Efectul protector al extractului de Djulis (Chenopodium Formosanum) împotriva îmbătrânirii pielii induse de UV și de AGE prin atenuarea stresului oxidativ și a degradării colagenului Partea 1

Abstract: Îmbătrânirea pielii este un proces complex care implică fotoîmbătrânire și stres de glicație, care împărtășesc unele căi fundamentale și au mediatori comuni. Ele pot provoca deteriorarea pielii și degradarea colagenului prin inducerea stresului oxidativ și acumularea de specii reactive de oxigen (ROS). Chenopodium formosanum (CF), cunoscut și sub numele de Djulis, este o cereală tradițională din Taiwan. Acest studiu a investigat mecanismele de protecție ale extractului CF împotriva radiațiilor ultraviolete (UV) și a stresului indus de produsele finale de glicație avansată (AGE). Rezultatele au indicat că extractul CF a avut efecte puternice antioxidante și de captare a radicalilor liberi. Ar putea reduce generarea de ROS intracelular indusă de UV și inițiază sistemul de apărare antioxidant prin activarea căii de semnalizare a factorului nuclear eritroid 2-factorul 2 (Nrf2) înrudit/hemoxigenaza-1 (HO-1) în fibroblastele pielii umane. Extractul CF a modulat protein kinaza activată de mitogen (MAPK) și căile de semnalizare a factorului de creștere transformat-beta (TGF-) pentru a atenua îmbătrânirea pielii indusă de stresul oxidativ. În plus, rezultatele au arătat că extractele CF nu numai că au promovat sinteza colagenului, ci au îmbunătățit și degradarea colagenului indusă de îmbătrânire. Extractul CF a atenuat producția de ROS indusă de AGE și suprareglarea receptorilor pentru AGE (RAGE). Rezultatele generale sugerează că extractul de CF oferă o strategie anti-îmbătrânire eficientă prin prevenirea deteriorarii pielii din cauza stresului oxidativ și a pierderii de colagen, cu activități puternice antioxidante, anti-fotoîmbătrânire și antiglicație.

Glicozidul cistanchei poate crește, de asemenea, activitatea SOD în țesuturile inimii și hepatice și poate reduce semnificativ conținutul de lipofuscină și MDA din fiecare țesut, eliminând eficient diferiți radicali reactivi de oxigen (OH-, H₂O₂ etc.) și protejând împotriva daunelor cauzate de ADN. prin radicalii OH. Glicozidele feniletanoide Cistanche au o capacitate puternică de captare a radicalilor liberi, o capacitate de reducere mai mare decât vitamina C, îmbunătățește activitatea SOD în suspensia de spermă, reduc conținutul de MDA și au un anumit efect protector asupra funcției membranei spermatozoizilor. Polizaharidele Cistanche pot spori activitatea SOD și GSH-Px în eritrocite și țesuturi pulmonare ale șoarecilor senescenți experimental cauzate de D-galactoză, precum și pot reduce conținutul de MDA și colagen în plămâni și plasmă și pot crește conținutul de elastină, au un bun efect de curățare asupra DPPH, prelungește timpul de hipoxie la șoarecii senescenți, îmbunătățește activitatea SOD în ser și întârzie degenerarea fiziologică a plămânilor la șoarecii senescenți experimental. Cu degenerarea morfologică celulară, experimentele au arătat că Cistanche are o bună capacitate antioxidantă. și are potențialul de a fi un medicament pentru prevenirea și tratarea bolilor de îmbătrânire a pielii. În același timp, echinacozidul din Cistanche are o capacitate semnificativă de a elimina radicalii liberi DPPH și are capacitatea de a elimina speciile reactive de oxigen și de a preveni degradarea colagenului indusă de radicalii liberi și, de asemenea, are un bun efect de reparare asupra daunelor anionice a radicalilor liberi de timină.

Faceți clic pe Cistanche Herba pentru antioxidare

【Pentru mai multe informații:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Cuvinte cheie: Chenopodium formosanum; Djulis; radiații ultraviolete; produse finale de glicație avansată; stresul de glicație; specii reactive de oxigen

1. Introducere

Îmbătrânirea este definită ca rezultatul unei scăderi progresive a funcției fiziologice a celulelor și țesuturilor corpului. În timpul îmbătrânirii, acumularea de produse deteriorate afectează treptat capacitatea de organizare și reparare a țesutului. Pielea, fiind bariera protectoare pentru organism, este adesea supusă unor factori intrinseci și extrinseci ai îmbătrânirii [1]. Factorul extern predominant care contribuie la îmbătrânirea pielii este expunerea la radiațiile UV în lumina soarelui, numită fotoîmbătrânire [2]. Pe lângă stimulii de mediu, acumularea de AGE este considerată a fi un factor intern al îmbătrânirii cronologice care declanșează procesul de îmbătrânire a pielii prin stresul de glicație [3].

Atât ROS de mediu produs de lumina UV, cât și ROS endogen formate prin metabolismul oxidativ reglează stresul oxidativ celular și distrug matricea extracelulară bogată în colagen (ECM), care nu este doar semnul distinctiv al îmbătrânirii țesutului conjunctiv al pielii, ci și cauza majoră a deteriorării pielii. 4]. Deteriorarea legăturilor încrucișate de colagen slăbește integritatea structurală dermică și crește rigiditatea și fragilitatea rețelei de colagen, promovând astfel formarea ridurilor, pierderea elasticității și uscarea pielii [5].

Razele UVB sunt banda de undă cea mai dăunătoare a radiației solare care ajunge la pământ, ceea ce are ca rezultat stres oxidativ prin stimularea formării ROS și este implicată în hiperpigmentare, inflamație a pielii, imunosupresie, fotoîmbătrânire și carcinogeneză [6,7]. Este bine cunoscut faptul că Nrf2 acționează ca un regulator major al apărării antioxidante celulare împotriva fotoleziunilor cutanate mediate de radiațiile UV. Celulele pot elimina stresul oxidativ și pot preveni rănirea prin reglarea căii de semnalizare a proteinei 1 (Keap1) asociată cu ECH Nrf2/Kelch [8,9]. După expunerea la UV, producția excesivă de ROS activează MAPK și factorul nuclear-kappa B (NF-κB), care, la rândul lor, induce reglarea în sus a metalopeptidazelor matriceale (MMP), culminând cu degradarea colagenului și a elastinei. În plus, proteina activatoare 1 (AP-1) inhibă semnalizarea TGF și duce la o reducere a sintezei de procolagen [10,11].

AGE-urile sunt un grup eterogen de molecule format ca rezultat al glicației, o reacție spontană non-enzimatică între zaharurile reducătoare și grupările amino ale proteinelor [3]. Interacțiunea dintre AGE și un receptor specific de AGE (RAGE) declanșează generarea de ROS și modifică expresia genelor în tulburările legate de AGE, cum ar fi diabetul și insuficiența renală [12,13]. AGE-urile se acumulează în proteinele ECM la îmbătrânire, iar Nε -(1-carboximetil)-L-lizina (CML) produsă prin modificarea oxidativă este proteina glicata majoră la om [14,15]. În timpul îmbătrânirii intrinseci, AGE-urile sunt exprimate în epidermă și dermă și se poate observa o acumulare semnificativ crescută de AGE în zonele pielii expuse la soare [16]. În plus, UV îmbunătățește depunerea AGE-urilor prin glicarea rețelei de fibre elastice [17].

Chenopodium formosanum (CF), cunoscut și sub numele de Djulis, este o plantă comestibilă din Taiwan și este de obicei gătită cu orez sau mei ca aliment de bază. CF este considerat un aliment cu valoare nutritivă ridicată și o sursă de compuși bioactivi pentru sănătatea umană [18]. Pe lângă fibre alimentare abundente, amidon, aminoacizi esențiali cu conținut limitat de cereale și polifenoli [19,20], CF conține, de asemenea, o clasă de compuși cu o lungă istorie de utilizare medicinală, numiți fitoecdisteroizi [21–24]. Studiile anterioare au raportat că FC a prezentat mai multe activități biologice, inclusiv anti-obezitate [21], antihipertensiv [22], antihiperglicemic [25,26], hepatoprotector [27–29], anticancerigen [23,24,30,31], și proprietăți anti-îmbătrânire [19,32]. Cu toate acestea, nici efectele detaliate de protecție a pielii ale extractului CF și nici mecanismele de bază împotriva îmbătrânirii intrinseci și extrinseci a pielii asociate cu stresul oxidativ și de glicație nu au fost dezvăluite până în prezent. Scopul acestui studiu a fost de a clarifica efectele antioxidante ale extractului de CF și de a investiga mecanismele de apărare anti-îmbătrânire care stau la baza extractului de CF împotriva degradării colagenului de către UV și AGE în fibroblastele pielii umane.

2. Rezultate

2.1. Analiză cantitativă HPLC-ESI-MS/MS și MRM

Analiza conținutului de compuși bioactivi țintă din extractul CF a fost efectuată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)-masă/MS și metodele de monitorizare a reacțiilor multiple (MRM). Cromatograma ionică MRM și spectrul de masă pe modul pozitiv de ionizare prin electrospray (ESI) al 20-hidroxiecdizonei și standardului de rutină au fost prezentate în materiale suplimentare. Tranziția de la ionul precursor la m/z 481 la producția la m/z 371 pentru 20-hidroxiecdizonă (Figura S1a) și tranziția de la ionul precursor la m/z 611 la producția la m/z 3 Sunt prezentate 03 pentru rutina (Figura S1b). Figura S2 a arătat cromatograma ionică totală (TIC) și cromatograma ionică extrasă (EIC) a 20-hidroxiecdizonei (m/z 481) și rutina (m/z 611) în extractul CF. Conținutul de rutină și 20-hidroxiecdizonă în extractul CF a fost de 14,5 ± 0,4 mg/g și, respectiv, 19,5 ± 0,6 mg/g.

2.2. Activitatea antioxidantă și efectul de eliminare a radicalilor liberi al extractului CF

2.2.1. Activitate de eliminare a radicalilor liberi DPPH

DPPH este un reactiv utilizat în mod obișnuit pentru a estima activitatea totală de captare a radicalilor liberi a antioxidanților prin detectarea capacității extractelor de a furniza protoni de hidrogen. Rezultatul a arătat că extractul de CF a prezentat o activitate puternică de captare de 40,2% ± 3,3% la 50 µg/mL și 89,1% ± 2,6% la 500 µg/mL, în timp ce activitatea de captare a acidului ascorbic a fost de 96,6% ± 2,3 procente la 10 µg/mL (Figura 1a). Jumătate de concentrație maximă inhibitorie (IC50) a extractului de CF asupra captării radicalilor liberi DPPH a fost de 84,7 ± 13,0 ug/mL.

2.2.2. Reducerea capacității

Capacitatea de reducere a extractului CF observată în studiul de față este prezentată în Figura 1b. Capacitatea de reducere a extractului de CF a fost de 51,3 procente ± 1,0 procente la 100 pg/mL și 66,9 procente ± 1,7 procente la 1000 pg/mL. Capacitatea de reducere a acidului ascorbic martor comparativ (100 pg/ml) a fost de 79,7 la sută ± 1,2 la sută.

2.2.3. Superoxid Anion Radical (O2 -) Activitate de captare

Activitatea de captare a radicalilor anioni superoxid a fost de 82,2% ± 6,1% pentru 250 µg/mL BHA (control comparativ) și a variat de la 59,6% ± 3,5% la 73,1% ± 2,6% pentru 100-1000 µg/mL extract CF).

2.2.4. Activitate de captare a peroxidului de hidrogen (H2O2).

Activitatea de captare a peroxidului de hidrogen a variat de la 10,3% ± 1,1% la 61,1% ± 2,3% pentru 200-1500 µg/mL extract CF și a fost de 96,3% ± 2,0% pentru BHA (250 µg/mL) ( Figura 1d). IC50 al extractului de CF a fost de 956,5 ± 59,2 pg/mL pentru activitatea de captare a peroxidului de hidrogen.

2.2.5. Activitate de captare a radicalilor hidroxil (· OH).

Activitățile de captare a radicalilor hidroxil ale extractului CF (100–1000 µg/mL) și ale manitolului de control comparativ (µg/mL) sunt prezentate în Figura 1e. Activitatea de captare a radicalilor hidroxil a 1000 pg/mL extract CF a fost de 63,3 la sută ± 3,5 la sută, iar cea a manitolului (2500 pg/mL) a fost de 69,7 la sută ± 2,2 la sută. Efectul de captare al extractului de CF a fost similar cu cel al controlului comparativ, iar IC50 a CF pentru activitatea de captare a radicalilor hidroxil a fost de 240,7 ± 24,3 pg/mL.

2.2.6. Activitate de chelare a ionului feros (Fe2 plus).

Figura 1f a arătat activitatea de chelare a metalelor a extractului CF și a controlului comparativ EDTA. Activitatea a variat de la 6,5% ± 1,4% la 67,6% ± 2,5% pentru 100–1000 µg/mL CF extract și 97,5% ± 2,0% pentru 100 µM EDTA. IC50 a extractului CF a fost de 625,5 ± 46,0 pg/mL pentru chelarea metalelor.

2.3. Extractul CF a atenuat citotoxicitatea indusă de UV în celulele Hs68

Pentru a evalua efectul citotoxic al extractului de CF în fibroblastele pielii umane (celule Hs68), viabilitatea celulelor tratate cu extract de CF a fost evaluată prin test MTT. După cum se arată în Figura 2a, extractul CF nu a indus citotoxicitate în celulele Hs68 în intervalul de concentrație de 50-250 µg/mL; astfel, aceste concentrații au fost alese pentru următoarele experimente.

Celulele Hs68 au fost expuse la radiații UVB, iar viabilitatea celulei a fost determinată pentru a evalua efectul protector al extractului CF împotriva fotodeteriorării. Rezultatele au arătat că citotoxicitatea indusă de radiații UVB (20-100 mJ/cm2) în celulele Hs68 într-o manieră dependentă de doză (Figura 2b). Cu toate acestea, celulele Hs68 au fost expuse la UVB (80 mJ/cm2) și ulterior tratate cu extract CF (100, 150, 200 și 250 pg/mL) timp de 24 de ore; Extractul CF a atenuat semnificativ citotoxicitatea indusă de UV (Figura 2c).

2.4. Extractul CF a redus generarea de ROS intracelular indusă de UV în celulele Hs68

ROS poate induce proteinele legate de fotoîmbătrânirea pielii și transducția semnalului în aval, provocând stres oxidativ intracelular în pielea umană. Un colorant fluorogenic măsoară cantitatea de radicali liberi oxidativi din celule. După radiație cu UVB (80 mJ/cm2) timp de 2 ore, producția de ROS în celulele Hs68 a fost indusă de 2,16-ori în comparație cu cea din grupul neiradiat. Cu toate acestea, tratamentul cu 100-250 µg/mL extract CF a scăzut semnificativ generarea de ROS. ROS au fost reglate în jos de 1.64-ori în comparație cu grupul de radiații prin extract CF la 250 µg/mL (Figura 3).

2.5. Extractul CF a inițiat sistemul de apărare antioxidantă prin activarea căii de semnalizare Nrf2/HO-1 în celulele Hs68

2.5.1. Efectele extractului CF asupra expresiei induse de UV a Nrf2/HO-1

În condiții normale, Keap1 formează un complex cu Nrf2 și promovează ubiquitinarea și degradarea Nrf2. Cu toate acestea, calea de semnalizare Nrf2 este inițiată atunci când celulele sunt stimulate de stresul oxidativ din mediu. În acest studiu, celulele Hs68 au fost tratate cu extract de CF pentru a observa efectele sale asupra căii de semnalizare Nrf2 după radiația UV. După cum se arată în Figura 4, UVB (40 mJ/cm2) a indus de radiații expresia Nrf2 și a scăzut expresia Keap1, în timp ce extractul CF (250 µg/mL) a indus în mod semnificativ expresia Nrf2 de 2.4-ori în comparație cu grupul de radiații . După radiații UV și tratament cu extract de CF la 250 µg/mL, expresia proteică a HO-1 a crescut de 2.5-ori. Rezultatele au indicat că extractul CF ar putea iniția mecanismul de apărare antioxidantă prin calea de semnalizare Nrf2/HO-1 și ar putea proteja celulele de stresul oxidativ într-un sistem biologic.

2.5.2. Efectele extractului de CF asupra translocației nucleare induse de UV a Nrf2

Radiația UV promovează activarea Nrf2 și translocarea în nucleul celulelor. În acest studiu, testul de colorare cu imunofluorescență Nrf2 în fibroblastele pielii umane a fost efectuat pentru a determina nivelul de activare a Nrf2. Translocarea Nrf2 din citoplasmă în nucleu a crescut după radiația UVB, în timp ce translocarea a fost îmbunătățită și după tratamentul cu extract de CF (Figura 5). Rezultatele testului de colorare cu imunofluorescență au fost în concordanță cu expresia Nrf2 din Figura 4.

2.6. Calea de semnalizare celulară asociată cu fotoîmbătrânirea pielii cu extract de CF în celulele Hs68

2.6.1. Efectele extractului CF asupra expresiei induse de UV a MMP-1, -3, -9 și TIMP-1

Radiația UV induce fosforilarea MAPK, care declanșează transducția semnalului în aval pentru a activa factorul de transcripție AP{{0}} și a îmbunătăți expresia MMP. Atunci când pielea este expusă la stres oxidativ, MMP-urile sunt reglate, ceea ce apoi induce degradarea colagenului și formarea ridurilor. După cum se arată în Figura 6, radiația UVB a crescut semnificativ expresia MMP-1, -3 și -9 (de 2,2-ori, 1,3-ori și 1.5-respectiv, în comparație cu grupul de control), în timp ce extractul CF a atenuat expresia MMP-urilor. Tratamentul cu extract de CF la 250 µg/mL a suprimat în mod semnificativ nivelurile de exprimare indusă de UVB a MMP-1, MMP-3 și MMP{-9 de 1,1-ori, 0 .9-ori și, respectiv, 1.1-ori, în comparație cu grupul de control.

Inhibitorii tisulare ai metaloproteinazelor (TIMP) sunt inhibitori ai MMP-urilor exprimate în țesutul conjunctiv al pielii. Expresia TIMP-1 a fost scăzută după radiația UVB și îmbunătățită cu extract CF (100-250 µg/mL) (Figura 6). Aceste rezultate au demonstrat că tratamentul cu extract de CF a prevenit creșterea indusă de UV a nivelurilor MMP-1, -3 și -9 și reducerea TIMP-1; prin urmare, extractul CF poate reduce degradarea matricei extracelulare a pielii indusă de UV și poate menține integritatea structurală a dermului.

2.6.2. Efectele extractului CF asupra expresiei induse de UV a AP-1 și MAPK

Radiația UVB a suprareglat expresia pc-Jun și c-Fos (de 2,4- și 1,2-ori în comparație cu grupul de control), în timp ce acestea au fost reglate în jos de extractul CF (100–250 µg/ ml). Tratamentul cu extract de CF a scăzut semnificativ expresia pc-Jun și c-Fos la 250 µg/mL (Figura 7a). Figura 7b a arătat că expunerea la UVB a crescut expresia fosforilării p38 și ERK la 2.1- și 1.5-ori față de nivelurile totale de proteine ​​din celulele Hs68. Cu toate acestea, tratamentul cu extract CF (100–250 µg/mL) a inhibat semnificativ supraexpresia MAPK indusă de UVB. Fosforilarea p38 și ERK a fost suprimată la niveluri bazale cu o concentrație de 250 ug/mL de extract CF. În plus, extractul de CF ar putea inhiba supraexprimarea AP-1 indusă de UV, protejând pielea de fotoîmbătrânire.

2.6.3. Efectele extractului de CF asupra exprimării inhibate de UV a TGF- și Smad3

TGF- joacă un rol central în sinteza matricei extracelulare și controlează homeostazia colagenului în dermul uman. Creșterea ROS în fibroblaste afectează semnalizarea TGF- prin reglarea în jos a expresiei TGF- și Smad3, ceea ce duce la pierderea de colagen și distrugerea țesutului dermic în pielea îmbătrânită. În mod similar, în studiul nostru, radiația UVB a redus expresia TGF- și Smad3 pentru a inhiba sinteza colagenului. Comparativ cu grupul de control, expresia TGF- și Smad3 au fost mai mici în grupul iradiat cu UVB; cu toate acestea, extractul CF (100–250 µg/mL) a restabilit semnificativ expresia proteinei (Figura 8).

2.7. Producția de ROS indusă de AGE și expresia RAGE în celulele Hs68 cu extract de CF

Pentru a investiga efectul extractului de CF asupra stresului de glicație, celulele Hs68 au fost tratate cu LMC. După tratarea celulelor cu LMC (100 pg/mL) timp de 6 ore, cantitatea de ROS generată a fost de 1,92-ori mai mare decât cea din grupul netratat. Cu toate acestea, tratamentul cu extract de CF (100–250 µg/mL) a scăzut semnificativ producția de ROS. ROS a fost reglat în jos de 1.30-ori în comparație cu grupul tratat cu LMC prin extract CF la 250 µg/mL (Figura 9). În plus, LMC (100 µg/mL) a crescut semnificativ expresia RAGE la 2,2-ori în comparație cu grupul de control, dar a fost atenuată prin tratamentul cu extract de CF (Figura 10), indicând că extractul de CF a redus în principal inducția. cauzate de LMC.

2.8. Extractul CF a promovat sinteza colagenului și a îmbunătățit degradarea colagenului indusă de îmbătrânire în celulele Hs68

2.8.1. Efectele extractului CF asupra sintezei colagenului

Celulele Hs68 au fost tratate cu extract CF (50–250 pg/mL) timp de 24 de ore, iar expresia procolagenului de tip I a fost măsurată folosind Western blot. După tratamentul cu extract de CF, expresia procolagenului de tip I a fost semnificativ upregulată (de 1,7-ori în comparație cu grupul de control) (Figura 11a). Conținutul total de colagen în grupul de control a fost de 14,93 ± 1,27 µg/mL, care a crescut la 39,00 ± 2,39 µg/mL după tratamentul cu 250 µg/mL extract CF (Figura 11b). Rezultatele exprimării procolagenului de tip I și conținutului total de colagen au indicat că extractul CF a promovat sinteza și producția de colagen.

2.8.2. Efectele extractului de CF asupra degradării colagenului indusă de UV și AGE

Celulele Hs68 expuse la radiații UVB (40 mJ/cm2) sau tratate cu CML (100 pg/mL) au fost tratate cu extract CF timp de 24 de ore. După cum se arată în Figura 12a, conținutul total de colagen a scăzut semnificativ după radiația UVB, iar tratamentul cu extract de CF a restabilit colagenul și a crescut semnificativ formarea de colagen la 250 µg/mL. Rezultate similare au fost arătate în producția de colagen tratată cu LMC și o serie de extracte de CF. Extractul CF a atenuat reducerea colagenului total tratată cu LMC (Figura 12b).

Testul de colorare prin imunofluorescență a fost utilizat pentru a determina nivelul de colagen în celulele fibroblaste (Figura 12c). Atât radiațiile UVB, cât și tratamentul CML au redus conținutul de colagen, în timp ce extractele CF au îmbunătățit degradarea colagenului. Rezultatele testului de colorare prin imunofluorescență a extractului de CF pe colagen au fost în concordanță cu conținutul de colagen din figurile 11b și 12a,b.

【Pentru mai multe informații:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】