Învățarea anterioară a fricii permite asimilarea rapidă a noilor amintiri de frică direct în rețelele corticale Partea 3

Design experimental

Reproductibilitatea datelor a fost evaluată cu diferite replici (Tabel S1). Primele experimente de inactivare CNQX în Te2 (Fig 1A-1C) au fost efectuate într-un număr mai mare de replici, deoarece au fost primele experimente pe care le-am efectuat și au servit la testarea ipotezei majore a studiului nostru. Animalele au fost a priori repartizate la diferite grupuri comportamentale într-o manieră echilibrată în funcție de greutate. Masculii din același pui au fost repartizați aleatoriu fiecărui grup experimental. Am abordat mai întâi ipoteza principală a studiului nostru, adică inactivarea corticală poate afecta în mod diferit consolidarea unei noi amintiri a fricii la șobolanii naivi experimental și la animalele care au învățat un eveniment anterior de frică.

Masculii au amintiri extrem de puternice deoarece au un instinct de supraviețuire mai puternic și o dorință de reproducere. Animalele care supraviețuiesc în sălbăticie trebuie să-și amintească o mulțime de informații geografice, tipuri de hrană, urme de prădători și locațiile membrilor grupului pentru a se adapta mai bine la mediu și pentru a proteja viața.

De exemplu, leii masculi trebuie să-și amintească statutul întregului teritoriu, relațiile de membru și locațiile concurenților pentru a proteja teritoriul și statutul acestora. Zebrele masculi trebuie să-și amintească locația surselor de apă și a hranei pe pajiști pentru a supraviețui și a se reproduce. O companie de sifone a difuzat odată un anunț în care arăta că un urs polar mascul își poate aminti un scafandru și mirosul său unic, astfel încât să-l poată identifica data viitoare când l-au văzut.

Prin urmare, masculii trebuie să aibă amintiri puternice în ceea ce privește protejarea teritoriului lor, furnizarea de hrană suficientă și reproducerea urmașilor. Acest lucru le face, de asemenea, subiecte importante în cercetarea umană, de exemplu, pentru a explora boli precum tulburările de memorie și boala Alzheimer.

În lumea umană, ne putem inspira și din memoria animalelor masculi. Expunerea continuă la lucruri noi, învățarea continuă și gândirea ne pot îmbunătăți memoria și adaptabilitatea și ne pot îmbunătăți standardele de viață și eficiența muncii. Prin urmare, să învățăm de la animalele masculi, să continuăm să acumulăm cunoștințe și experiență, să avem instincte puternice de supraviețuire și dorințe de reproducere și să creăm un viitor mai bun. Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria. Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche deserticola este un material medicinal tradițional chinezesc cu multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Eficacitatea cărnii tocate vine din diferitele ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid, polizaharide, flavonoide etc. Aceste ingrediente pot promova sănătatea creierului într-o varietate de moduri.

Faceți clic pe cunoașteți modalități de îmbunătățire a funcției creierului

În cazul diferențelor statistice între aceste grupuri, apoi am efectuat în cele din urmă grupuri de control suplimentare prin injectarea cu soluție salină. O abordare similară a fost aplicată experimentelor optogenetice, în care grupul de control AAV a fost efectuat numai după ce au fost detectate diferențe statistice între șobolanii naivi și antrenați anterior. Aceste programe experimentale ne-au permis să evităm grupurile de control inutile și utilizarea animalelor inutile, o problemă cheie în legislația europeană și italiană privind experimentarea pe animale (principiul 3 Rs).

Proceduri comportamentale

Toate experimentele au fost efectuate în timpul fazei de lumină a zilei (8 AM la 4 PM). Animalele au fost transportate singular de la instalație în camerele experimentale în diferite găleți transparente mici, în funcție de cerințele experimentale.

Antrenament auditiv: Prima sesiune comportamentală. Animale condiționate de frică auditivă (CS1-CS2). În acest grup, șobolanii au fost luați ușor din cușca lor de acasă și transportați din camera de locuit în camera izolată fonic. Odată acolo, animalele au fost plasate în interiorul aparatului de condiționare constând dintr-o cușcă neagră dreptunghiulară (35 × 40 cm) echipată cu o grilă de tije din oțel inoxidabil (1 cm în diametru, distanțate la 1,5 cm) conectată la o instalație de livrare șoc.

Șobolanii au fost lăsați netulburați timp de 1 minut. După acest timp, s-au administrat 7 stimuli condiționați (CS) constând dintr-un ton pur de 15 kHz de frecvență (15 s de durată fiecare, 80 dB, interval de încercare de 36 s). Ultimul 1 s din fiecare ton a fost asociat cu un US dureros (0,5 mA, 1 s). La sfârșitul sesiunii de condiționare, șobolanii au fost aduși înapoi în cușca lor de acasă.

Animale doar cu șoc (șoc-CS2). În acest grup, șobolanii au fost plasați în mod similar în interiorul aceluiași aparat de condiționare. Imediat după aceea, fiecare șobolan a fost supus la 7-șocuri de picioare (1 s, 0,5 mA) unul imediat după altul. La sfârșitul stimulării, animalele au fost aduse înapoi în cușca lor de acasă. Durata de permanență în cușca de condiționare a fost mai mică de 9 secunde. Studiile anterioare au arătat că această procedură permite evitarea proceselor asociative între stimulii dureroși și stimulii senzoriali [29,30].

Miros animale condiționate de frică (miros-CS2). În acest grup, șobolanii au fost plasați în aceeași cușcă neagră dreptunghiulară folosită în grupurile experimentale de mai sus și conectați la o configurație de livrare șoc. Șobolanii au fost lăsați netulburați timp de 2 minute. După acest timp, au fost administrate 7 CS constând din mirosuri de vanilie (10 s de durată fiecare, interval de probă de 24 s). Ultimele 1 s din fiecare miros au fost asociate cu un US dureros (0,5 mA, 1 s). Modulul de condiționare a fost plasat lângă o sursă de ventilație pentru a evita persistența stimulilor eliberați după compensarea acestora. Cusca a fost asigurata cu o grila superioara. Mirosurile au fost prezentate folosind un olfatometru cu diluție în flux. Aerul curat (1,5 L/min) a fost direcționat către o supapă solenoidală, care, atunci când a fost acționată, a trecut aerul într-o sticlă de 15 ml care conținea 10 ml miros de vanilie.

Animale doar cu ton (Tone-CS2). Șobolanii din acest grup au fost plasați în aceeași cușcă neagră și au fost prezentați cu tonul de 15-kHz (7 stimuli, 15 s de durată, 36 s ITI) livrat în absența SUA.

Animale preexpuse (Tone-CS1-CS2). Șobolanii au fost plasați în cușca de condiționare și, 1 min mai târziu, li s-a prezentat de 20 de ori doar tonul de 15-kHz, iar 24 de ore mai târziu același ton a fost asociat cu SUA devenind CS1.

Animale cu zgomot alb condiționat de frică (WN-CS2). În acest grup, șobolanii au fost plasați în cușca neagră dreptunghiulară și lăsați netulburați timp de 1 minut. După acest timp, au fost administrate 7 CS constând dintr-un WN (15 s de durată fiecare, 75 dB, 36 s interval între încercări). Ultimele 1 s din fiecare ton au fost asociate cu un US dureros (0.5 mA, 1 s). La sfârșitul sesiunii de condiționare, șobolanii au fost aduși înapoi în cușca lor de acasă.

Învățarea fricii auditive: Al doilea antrenament comportamental. La două săptămâni după procedurile descrise în paragraful de mai sus, animalele au fost antrenate pentru o altă sarcină diferită de condiționare a fricii auditive. Șobolanii au fost puși într-o cutie standard de jupuire, ca în lucrarea noastră anterioară [10], și lăsați netulburați timp de 2 minute. După acest timp, au fost livrate 7 CS constând din tonuri pure de 3 kHz de frecvență (8 s de durată fiecare, 80 dB, 22 s interval inter-probă). Ultimul 1 s din fiecare ton a fost asociat cu un US dureros (0,5 mA, 1 s). La sfârșitul sesiunii de condiționare, șobolanii au fost aduși înapoi în cușca lor de acasă.

Frica de reținere a memoriei. Reținerea memoriei fricii auditive dobândită recent la CS2 (3 kHz) a fost testată 4 zile mai târziu. Pentru experimentele de optogenetică, testul memoriei recente a fost efectuat cu livrare cu laser la 24 de ore după învățarea CS2-US, în analogie cu intervalul de timp la care am efectuat inactivarea corticală prin administrarea CNQX (adică, 24 de ore după Instruire). Șobolanii au fost obișnuiți cu un aparat diferit de cel folosit pentru condiționare și plasați într-o cameră diferită pentru a evita comportamentul de frică condiționat la indicii contextuale [10,62].

Noul aparat a constat dintr-o cușcă de plastic transparentă cu o latură vopsită în negru, închisă într-o cutie de atenuare a sunetului echipată cu un ventilator de evacuare, care a eliminat aerul odorizat din carcasă și a furnizat zgomot de fond de 60 dB. Animalele au fost lăsate să exploreze cușca timp de 5 minute pe zi în timpul sesiunii de obișnuire. În ziua testului de reținere a memoriei fricii, după 2 minute de explorare liberă, am livrat 4 CS2 de 3 kHz (8 s—22 ITI) ne urmate de niciun US.

Dacă cererea experimentală a cerut, șobolanii au fost apoi testați pentru reținerea memoriei fricii de la distanță, dobândită cu 2 săptămâni înainte de a doua încercare de condiționare a fricii auditive. În acest scop, la 7 zile după testul de reținere a memoriei fricii la tonul de 3-kHz, animalele au fost plasate într-un mediu nou (o cușcă cu dungi albe și negre) și apoi li s-a prezentat tonul de 15-kHz. Patru tonuri au fost prezentate la intervale de 36 de secunde.

Antrenament contextual: Prima sesiune comportamentală. Grup de condiționare a fricii contextuale (CtxA-CtxB). În acest grup, șobolanii au fost luați ușor din cușca lor de acasă, așezați într-o găleată și transportați din camera de locuit în camera izolată fonic. Odată acolo, animalele au fost plasate în interiorul aparatului de condiționare constând din cușca neagră dreptunghiulară menționată mai sus, echipată cu grila de tije din oțel inoxidabil conectată la o instalație de livrare șoc. Șobolanii au fost lăsați netulburați timp de 1 minut. După acest timp, s-au administrat 5 US (0,5 mA, 1 s) cu intervale de timp de 51 s. La sfârșitul sesiunii, animalele au fost aduse înapoi în cușca lor de acasă.

Grup numai pentru șoc (șoc-CtxB). Șobolanii, odată plasați în interiorul aparatului de condiționare, au primit imediat 5-șocuri de picioare (1 s, 0,5 mA) unul imediat după altul. Durata de permanență în cușca de condiționare a fost mai mică de 7 secunde. Studiile anterioare au arătat că această procedură permite evitarea proceselor asociative între stimulii dureroși și stimulii senzoriali [29,30].

Grup numai pentru șoc (șoc-CtxB). Șobolanii, odată plasați în interiorul aparatului de condiționare, au primit imediat 5-șocuri de picioare (1 s, 0,5 mA) unul imediat după altul. Durata de permanență în cușca de condiționare a fost mai mică de 7 secunde. Studiile anterioare au arătat că această procedură permite evitarea proceselor asociative între stimulii dureroși și stimulii senzoriali [29,30].

Noua condiționare contextuală a fricii și reținerea recentă a memoriei fricii. La două săptămâni după procedurile descrise în paragraful de mai sus, toate grupurile au fost instruite să asocieze un nou mediu contextual (modulul skinner box, plasat într-o cameră diferită) cu o US dureroasă (0,5 mA, 1 s) . Fiecare animal a fost plasat în interiorul noii camere și lăsat nederanjat timp de 2 minute. Apoi, a fost expus la 5 US separate la intervale de 30 s.

Reținerea memoriei fricii contextuale a fost testată la 4 zile după procedura de condiționare a fricii prin punerea din nou a șobolanilor în camera cutiei Skinner timp de 3 minute. Pentru experimentele de optogenetică, testul memoriei recente a fost efectuat cu livrare laser la 24 de ore după învățarea CtxB-US în analogie cu intervalul de timp la care am efectuat inactivarea corticală prin administrarea CNQX (adică, 24 de ore după antrenament). Dacă cererea experimentală a cerut, șobolanii au fost testați pentru reținerea memoriei fricii de la distanță prin punerea animalelor în context asociate cu SUA cu 2 săptămâni înainte de noua asociere.

Animalele au fost transportate în 2 găleți diferite în camerele de condiționare conform diferitelor proceduri contextuale.

Măsura de îngheț. În toate procedurile experimentale, evaluarea reținerii memoriei fricii a fost determinată ca un răspuns de îngheț [10], analizat ca absența completă a mobilității somatice, cu excepția mișcărilor respiratorii. Pentru fiecare animal, timpul (în secunde) petrecut în îngheț a fost măsurat offline de 2 observatori independenți care au fost orbiți de grupurile de animale.

Proceduri chirurgicale

Pentru a administra substanțele selectate în locurile țintă, șobolanii au fost anesteziați cu izofluran: inducerea a fost efectuată la 4% [vol/vol] în 2 L/min aer medical și extins la o expunere continuă la 2% [vol/vol]) când șobolanii au fost montați în aparatul stereotaxic.

S-a făcut o incizie a craniului și au fost găurite mici găuri pentru a permite pătrunderea unui ac de perfuzie 28-calibre. O seringă 10-ul Hamilton montată pe o pompă de perfuzie a fost folosită pentru a furniza substanțe. După perfuzii, acul a fost lăsat pe loc încă 3 minute. Incizia a fost apoi închisă cu cleme de rană din oțel inoxidabil și animalului i s-a administrat o injecție subcutanată cu ketoprofen analgezic/antiinflamator (2 mg/kg greutate corporală), iar animalul a fost ținut cald și sub observație până la recuperarea din anestezie.

Ca și în studiile anterioare [10,32–34], canularea animalelor a fost inutilă, compușii activi fiind administrați direct stereotaxic. Această procedură este avantajoasă deoarece se evită traumatismul chirurgical inerent procedurii de canulare permanentă, limitând astfel traumatismul la o singură penetrare a acului [10,32–34]. Într-adevăr, anestezia generală nu afectează semnificativ consolidarea memoriei [10,32–34]. Pentru a se asigura că timpul de administrare a compușilor legat de studiul de învățare a fost precis, astfel încât șobolanii să primească compușii selectați la aproximativ 1 oră și aproximativ 1 zi după antrenament, anestezia cu izofluran a fost indusă cu 5 minute înainte de momentul injecției planificate, de exemplu, la 55 de minute. min la șobolani tratați la 60 de minute după antrenament și 23 de ore și 55 de minute la animalele injectate la 24 de ore după antrenament. Fiecare șobolan a fost condiționat și apoi operat separat. Animalele aparținând diferitelor grupuri comportamentale au fost manipulate într-un mod intercalat.

Inhibitorul selectiv al receptorilor AMPA/kainat glutamat CNQX ({{0}}ciano-7-nitrochinoxalin{-2,3-dionă) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] a fost dizolvat în soluție salină sterilă (NaCI, 0,9%) și ajustat la pH 7,4 cu HCI. Inhibitorul sintezei proteinelor anisomicină (Merck, 125 ug/ul) a fost dizolvat în HCI echimolar, diluat cu soluţie salină sterilă şi ajustat la pH 7,4 cu NaOH. A fost utilizată soluție salină sterilă (0,9% NaCI) ca vehicul martor. Aceste substanțe au fost injectate bilateral la o viteză de 0,1 ul/min și un volum de 0,5 ul per loc la următoarele coordonate stereotaxice preluate din atlasul Paxinos și Watson [26], cu câmpul cortical Te2 referit la atlasul Zilles [25]:

Cortexul auditiv secundar (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Cortexul cingulat anterior (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Volumul de injectare (0.5 ul per loc) a fost selectat pe baza studiilor anterioare în care compușii activi au fost injectați în Te2 [10,34] și ACC [55,63] la șobolani adulți.

Pentru a inactiva hipocampul dorsal, compușii activi au fost injectați la un volum de 0,6 ul per situs la următoarele coordonate stereotaxice:

Hipocampul dorsal: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Leziunile ireversibile ale hipocampului dorsal au fost induse prin administrarea de NMDA (Tocris, 18 ug/ul, dizolvat în soluție salină sterilă, 0,4 ul per situs) la o rată de 0.1 ul/ min în puncte la coordonatele menționate mai sus. Aceleași coordonate au fost utilizate pentru controalele injectate cu soluție salină și animalele operate de simulare.

Retrobeads roșii (Lumafluor, diluție 1:2 în soluție salină, 0.6 ul) au fost injectate în BLA conform următoarelor coordonate: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8,3.

La sfârșitul experimentelor au fost verificate histologic urmele acului în cazul injecțiilor cu CNQX, anisomicină sau ser fiziologic sau extinderea leziunilor în cazul injecțiilor cu NMDA. Șobolanii au fost profund anesteziați și perfuzați intracardic cu formaldehidă 4%. Creierul lor a fost secționat la 30 μm pe un criostat. Secțiunile în serie colorate cu Nissl au fost preparate folosind procedura convențională și secțiunile au fost verificate histologic la un microscop mărit la 2,5x.

Experimente optogenetice

Injectarea virusului. Virusul adeno-asociat AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cireșul și vectorul de control AAV5:CaMKII -cireș au fost obținute de la University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, North Carolina, Statele Unite ale Americii). Titlul viral a fost 5:8 Titrul viral a fost de 5,8 × 10^12 vg/ml pentru ambii viruși. Utilizarea promotorului CaMKII permite exprimarea transgenei favorizând neuronii piramidali. Virușii au fost găzduiți într-un congelator de -80˚C. Infuziile virale care vizează Te2 sau ACC au fost efectuate la coordonatele stereotaxice de mai sus la volume de 0,5 ul pentru fiecare gaură. Virusul a fost injectat cu o viteză de 0,1 ul/min, iar acul a fost lăsat pe loc pentru încă 5 minute. Injecțiile virale au fost efectuate cu 4 săptămâni înainte de experimentele de optogenetică.

Iluminare.

Fibrele optice (Plexon, miez de 200/230 μm; 10 mm lungime) au fost implantate bilateral în BLA (AP=-2,8, L=± 5,4, V=-8,2 mm din bregma). Inhibarea optogenetică a proiecțiilor Te2 la BLA sau a proiecțiilor ACC la BLA a fost obținută prin utilizarea sistemului de stimulare optogenetică PlexBright cuplat la o diodă laser (Laserglow Technologies). Lumina galbenă (589 nm) este generată și trecută printr-o fibră optică. Densitatea de putere estimată la vârful fibrei optice a fost de 10 până la 15 mW pentru iluminarea locurilor de proiecție. În timpul reținerii memoriei fricii, emisia de lumină a fost inițiată cu 4 s înainte de apariția tonului, a persistat pe tot parcursul tonului și a fost oprită la 4 s după compensarea tonului. Animalele aparținând grupurilor de condiționare a fricii contextuale au primit stimulare luminoasă pe toată durata explorării contextului (3 min). Șobolanii au fost familiarizați cu cordonul de plasture timp de 2 zile înainte de încercarea de reținere a memoriei.

Imunohistochimie. La finalizarea experimentelor de optogenetică, șobolanii au fost anesteziați profund și perfuzați intracardic cu 4% PAF pentru a examina difuzia virusului. Creierele au fost disecate, depozitate peste noapte la 4°C și, în final, transferate în zaharoză 30%. Secțiunile coronale (30 μm) au fost tăiate pe un criostat și colectate în PBS. Secțiunile care plutesc liber au fost incubate într-o soluție de blocare timp de 1 oră la temperatura camerei. Apoi, au fost incubați în anticorp monoclonal primar de șoarece anti mCherry (diluție 1:500, Abcam) în soluția de blocare peste noapte la temperatura camerei. Ulterior, secțiunile au fost spălate cu PBS și incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu un anticorp secundar fluorescent AlexaFluor-568 anti-șoarece (1:600, Invitrogen) diluat în PBS. Secțiunile au fost spălate în PBS, montate cu medii de montare care conțineau DAPI (Vector) și acoperirea lamei.

Creierele șobolanilor care au suferit injecții NMDA au fost colectate în mod similar. Secțiunile care plutesc liber, după mai multe clătiri, au fost incubate cu anticorp monoclonal primar de șoarece anti-Neun (1:1, diluție 000, Merck) în soluția de blocare peste noapte la temperatura camerei. Ulterior, secțiunile au fost spălate cu PBS și incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu anticorp biotinilat de cal anti-șoarece (diluție 1:200, Vector). Complexul avidină-biotină (complex ABC 1:100, Vector, 2 ore și jumătate din incubare) a fost cuplat la diaminobenzidină (0,03%, Merck) pentru a colora Neun. Secțiunile au fost apoi clătite în PBS și transferate pe lame acoperite cu gelatină, deshidratate și acoperite cu o lamela.

Secțiunile de Te2 ale șobolanilor injectați retro margele au fost supuse incubației cu anticorp primar de iepure policlonal anti-Fos (1:2,000, Cell Signaling) în soluția de blocare peste noapte la RT. Ulterior, feliile au fost spălate cu PBS și incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu Alexa 488 anti-iepure (1:1,000, Invitrogen, în PBS). În cele din urmă, secțiunile imunomarcate au fost spălate în PBS, montate pe lame acoperite cu gelatină și acoperite cu un mediu de montare suplimentat cu DAPI.

Microscopie

Etichetarea mCherry a fost examinată utilizând un microscop confocal Zeiss Airyscan: s-au folosit două lasere (405 și 561 nm), fiecare corespunzând spectrului de emisie de vârf pentru DAPI (colorarea Nissl pentru nucleele celulare) și Alexa 568 (mCherry). ), respectiv. Pentru a analiza difuzia virusului la locurile de injectare, au fost obținute micrografii de Te2 și ACC ca imagini mozaic (fiecare a fost obținută folosind un obiectiv de 10 ×). Terminalele axonilor în BLA au fost analizate utilizând un obiectiv de 40 × ca un z-stivă de 10 secțiuni, distanțate la 1 μm (159 μm pătrat; fracțiune de zoom, 1,0).

Pentru animalele injectate cu retrobeads care au fost supuse imunomarcarii cFos, imaginile au fost obținute la o mărire de 40× (159 μm pătrat; fracțiune de zoom, 1.0) cu 3 lasere diferite, corespunzătoare spectrului de emisie de vârf pentru DAPI (colorarea Nissl pentru nuclee celulare), AlexaFluor 488 (cFos) și, respectiv, Texas Red (Retrobeads). Secțiuni de 0,7 μm au fost achiziționate de-a lungul unui 10-μm z-stiva. Numărul de nuclee care exprimă cFos, mărgele marcate și dublu pozitive (cFos+ margele marcate) a fost cuantificat pentru fiecare animal din regiunea Te2 la coordonatele anteroposterioare de la 6,7 ​​la 7,3 mm de bregma [10]. Datele au fost apoi mediate pentru a produce media fiecărui animal și rezultatele au fost comparate statistic. Imaginile secțiunilor cu colorare DAB a lui Neun au fost analizate utilizând software-ul Neurolucida conectat la un microscop printr-o cameră CCD color [10].

Analiza datelor și criterii de excludere

N pentru fiecare grup a fost stabilit a priori conform studiilor noastre anterioare [10,16,17], lucrări publicate anterior în domeniu (vezi ca referințe pentru ACC [6,22,55] și Te2 [10,59]), și prin estimări de putere G, conform următorului tabel (Tabelul 1):

Pentru fiecare analiză, am estimat un număr mediu final de 8 până la 10 animale pentru fiecare grup. Grupurile au fost conduse cu controale interne în aceeași sesiune experimentală (Tabelul S1). Având în vedere variabilitatea procedurilor chirurgicale și comportamentale, am inclus a priori un număr mai mare de subiecți experimentali (cu până la 15% mai mult) care în unele cazuri au îndeplinit criteriile experimentale și au fost incluși, evitând astfel o excludere arbitrară. În cazul studiilor hipocampale, pentru a evalua efectele injecțiilor NMDA și CNQX la intervale de timp distincte, am echilibrat numărul total de animale de control între șobolanii operați cu vehicul și simulat între diferitele grupuri.

Analiza comportamentală, inspecțiile histologice și numărarea celulelor au fost efectuate în orb. Animalele cu localizare inadecvată a urmei acului sau a leziunii în cazul leziunilor ireversibile NMDA au fost excluse din analiza datelor (Tabelul S1). În studiile farmacologice, am exclus 57 de animale peste un total de 465 de animale din cauza unei plasări incorecte a acului (22/255 pentru Te2, 31/179 pentru ACC și 4/31 pentru hipocamp). În studiile de urmărire, pe 21 de animale, am eliminat 3 subiecți la care injectarea de retrobeads a ratat BLA. În studiile de optogenetică Te2, pe un total de 30 de animale, am exclus 1 șobolan deoarece plasarea fibrelor optice nu a fost deasupra regiunii țintă, 1 șobolan. La urma urmei, virusul a fost absent în Te2 și 2 șobolani deoarece difuzia virusului a fost mai mică de 4,7% și, respectiv, 5,3% din aria Te2 la locurile de injectare. La șobolanii incluși în analiza statistică, difuzia minimă a virusului a fost de 39,6% la coordonatele stereotaxice mai anterioare și de 50,2% la coordonatele stereotaxice mai posterioare.

În mod similar, în experimentele de optogenetică ACC, pe un total de 32 de animale, 2 șobolani au fost eliminați deoarece plasarea fibrelor optice nu a fost deasupra regiunii țintă. Doi șobolani au fost excluși deoarece virusul din ACC a fost absent, 1 animal deoarece virusul se afla în cortexul motor secundar adiacent și 1 șobolan deoarece difuzia virusului a fost mai mică de 2,3% din aria ACC la locurile de injectare. La șobolanii rămași, difuzia minimă a virusului a fost de 33,3% la coordonatele stereotaxice mai anterioare și de 42,2% la coordonatele mai posterioare.

În studiile de leziuni NMDA, leziunile au vizat în principal regiunea CA1 a hipocampului dorsal. Extensia minimă (roșu) și maximă (roz) a leziunilor hipocampului pe întreaga zonă a hipocampului dorsal au fost de 23,2% și, respectiv, 53,5% la coordonatele stereotaxice mai anterioare și 28,3% și 62,3% la coordonatele mai posterioare. Pe un total de 73 de animale, 4 șobolani au fost eliminați pentru că leziunea era absentă, în timp ce alte 3 animale au fost aruncate deoarece extinderea leziunilor a fost mai mică de 5,0% (și anume 4,8%, 4,3%, 3,1). %) privind zona hipocampului la cele 2 coordonate.

Analiza conturului zonei a fost efectuată prin inspecție vizuală și cuantificare manuală folosind instrumentul de contur regiune al software-ului ZEN 3.0. Valorile ariei au fost apoi normalizate pe suprafața totală a regiunii. Coordonatele stereotaxice ale Te2, ACC și hipocampus au fost bazate pe atlasul Paxinos [26] și, în cazul Te2, cu câmpul cortical referit la atlasul Zilles [25].

analize statistice

Toate datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Toate datele au trecut testul lui Levene pentru egalitatea varianțelor. Astfel, statisticile parametrice au fost folosite pe parcursul tuturor experimentelor. Datele din 2 grupuri au fost comparate utilizând 2-testele t Student neîmperecheate. Comparațiile cu mai multe grupuri au fost evaluate utilizând un test ANOVA 1-modal cu testul post-hoc al lui Tukey. Pentru a aborda diferențele dintre și în cadrul grupurilor, am calculat un model ANOVA cu design mixt 3 × 2 cu un grup (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) ca între- variabila subiecților și condiția (înainte și după condiționarea recentă +injecție) ca variabilă în cadrul subiecților. Acolo unde interacțiunea grup × condiție a fost semnificativă, am efectuat o analiză simplă a efectelor principale și am ajustat fiecare valoare p cu corecția Bonferroni. Pentru fiecare model ANOVA mixt, am evaluat ipoteza sfericității prin testul Mauchly de sfericitate.

Parametrii statistici (adică valoarea exactă a lui n pentru fiecare grup, SEM, testul statistic, mărimea efectului și valoarea p exactă) sunt raportați în legende. Pentru dimensiuni egale ale eșantioanelor, mărimile efectului pentru testele t nepereche au fost determinate prin calcularea d-ului lui Cohen sau d-ului lui Glass în funcție de similitudinea SD-urilor în timp ce, pentru dimensiuni diferite ale eșantionului, Hedges'g. Corelațiile dintre numărul de celule și înghețarea au fost calculate folosind coeficientul Pearson. Pentru a determina dacă datele au îndeplinit ipotezele abordării statistice, am respins ipoteza nulă la nivelul P < 0.05. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind SPSS Statistics 22 (IBM).

Informatii justificative

S1 Fig. Mărirea urmelor acului de Te2 (A) și cortex ACC (B) injectate cu CNQX, selectate ca exemple. (C) Când au fost reprezentate în același context la 2 săptămâni după procedură, animalele doar cu șoc au prezentat un răspuns scăzut de frică, demonstrând că procedura nu a provocat înghețare condiționată în contextul în care a fost administrat șocul. (D) Rezultate similare ca în fig. 1 au fost obținute prin contrabalansarea celor 2 tonuri folosite ca CS (CS1, 3 kHz și CS2, 15 kHz) (testul t Student, t(14)=3.44, p {{{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) La șobolanii condiționați cu miros-CS, înghețarea la miros, la 2 săptămâni după condiționare, a fost ridicată chiar dacă a fost testată într-un mediu diferit în ceea ce privește contextul de condiționare, arătând astfel că frica a fost asociată în mod specific cu această livrare de indiciu. Bare de scară, 300 μm. ��P < 0,01. Toate datele sunt medii și SEM. Datele rezumate pentru S1 Fig pot fi găsite în informațiile justificative din fișierul numit S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Fig. Injecția CNQX a afectat reținerea amintirilor recente de frică auditivă la șobolani, unde generalizarea fricii a fost redusă doar printr-un ton pre-expunere sau prin folosirea unui ton de zgomot alb ca CS1. ANOVA cu design mixt 3 × 2 (efectul principal al grupului: F(2,42)=6.478, p {{1{0}}.00 4, η2=0. 236, efectul principal al condiției: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grupa × interacțiunea condiției F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) a arătat că înghețarea la tonul de 3 kHz înainte de asocierea sa cu SUA a fost mai mică la animalele care au primit pre-expunerea tonului de 15 kHz înainte de împerecherea 15 kHz-SUA (n=10, p=0,001) sau la șobolani condiționati la un zgomot alb (n=13 , p=0.008) în comparație cu animalele CS{1-CS2 (n=22) care au prezentat un răspuns variabil de generalizare a fricii. Cu toate acestea, după învățarea CS-US și injecțiile cnqx în cortexul Te2, memoria recentă a fricii a fost afectată în toate grupurile (p > 0,05). Efect principal simplu în cadrul grupurilor (înainte și după învățarea CS-US urmată de injectarea cnqx): CS1-CS2, p=0,025; Ton-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Toate datele sunt medii și SEM. Datele rezumate pentru S2 Fig pot fi găsite în Informații suport din fișierul numit S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Fig. (A) Exemplu aleatoriu de injecție cu retrobeads care vizează BLA. (B și C) Exemple de plasări de fibre optice deasupra BLA a animalelor injectate cu vectori AAV în Te2 (B) și cortexul ACC (C). Bare de scară, 500 μm.

Mulțumiri

Mulțumim Dr. E. Manassero pentru sprijinul și sfaturile continue.

Contribuții ale autorului

Conceptualizare: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Curatarea datelor: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Analiză formală: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Achiziție finanțare: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Ancheta: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologie: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Supraveghere: Benedetto Sacchetti.

Validare: Benedetto Sacchetti.

Scriere – schiță originală: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Scriere – recenzie și editare: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Referințe
1. Frankland PW, Bontempi B. Organizarea amintirilor recente și îndepărtate. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Neurobiologia consolidărilor, sau cât de stabilă este engrama? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Consolidarea memoriei. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Consolidarea memoriei și lobul temporal medial: un model de rețea simplu. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. De ce există sisteme de învățare complementare în hipocamp și neocortex: perspective din succesele și eșecurile modelelor conecționiste de învățare și memorie. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com