fără FBS pentru a înfometa celulele timp de 12 ore. Celulele au fost apoi cultivate cu DMEM care a conținut 5,0 ng/mLTGF- 1 (fără FBS) timp de 24 de ore. În cele din urmă, diferite concentrații de CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml și 25 ug/ml), actozidă (6 ug/ml, 3 ug/ml și 1,5 ug/ml), și echinacozidă (500 ug/ml, 250 ug/ml, și 125 ug/ml) au fost efectuate în placă în godeuri de patru ori și incubate timp de 48 de ore.

Analiză PCR în timp real

Nivelul de expresie ARNm al NF-kB, p65 și colagenI a fost determinat prin PCR în timp real. Pentru a determina expresiile ARNm în celulele HSC-T6, celulele (4 × 105 celule) au fost însămânțate în plăci cu șase godeuri cu 3 mL DMEM cu 10% FBS și incubate peste noapte la 37 de grade și 5% CO2, după care Mediile de cultură celulară au fost schimbate cu DMEM fără ser. Apoi, CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml și 25 ug/ml), actozidă (6 ug/ml, 3 ug/ml și 1,5 ug/ml) și echinacozidă (500 ug/ml, 250 ug). /ml și 125 ug/ml) au fost adăugate în godeuri. După 48 de ore de incubare cu CPhG sau compoziții monomerice, ARN-ul total a fost extras folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, SUA) și agitat energic cu cloroform timp de 15 s. După ce a stat la temperatura camerei timp de 3 minute, lizatul a fost centrifugat la 12,000 x g timp de 15 minute la 4 grade. ARN-ul în faza apoasă a fost precipitat cu izopropanol, iar faza apoasă superioară a fost transferată într-un tub nou de microcentrifugă. ARN-ul a fost precipitat prin adăugarea de 0,75% etanol, după care tubul de microcentrifugă a fost centrifugat la 12,000 x g la 4 grade timp de cel mult 5 minute. Supernatantul a fost îndepărtat și ARN-ul a fost uscat la temperatura camerei timp de 5-10 minute. Seturi specifice de primeri (Sangon, Shanghai, China) care au fost utilizate pentru amplificarea actinei de șobolan [GenBank: NM_031144.3], Colagen I [GenBank: NM{_ 053304.1] și NF- Genele κB p65[GenBank: NM_199267.2] au fost proiectate folosind Primerul lot 3. Amorsele înainte (FW) și inverse (RV) au fost după cum urmează: Colagen I (FW: GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV: GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-kB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -actină (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Rezultatele au fost normalizate la ARNm al genei de menaj -actina ca control intern și sunt prezentate ca niveluri de ARNm relative.

Reacțiile au fost efectuate cu 8 μL IQ SYBR GreenSupermix, 1 μL 10 pM pereche de primeri, 8,5 μL apă distilată și 2,5 μL ADNc. Fiecare reacție în lanț a polimerazei a fost efectuată în următoarele condiții: 95 de grade timp de 3 minute, apoi 40 de cicluri de 10 s la 95 de grade, 30 s la 55 de grade și 10 s la 55 de grade - 95 de grade pentru extensie, urmate de măsurarea fluorescenței simple. Rezultatele finale au fost descrise cu valorile relative (2-ΔΔCt). Calculul și analiza au fost efectuate de sistemul iQ5 Real-Time PCR Detection System.

Analiza Western blot

Nivelurile de expresie a proteinei de colagen I (Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) au fost determinate prin Westernblotting [cu -actină (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, China) ca un control menajer. Extractele de celule întregi au fost preparate utilizând testul de radioimunoprecipitare (RIPA) (Thermo Scientific, SUA) cu 1% cocktail de inhibitor de Haltprotează (Thermo Scientific, SUA) și 1% cocktail-uri de inhibitor de fosfatază Halt (Thermo Scientific, SUA). Concentrația de proteine ​​a fost măsurată și cuantificată prin metoda Bradford [18]. Proteina (10–50 ug) a fost separată pe un gel SDS-PAGE 10% și transferată pe membrane PVDF (Millipore, SUA). Membranele au fost blocate timp de 1 oră la temperatura camerei cu 5% BSA și anticorpii primari (Anti-Colla gen I). anticorp, diluție 1:200 sau mAb de șoarece de -actină, diluție 1:5000) au fost incubate la 4 grade peste noapte. Alk-Phos corespunzător. anticorpii secundari conjugați au fost incubați la temperatura camerei. În cele din urmă, membranele au fost spălate de trei ori cu 1 × Tris-HClsaline cu 0,1 procente Tween 20, iar semnalele au fost scanate și vizualizate de GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Analiza densitometrică a fost efectuată pe proteinele de interes și normalizate la -actină prin software-ul GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -actina a fost folosită ca control intern.

analize statistice

Testul de normalitate Shapiro-Wilk și testul de omogenitate a varianței lui Levene au fost aplicate pentru a verifica normalitatea și omogenitatea varianței. Analiza varianței (ANOVA) urmată de testul post-hoc al lui Tukey a fost utilizată pentru a identifica diferențele statistice neomogene, date normal distribuite. Testul neparametric Kruskal-Wallis a fost utilizat pentru a analiza date care nu sunt distribuite în mod normal sau omogene. Rezultatele au fost exprimate ca medie ± SD. Semnificația a fost setată la P < 0.05.="" toate="" datele="" au="" fost="" analizate="" de="" software-ul="" spss="" 16.0="" (universitatea="" medicală="" din="">

Rezultate

Determinarea cantitativă a CPhGsCPhG înCistanchetubuloasaconţine douăFeniletanolglicozide, echinacozidă și acteozidă și conținutul lor în CPhG au fost determinate prin analiza HPLC (Fig. 1) a fi 42,71 ± 0,42 la sută și 14,27 ± 0,18 la sută, respectiv.

Indici hepatici și splinei

După cum a fost arătat în Tabelul 1, indicii ficatului și splinei ai grupului model au fost crescuți semnificativ [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" indicii="" ficatului="" și="" splinei="" ai="" medicamentului="" pozitiv="" bjrg="" și="" cphg="" la="" diferite="" grupuri="" de="" doze="" au="" fost="" semnificativ="" reduceți="" în="" comparație="" cu="" grupul="" model="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="" {="0.024," respectiv="" pspleen="0.070]." indicele="" ficatului="" și="" splinei="" au="" fost="" mai="" mici="" decât="" cei="" din="" grupul="">

Efectele CPhG asupra activităților ALT, AST și markerilor de fibroză hepatică

În studiul de față, nivelurile serice ale enzimelor hepatice AST și ALT au fost semnificativ crescute în grupul model, reflectând deteriorarea hepatocelulară la șobolanii cu fibroză hepatică indusă de BSA. Cu toate acestea, experimentele au arătat că tratamentul cu BJRG (600 mg/kg) și CPhGs (125, 250 și 500 mg/kg) a redus semnificativ AST[PAST < 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" respectiv]="" și="" alt="" [palt="0.117," palt="" {="0.139," palt="0.189" ,="" palt="0.255," respectiv]="" niveluri="" la="" șobolanii="" cu="" fibroză="" hepatică.="" (masa="">

Nivelurile de HA, LN, PC și IV-C la șobolanii model au crescut semnificativ [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" respectiv].="" comparativ="" cu="" grupul="" de="" modele,="" nivelurile="" de="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007,PHA=0.009," pha="0.023," respectiv],="" ln="" [pln="0,011," pln="" {="0,004," p="" ln="0,026," p="" ln="" {="0,069," respectiv],="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectiv]="" și="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" respectiv]="" la="" șobolani="" au="" fost="" semnificativ="" scăzute="" de="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" și="" cphg="" la="" grupuri="" de="" doze="" diferite="" (125,="" 250="" și="" 500="" mg/kg).="" )="" (tabelul="">

Conținut hyp și TGF- 1

Conținutul de colagen a fost de asemenea detectat prin măsurarea Hyplevels în țesutul hepatic. După cum se arată în Tabelul 4, nivelul mediu Hyp în grupul model a fost semnificativ mai mare decât în ​​grupul normal, dar a fost semnificativ scăzut în grupul BJRG și în diferitele grupuri de doze de CPhG.

Concentrația hepatică de TGF{{0}} din grupul model la șobolani a fost semnificativ crescută [P <0.001]. în="" comparație="" cu="" grupul="" model,="" nivelurile="" de="" tgf-="" 1="" ale="" medicamentului="" pozitiv="" și="" diferitele="" grupuri="" de="" doze="" de="" cphg="" au="" fost="" semnificativ="" scăzute="" [p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1=""><0,001,p tgf{{10="" }}="">< 0,001,="" respectiv="" ptgf-="" 1="">< 0,001].="" rezultatele="" sunt="" rezumate="" în="" tabelul="">

Examen histopatologic

Observațiile secțiunilor de țesut hepatic normal colorate cu H&E și tricromul Masson prezintă hepaticlobuli și sinusoide hepatice distincte. Structura țesutului hepatic la șobolanii model a fost dezordonată, iar țesutul hepatic și sinusoidele hepatice au fost înlocuite cu o cantitate mare de țesut conjunctiv. Cu toate acestea, citoarhitectura normală și mai puțin țesut conjunctiv au fost detectate în grupul de tratament decât cei din grupul model.

Colorarea H&E

În grupul normal, s-a observat integritatea structurală a lobulului hepatic fără zone portal anormale și sinusoide hepatice. Cordoanele hepatice erau aranjate într-o manieră ordonată, cu miezul rotund și clar. Nucleii sunt localizați în centrul celulei, cu citoplasmă abundentă. Doar zona portală are o cantitate mică de țesut fibros (Fig. 2a).

În grupul model, structura lobulară a fost grav deteriorată. Celulele hepatice au prezentat o degenerescență apoasă ușoară, mai ales degenerare balonică și/sau degenerare grasă. Au fost observate, de asemenea, formarea de infiltrare a celulelor inflamatorii, hiperplazie extensivă a țesutului fibros, formarea unui număr mare de sept fibros, lobuli divizați și proliferare semnificativă a celulelor hepatice. Aceste observații au confirmat succesul înființării modelului animal de leziuni imune la șobolan. fibroza hepatică (Fig. 2b).

În comparație cu grupul model, a existat o reducere a infiltrației celulelor inflamatorii în diferitele CPhG. De asemenea, au fost observate mai puține necroze și degenerare grasă a celulelor hepatice, precum și atenuarea fibrozei. CPhG a atenuat semnificativ patologia fibrozei hepatice induse de BSA la șobolani, a atenuat umflarea celulelor hepatice și a prevenit eficient necroza hepatocitelor și infiltrarea celulelor inflamatorii, sugerând că CPhG exercită un efect protector asupra fibrozei hepatice de șobolan indusă de BSA. (Fig. 2c–f).

Colorarea tricrom a lui Masson

În grupul normal, țesutul hepatic a fost normal. Zona portală hepatică a arătat un număr mic de fibre de colagen albastru, iar țesutul hepatic a fost structurat în mod normal (Fig. 3a). În comparație cu țesutul hepatic al grupului normal, țesutul fibros a proliferat de foița centrală și s-a extins în parenchimul hepatic. Fibrele de colagen s-au extins și s-au legat și au învăluit întregul lobul și au înconjurat vena centrală. Aceste efecte, împreună cu fibroza hepatocitară, deteriorarea structurală lobulară, fibroza periportală și formarea pseudolobulilor (Fig. 3b) au oferit dovezi că modelul a fost stabilit.

În comparație cu grupul model, fibrele de colagen din grupul de control pozitiv al medicamentului au fost ușor extinse spre exterior din zona portalului periferic (Fig. 3c). În comparație cu grupul model, fibrele de colagen din diferitele grupuri de doze de CPhG au fost reduse semnificativ, proliferarea fibrelor a fost inhibată și proliferarea țesutului fibros în parenchimul hepatic a fost redusă semnificativ. Aceste rezultate au sugerat că CPhG-urile au protejat șobolanii de fibroza hepatică indusă de BSA (Fig. 3d-f).

Colorație imunohistochimică

Este important că expresia colagenului de tip I și a colagenului de tip III joacă roluri esențiale în dezvoltarea fibrozei hepatice, iar generarea și depunerea lor în țesutul hepatic ar putea servi ca un factor determinant important al eficacității anti-fibrozei hepatice. Rezultatele sunt rezumate în Tabelul 5.

Colagen tip I

Grupul normal a exprimat colagenul de tip I în principal în vasele de sânge și în zona portalului. Grupul model a exprimat înalt colagen de tip I fibroză vasculară în zonele portal. În spațiul lui Disse, colorarea de colagen de tip I a fost observată ca o dungă sau ca o distribuție neregulată. Fibroseptele acoperite cu colagen pentru a forma pseudolobul. În aceste experimente, s-au format mai puține septuri fibroase pentru BJRJ (600 mg/kg) și grupuri diferite de doze de CPhGs (125, 250 și 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023 și PCol I=0.044, respectiv]. Rezultatele semicantitative au arătat că expresia colagenului lor de tip I a fost semnificativ mai mică în comparație cu grupul model (Fig. 4).

Colagen tip III

Colagenul de tip III a fost slab exprimat în grupul normal, iar zonele periferice din jurul venelor portale și hepatice au afișat o cantitate mică de galben fin în loc de fibre continue (Fig. 5a). În grupul model, fibrele de colagen au prezentat cordoane largi și groase, indicând o expresie puternică, localizată în principal în zonele portalului și țesutului fibros (Fig. 5b).

Fibrele de colagen de BJRJ (600 mg/kg) și diferite grupuri de doze de CPhG (125, 250 și 500 mg/kg) au fost filamentoase și distribuite în jurul venei centrale și zonelor portalului. În comparație cu grupul model, fibrele de colagen au fost semnificativ reduse, colorarea a fost pale și subțire, iar colorarea imunohistochimică a fost slab pozitivă (Fig. 5c-f). Aceste rezultate semi-cantitative arată că celulele exprimate pozitiv în grupele de doze pozitive și diferite [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 și PCol III=0.037, respectiv] au fost diferite de cele din grupul de modele.

TGF- 1

A existat o expresie redusă a TGIF- 1 în celulele hepatice normale de șobolan. Expresia a fost limitată la un număr mic de celule interstițiale (Fig. 6a). În grupul model, expresia TGF- 1 a fost distribuită pe scară largă în zona portală, spații fibroase, celule stelate hepatice, celule inflamatorii, peretele sinusoidal și citoplasmă. O anumită zonă portală a prezentat o expresie puternic pozitivă cu colorare galben-maronie (Fig. 6b)

A existat o cantitate mică de expresie în zona portală și septele fibroase ale BJRJ (600 mg/kg) și diferite grupuri de doze de CPhG (125, 250 și 500 mg/kg). Amploarea colorării pozitive în aceste grupuri a fost semnificativ redusă în comparație cu cea a grupului model. Colorarea celulelor interstițiale din septele fibroase și citoplasma celulelor inflamatorii a fost scăzută (Fig. 6c-f). Rezultatele semi-cantitative au arătat că BJRJ și diferite grupuri de doze de CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf{-="" 1="0.009," ptgf{-="" 1="0." 004,="" respectiv]="" au="" fost="" semnificative="" în="" comparație="" cu="" grupul="">

După cum sa menționat mai devreme în articol, TGF- 1 este o citokină importantă în patofiziologia fibrozei hepatice, stimulând producția de matrice extracelulară [19]. Am arătat că nivelul de TGF- 1 a crescut în grupul model într-o manieră în concordanță cu severitatea fibrozei hepatice. Nivelurile de expresie ale TGF- 1 în ficat au fost în concordanță cu nivelurile serice de TGF- 1. Acest lucru indică faptul că CPhG-urile pot reduce semnificativ fibroza hepatică datorită expresiei TGF- 1 prin participarea la sinteza și degradarea ECM.

Expresia colagenului de tip I, colagenului de tip III și TGF- 1 poate detecta procesul patologic al fibrozei hepatice. Nivelurile lor de expresie în grupurile de tratament au fost semnificativ scăzute și au ilustrat faptul că CPHG-urile pot îmbunătăți activitatea colagenazei, menținând echilibrul dinamic al sintezei și degradării ECM hepatice, întârziind și prevenind astfel formarea fibrozei hepatice.

NF-kB p65 și expresia colagenului I după intervenția medicamentului în celulele HSC-T6

Pentru a caracteriza semnalele fibrozei hepatice, au fost determinate două gene reglatoare cheie din ficat prin testul RT-PCR. Datele au arătat că celulele tHSC-T6 din grupul de control au avut niveluri mai scăzute de NF κB și ARNm de colagen de tip I. În schimb, TGF- 1 a indus celulele HSC-T6 să regleze în mod semnificativ NF-kB (P < 0.01)="" și="" arnm="" col-i="" (p="">< 0,01),="" cu="" niveluri="" mai="" mari="" decât="" cei="" din="" grupul="" de="" control.="" în="" prezența="" diferitelor="" concentrații="" de="" cphg,="" rezultatele="" nf-kb="" p65="" [p="" nf-kb="0.001" pentru="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-kb="0.002" pentru="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-kb="0.007" pentru="" 50="" ug/ml="" și="" p="" nf-kb="0.012" pentru="" 25="" ug/ml,="" respectiv]="" și="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," respectiv]="" au="" prezentat="" expresii="" reduse="" ale="" acestor="" arnm="" (="" fig.="">

Analiza Western blot a nivelului de colagen I după intervenția medicamentului în celulele HSC-T6

Figura 8 prezintă nivelurile de exprimare a proteinei de colagen I în celulele HSC-T6 ale diferitelor grupuri experimentale. Nivelul de expresie a proteinei de colagen I a scăzut semnificativ în diferitele grupuri de doze de CPhG (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, și 25 ug/ml) comparativ cu grupul TGF- 1.

Discuţie

CPhGs este un glicozid feniletanoid izolat și purificat din rizomul de Cistanche, care este folosit ca medicament tradițional chinezesc din plante. În ultimii ani, sa demonstrat că CPhGshad posedă o capacitate puternică de a preveni leziunile hepatice [20]. Prin urmare, ne-am propus să investigăm dacă CPhG-urile au efecte inhibitoare asupra fibrozei hepatitei de către fibroza hepatică indusă de BSA la șobolani. BJRG este frecvent utilizat ca medicament terapeutic pentru fibroza hepatică în China. Este realizat din carapace de broasca testoasa. Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis etc. au efectele de refacere a Qi-ului și a sângelui, ameliorarea oboselii, înmuierea nodurilor. În plus, studiile anterioare arată că are funcția evidentă de a bloca fibroza hepatică precoce, de a inhiba proliferarea celulelor de stocare a grăsimilor și de a reduce sinteza de colagen [21]. Prin urmare, BJRG a fost utilizat ca medicament pozitiv în acest studiu.

Modificările patologice ale fibrozei hepatice la șobolani induse de injecțiile cu BSA sunt similare cu cele din ciroza portalului uman [22]. CPhG-urile au atenuat în funcție de doză gradul de fibroză hepatică și au inhibat transformarea HSC în celule asemănătoare miofibroblastelor, au redus nivelurile ridicate de ALT serice, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 și indicele hepatic și au suprimat semnificativ expresia colagenului. I, colagenul III și TGF- 1 în țesutul hepatic.

Stadiile fibrozei hepatice sunt corelate cu aceste niveluri de HA, LN și IV-C, care ca markeri pot juca un rol în detectarea gradului de fibroză hepatică [23]. S-a raportat că HA este resursa majoră a matricei extracelulare. IV-C ca element esențial al membranei bazale va fi sintetizat în mod abundent și depus puternic în fazele anterioare ale hepaticei. Nivelurile serice ale LN și IV-C sunt indicii ratei de turnover a membranei bazale și arată gradul de fibroză în zona portală și capilarele sinusoidale [24]. PC III este un marker în diagnosticul fibrozei hepatice și al cirozei precoce, dar sensibilitatea și specificitatea acestuia nu sunt mari și nu există o diferență semnificativă între diferitele stadii de offibroză în multe referințe [24, 25]. Acest studiu a obținut un rezultat similar.

În plus, observațiile secțiunii colorate cu tricrom ale lui H&E și Masson prezintă țesuturi hepatice normale cu lobuli hepatici și sinusoizi hepatici diferiți. Structura ficatului din grupul model a fost dezordonată, iar țesutul hepatic și sinusoidul hepatic au fost înlocuite cu o cantitate mare de țesut conjunctiv. Cu toate acestea, a fost observată o îmbunătățire semnificativă în grupurile de tratament în comparație cu grupul model.

Important, expresia colagenului de tip I și de tip III joacă roluri esențiale în dezvoltarea fibrozei hepatice, a cărei blocare poate preveni și trata fibroza hepatică. Prin urmare, generarea și depunerea în țesutul hepatic de colagen de tip I și colagen de tip III ar putea servi ca un determinant important al eficacității anti-fibrozei hepatice. TGF- 1 este, de asemenea, o citokină profibrogenă importantă în leziunile hepatice și este activ biologic cu acțiuni farmacologice multiple[26]. Este necesar un echilibru între aceste acțiuni pentru a menține homeostazia tisulară. Expresia aberantă a TGF 1 este implicată în patogeneza bolilor hepatice [27, 28]. Se știe că TGF- 1 este o citokină crucială care este implicată în stadiile incipiente ale fibrozei hepatice. Stresul oxidativ declanșează TGF- 1, rezultând ca acesta din urmă să stimuleze producția și depunerea ECM [29]. Prin urmare, una dintre strategiile eficiente de producere a medicamentelor anti-fibroză hepatică este identificarea agenților anti-TGF- 1. Analiza imunohistochimică a arătat că expresiile de colagen de tip I, colagen de tip III și TGF- 1 ar putea detecta procesul patologic al fibrozei hepatice. Expresiile colagenului de tip I, colagenului de tip III și TGF- 1 în grupurile de tratament sunt scăzute, care au fost semnificativ mai mici în grupul de tratament cu doze mari de CPhG, în special, și au sugerat că CPhG este un colagen eficient de tip I, colagen de tip III. și inhibitor de TGF- 1. Probabil, CPhGs poate îmbunătăți activitatea colagenazei, menținând echilibrul dinamic al sintezei și degradării ECM, întârziind și prevenind astfel formarea fibrozei hepatice.

CPhG nu numai că ar putea ameliora fibroza hepatică indusă de BSA la șobolani, dar ar putea fi asociate și cu inhibarea activării HSC in vitro. Se crede că activarea HSC reprezintă etapa crucială a fibrogenezei. În acest studiu, rezultatele au ilustrat că administrarea de CPhG de la 25 la 100 ug/ml a atenuat remarcabil scăderea NF-kB p65, expresia ARNm de colagen I și expresia proteinei colagenului I în HSC.

NF-kB joacă un rol important în modularea răspunsului imun la infecții sau stimuli [30]. Acumularea de NF-kB în celulele hepatice poate duce la recrutarea de citokine/mediatori inflamatorii, inducând astfel dezvoltarea fibrozei [31, 32]. În plus, colagenul este, de asemenea, un indice sensibil care reflectă nivelul de fibroză și reprezintă aproximativ 50 la sută din totalul proteinelor din ficat fibros [33]. Prin urmare, am postulat că mecanismul molecular împotriva fibrozei hepatice este legat de inactivarea mediată de CPhG a exprimării NF-kB, în care beneficiul contribuie la roluri sinergice de atenuare a imunotoxicității și a stresului inflamator în tesuturile hepatice lezionate de BSA, corectând în continuare dismetabolismul la funcția de ameliorare.

Concluzii

În concluzie, studiile noastre indică faptul că CPhG atenuează semnificativ extinderea fibrozei hepatice indusă de BSA la șobolani. Mecanismul său se poate datora cel puțin parțial efectului inhibitor al CPhG asupra compoziției ECM și stimulării degradării ECM și/sau prin inhibarea directă a sintezei colagenului de tip I, colagenului de tip III și a expresiei TGF{{0 }}. Prin urmare, ne-am așteptat ca CPhG să poată fi utilizate în produsele de îngrijire a sănătății sau în medicamentele clinice pentru prevenirea fibrozei hepatice umane. Sunt necesare studii viitoare pentru a stabili eficacitatea CPhGs ca medicament puternic anti-fibroză hepatică.

Abrevieri

CPhG: glicozide anolice din cistanche;

BSA: albumină serică bovină;

HSC-T6: Celule stelate hepatice;

Hyp: Hidroxiprolină;

BJRG: Tablete CompoundBiejiarangan;

TGF- 1: factorul de creștere transformator 1;

ALT: alaninaminotransferaza;

AST: Aspartat aminotransferaza;

HA: acid hialuronic;

LN: Laminină; PC III: procolagen de tip III;

IV-C: colagen de tip IV;

NF-kB: Factor nuclear kappa-amplificator de lanț ușor al celulelor B activate;

RT-PCR: reacție în lanț de reverstranscriptază-polimerază;

SDS-PAGE: Electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă.

Interese concurente

Autorii declară că nu au interese concurente

Contribuții ale autorilor

TL, JZ, SPY, LM, MT și SLZ au conceput și proiectat experimentele. SPY, TL și JZ au analizat datele. SPY și JZ au scris manuscrisul. TL, LM și JZ au revizuit manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

Confirmare

Această cercetare a fost susținută de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (81260624). Autorii ar dori să-și exprime sincere mulțumiri profesorului Tao Liu pentru îmbunătățirile propuse pentru scrierea acestei lucrări.

Detalii autor

1Departamentul de Toxicologie, Școala de Sănătate Publică, Universitatea Medicală Xinjiang, No. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011Xinjiang Uyghur AutonomousRegion, China. 2Key Laboratory for Uighur Medicine, Institutul de MateriaMedica din Xinjiang, Urumqi 830004, China. 3Nu. 140 Xinhua South Road, Tianshan District, Urumqi 830000Xinjiang Uyghur Autonomous Region, China.

Click aici pentru a verificaCistanchetubuloasaproduse

Referințe
1. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Starea actuală a noilor terapii antifibrotice la pacienții cu boală hepatică cronică. Ther Adv Gastroenterol. 2011;4(6):391–417.
2. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Celule stelate hepatice și fibroză hepatică. Compr Physiol. 2013;3(4):1473–92.
3. Hernandez-Gea V, Friedman SL. Patogenia fibrozei hepatice. Annu Rev Pathol. 2011;6:425–56.
4. Sohrabpour AA, Mohamadnejad M, Malekzadeh R. Articol de recenzie: reversibilitatea cirozei. Aliment Pharmacol Ther. 2012;36(9):824–32.
5. Raven PH, Zhang LB, Ventenat O. Academia Chineză de Științe. a 23-a ed. China: Comitetul editorial al Florei Chinei; 2013. p. 1–16.
6. Comisia de Farmacopeea Chineză a Ministerului Sanitar al Republicii Populare Chineze. Farmacopeea chineză, partea 1. China: Editura industriei chimice; 2010. p. 126.
7. Yan GH, Tian JH, Long BW, Li N. Progresul cercetăriifeniletanoidglicozidedinCistanchetubuloasa. Central South Pharm. 2012;10:692–5.
8. Li J, Huang D, He L. Efectul Rou Cong Rong (Herba Cistanches Deserticolae) asupra toxicității reproductive la șoareci indusă de glicozidul Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J Tradit Chin Med. 2014;34(3):324–32.
9. Xing Y, Liao J, Tang Y, Zhang P, Tan C, Ni H și colab. ECA și inhibitori ai agregării plachetare de la Tamarix hohenackeri Bunge (plantă gazdă aHerbacistanci) crescând în Xinjiang. Pharmacogn Mag. 2014;10(38):111–7.
10. Jia Y, Guan Q, Jiang Y, Salh B, Guo Y, Tu P și colab. Ameliorarea colitei induse de sulfat de dextran sodiu la șoareci prin extract îmbogățit cu echinacozidăCistanchetubuloasa. Phytother Res. 2014;28(1):110–9.
11. Wong HS, Ko KM. Herba Cistanches stimulează ciclul redox al glutationului celular de către speciile reactive de oxigen generate de respirația mitocondrială în cardiomiocitele H9c2. Pharm Biol. 2013;51(1):64–73.
12. Zhang SJ, Liu L, Yu JY. ARP: O metodă RP-HPLC pentru determinarea simultană a echinacozidei și acteozidei în Herbie Cistanches. Chin Pharm J 2004; 39(10): 740-741.
13. Zhu QG, Fang BW, Zhu QN, Wu HS, Fu QL. Studiul modelului animal de fibroză hepatică a imunității indusă de albumina serică bovină. Chin J Pathol. 1993;22:121–2.
14. Qin DM, Wen ZP, Nie YR, Yao GM. Efectul extractelor de Cichorium glandulosum asupra fibrozei hepatice induse de CCl4-. Iran Red Crescent Med J. 2013;15, e10908.
15. Niu HM, Zeng DQ, Long CL, Peng YH, Wang YH, Luo JF și colab. Clerodane diterpenoide și flavonoide prenilate din Dodonaea viscosa. J Asian Nat Prod Res. 2010;12(1):7–14.
16. Li WW, Song XW, Wang HW, Shen BS, Wang QC. Corelarea NF-kB și stadializarea patologică a fibrozei hepatice la pacienții cu hepatită cronică B. Chin J Immunol. 2013;29(3):251–4.
17. Zhang GL, Shi XF, Ran CQ, Xu M, Zhu ZJ. Efectele saponinelor totale ale Panax notoginseng împotriva fibrozei hepatice la șobolani. Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiary. 2007;29:2212–4.
18. Rossi O, Maggiore L, Necci F, Koberling O, MacLennan CA, et al. Comparația testelor colorimetrice cu analiza cantitativă a aminoacizilor pentru cuantificarea proteinelor modulelor generalizate pentru antigene de membrană (GMMA). Mol Biotechnol. 2015;57(1):84–93.
19. Dang SS, Li YP. Progrese în înțelegerea rolului factorului de creștere transformator- 1 în patogeneza fibrozei hepatice. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2010;18:1631–6.
20. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z și colab. Efectul protector al actozidei asupra leziunilor hepatice imunologice induse de Bacilul Calmette-Guerin plus lipopolizaharidă. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.
21. Yang FR, Fang BW, Lou JS. Efectele pilulelor Fufang Biejia Ruangan asupra fibrozei hepatice in vivo și in vitro. World J Gastroenterol. 2013;19(32):5326–33.

22. Liu P, Fang BW, Liu C. Rolul factorului de creștere transformator 1 și receptorul său în fibrogeneza hepatică indusă imunologic la șobolani și efectul polizaharidei cordyceps asupra acestora. Chin J Hepatol. 1998;6:232–3.

23. Xu GG, Luo CY, Wu SM, Wang CL. Relația dintre stadializarea hepaticăfibroza și nivelurile biochimiei serice. HBPD INT. 2002;1:246–8.Tu și colab. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Pagina 12 din 13

24. Liu J, Wang JY, Lu Y. Markeri de fibroză serică în diagnosticarea fibrozei hepatice. BărbieJ Intern Med. 2006;145:475–7.

25. Li CZ, Wan MB, Zeng MD, Mao YM, Fan ZP, Cao AP și colab. Un studiu preliminar al combinației de parametri neinvazivi în diagnosticul fibrozei hepatice. Chin J Hepatol. 2001;9:261–3.

26. Chen YL, Li ZY. Relația dintre TGF- 1, PDGF-BB, CTGF și hepatita cronică B cu fibroză. Chin J Diffic Compl Cas. 2010;9:19–20.

27. Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, Ammanniti S, Pompili S, Melideo D, et al. Extractele de Boswellia serrata și Salvia miltiorrhiza reduc fibroza hepatică indusă de DMN la șoareci prin reglarea în jos a TGF-beta1. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012;16(11):1484–98.
28. Liu L, Li XM, Chen L, Feng Q, Xu LL, Hu YY și colab. Efectul gipenozidelor asupra căii TGF- 1/Smad în fibroza hepatică indusă de tetraclorura de carbon la șobolani. Intern J Integr Med. 2013;1:1–6.
29. Zhang BJ, Xu D, Guo Y, Ping J, Chen LB, Wang H. Protecția printr-un mecanism antioxidant al berberinei împotriva fibrozei hepatice de șobolan indusă de factori hepatotoxici multipli. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008;35(3):303–9.
30. Tornatore L, Thotakura AK, Bennett J, Moretti M, Franzoso G. Calea de semnalizare a factorului nuclear kappa B: integrarea metabolismului cu inflamația. Trends Cell Biol. 2012;22(11):557–66.
31. Luedde T, Schwabe RF. NF-kB în leziuni hepatice, fibroză și carcinom hepatocelular. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;8(2):108–18.
32. Petrasek J, Csak T, Szabo G. Toll-like receptors in hever disease. Adv Clin Chem. 2013;59:155–201.
33. Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H. Suplimentarea alimentară cu suc de afine îmbunătățește expresia hepatică a metalotioneinei și atenuează fibroza hepatică la șobolani. Plus unu. 2013;8, e58659.