Efectele și mecanismele de protecție ale procianidinelor asupra bolii Parkinson in vivo și in vitro, partea 2

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

2.7. Efectele PC-urilor asupra stresului oxidativ al peștilor zebră Larae tratați cu MPTP

Tratamentul larvelor de pește zebra cu PC-uri a scăzut formarea crescută de ROS intracelular indusă de MPTP (Figura 7a, b). În plus, rezultatele testului de peroxidare a lipidelor au arătat că expunerea la PC (16 ug/mL) a blocat nivelurile MDA induse de MPTP la larvele de pește zebra (Figura 7c). În plus, reducerea activității GSH-Px indusă de MPTP a fost inversată de tratamentul cu PC (16 ug/mL) (Figura 7d) și PC (4,8 și 16 ug/mL) a crescut scăderile induse de MPTP în CAT și SOD activitate (Figura 7e,f).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

2.8. Efectele PC-urilor asupra Nr2/ARE Patlhroay în peștele-zebră indus de MPTP Laroa

Tratamentul larvelor de pește zebra cu PC-uri a subliniat premisa că activarea căilor Nr2/ARE a fost implicată în proprietățile protectoare mediate de PC. Expresia markerilor Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC și GCLM a fost reglată în sus prin tratamentul PC-urilor în comparație cu expunerea la MPTP singură (Figura 8a-e).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Discuție

PC-urile prezintă abilități puternice de captare a radicalilor și activitate antioxidantă, iar stresul oxidativ, cauzat de generarea excesivă de ROS sau/și de deteriorarea sistemului de apărare antioxidantă, joacă un rol critic în PD[37-39]. Cu toate acestea, rămâne neclar dacă PC-urile pot juca un rol neuroprotector prin efecte antioxidante. Această cercetare și-a propus să investigheze mecanismul molecular al PC-urilor împotriva modelelor PD induse de MPP plus /MPTP.

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

În acest studiu, în comparație cu grupul MPP plus /MPTP singur, PC-urile au crescut semnificativ nivelul de activitate al enzimelor antioxidante (inclusiv GSH-Px, CAT și SOD) și au scăzut nivelurile de ROS și MDA. Constatările actuale sunt în concordanță cu un studiu anterior care sugerează că un supliment scăzut de PC prin dietă îmbunătățește activitățile GSH-Px, CAT și SOD la purceii înțărcați [40]. Un alt studiu sugerează, de asemenea, că PC-urile cresc semnificativ activitățile CAT și SOD și scad conținutul de MDA, îmbunătățind astfel calitatea spermei de capră[41]. Aceste descoperiri sugerează că PC-urile au un efect protector asupra daunelor oxidative ale celulelor nervoase. În plus, PC-urile au îmbunătățit viabilitatea celulară în comparație cu grupul MPP plus singur în celulele PC12 induse de MPP plus, au crescut semnificativ distanța totală deplasată și au scăzut densitatea celulelor TH plus față de grupul MPTP în larvele de pește zebra induse de MPTP. Aceste date indică faptul că PC-urile au un efect protector asupra celulelor nervoase.

Am observat în continuare că PC-urile au crescut semnificativ acumularea nucleară de Nrf2 în comparație cu cea a MPP plus singur în celulele PC12. Într-adevăr, PC-urile au reglat în mod semnificativ nivelurile de expresie ale NQO1, HO-1, GCLM și GCLC[42]. Mai mult, atenuarea Nfr2gene prin siRNA Nrf2 a fost utilizată pentru a investiga rolul activării Nrf2/ARE în neuroprotecția mediată de PC-uri împotriva daunelor oxidative induse de MPP plus: celulele transfectate cu Nrf2-siRNA au indicat o scădere marcată a expresiei Nrf2. Acest studiu actual a constatat, de asemenea, că knockout-ul Nrf2 a abolit atât protecția mediată de PC-uri împotriva deteriorărilor tratate cu MPP plus în viabilitatea celulară, cât și efectele antioxidante ale PC-urilor. Aceste rezultate sunt în concordanță cu un studiu anterior care sugerează că îmbunătățirea activării căii Nrf2/ARE contribuie la neuroprotecție [43].

Calea Nrf2/ARE este o cale antioxidantă semnificativă [44-46]. În mod normal, Nrf2 rezidă în citoplasmă, unde este legat de proteina inhibitoare, Keapl[47,48]. Când celulele suferă stres oxidativ, Nrf2 se disociază de Keap1, inițiază sistemul de apărare antioxidantă endogen și ulterior se translocă în nucleu [46,49,50]. Apoi interacționează cu ARE pentru a activa o serie de gene de protecție a celulelor și antioxidante, inclusiv GCLC, GCLM, NQO1 și HO-1 [51-54]. Ca răspuns la stresul oxidativ, Nrf2 se disociază de Keap1 în citosol și este apoi translocat în nucleu, legându-se de secvența ARE pentru a activa transcripția genelor crioprotectoare [53-58]. Rezultatele actuale indică faptul că PC-urile pot activa calea Nrf2/ARE, pot transfera Nrf2 din citoplasmă în nucleu, pot acumula în nucleu, pot regla expresia GCLC, GCLM, NOO1 și HO-1 și pot îmbunătăți capacitatea de celule pentru a rezista stresului oxidativ. Într-adevăr, calea Nrf2/ARE poate reprezenta o țintă farmacologică a PC-urilor pentru prevenirea PD.

4. Materiale și Metode

4.1. Compuși și reactivi chimici

Agenții MPP plus și MPTP au fost achiziționați de la Sigma (St. Louis, MO, SUA), iar kitul de numărare a celulelor-8 a fost obținut de la Beyotime (Shanghai, China). Kiturile de diagnosticare PC, 2',7/-Diclorofluorescină, MDA, GSH-Px, SOD și CAT au fost toate obținute de la Solarbio (Beijing, China). Setul de reactivi RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT cu gDNA Eraser și SYBRPremix Ex TaqTMⅡI au fost achiziționate de la Takara (Shiga, Japonia); Nrf2-siARN, control-siARN și Lipofectamine 2000 au fost obținute de la GenePharma (Shanghai, China). În cele din urmă, anticorpii primari, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, Antityrosine Hydroxylase (TH) și anticorpii secundari corespunzători au fost obținuți de la Proteintech (Wuhan, China). ).

4.2.Cultura celulară

Celulele PC12 au fost obținute din Colecția Națională de Culturi de Celule Autentificate. Celulele au fost menținute în DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin și penicilină-streptomicină (100 U/mL; 100 ug/ml) într-un incubator cu atmosferă umidificată la 37 de grade cu 5% CO2 [59].

4.3. Test de viabilitate celulară

Celulele PC12 (1 × 104 celule/godeu) au fost incubate cu 1,2 sau 4 ug/mLof PCsor deprenvl （30 μM） timp de 24 de ore și apoi incubate cu 1,5 mM MPP plus timp de 24 de ore. Apoi, în fiecare godeu s-au adăugat 10 μL de soluție Cell Counting Kit-8 și s-au incubat timp de 1 oră. Absorbanța a fost măsurată la 450 nm [60].

4.4. Întreținerea peștelui

Aprobarea etică pentru utilizarea animalelor a fost acordată de comitetul de conservare și utilizare a animalelor al centrului experimental pentru animale, Universitatea Zhejiang (ZJU20200125). Peștii zebră adulți (tulpina AB) au fost obținuți de la centrul de animale de laborator al Universității Zhejiang (Hang Zhou, China) și menținut la 28 ± 1 grade sub cicluri de 14 ore lumină/10 ore întuneric. Peștii au fost hrăniți cu Artemia nauplii de două ori pe zi [61]. Pentru a produce embrioni, peștii zebră adulți au fost plasați în rezervoare de reproducție peste noapte la un raport de 1:1 mascul:femelă. Depunerea a fost declanșată după ce luminile au fost aprinse în dimineața următoare și s-au finalizat în 2 ore. Embrionii au fost crescuți în apă embrionară (13,7 mM NaCl, 540 μM KCl, 25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 μM MgSO, 420 μM NaHCO3, pH 7,4 ） la 【2862°), 【286e.

4.5. Măsurarea ROS

Pentru a măsura producția de ROS, celulele PC12 (2×104 celule/godeu) au fost expuse la 1,2 sau 4 ug/mL de PC-uri sau deprenil （30 μM） timp de 24 de ore și apoi incubate cu 1,5 mM MPPt timp de 24 de ore 【64】. Celulele au fost expuse la 10 μM soluție de diacetat de 2’,7’-diclorofluorescină în condiții de întuneric timp de 30 de minute; soluţia de colorant a fost apoi îndepărtată şi celulele au fost spălate cu soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) de 3 ori. Imaginile celulelor au fost observate folosind un microscop confocal cu scanare laser Olympus (Olympus, capitala Tokyo, Japonia). Intensitatea fluorescenței celulelor a fost cuantificată folosind software-ul Image J v1.8.0 (Olympus, capitala Tokyo, Japonia). Rezultatele sunt exprimate ca procent din aria regiunilor ROS din grupul de control.

Pentru a măsura producția de ROS, larvele de pește zebra la 3 zile după fertilizare (dpf) au fost expuse la deprenil (40 μM) sau 4,8 sau 16 ug/mL de PC-uri cu sau fără 400 μM MPTP timp de 4 zile. Larvele de pește zebra la 7 dpf au fost transferate pe o placă de godeuri 24-(10 larve per grup), tratate cu soluție de diacetat de 2',7'-diclorofluorescină 20 μM și incubate timp de 60 de minute la întuneric la 28,5 grade [65 ]. Larvele au fost apoi spălate de trei ori cu mediu embrionar pentru a îndepărta excesul de diacetat de 2',7'-diclorfluorescină. Imaginile larvelor colorate au fost observate folosind un microscop confocal cu scanare laser Olympus. Intensitatea fluorescenței larvei individuale a fost cuantificată folosind software-ul Image J. Rezultatele sunt exprimate ca procent din aria regiunilor ROS din grupul de control. 4.6. Evaluarea MDA, GSH-Px, SOD și CAT

Celulele PC12 (2 × 104 celule/godeu) au fost expuse la 1,2 sau 4 ug/mL de PC-uri sau deprenil (30 μM) timp de 24 de ore, apoi au fost incubate cu 1,5 mM MPP plus timp de 24 de ore. Apoi, 1 mL de extract a fost adăugat la celule de 4 x 10 grade, iar celulele au fost sparte prin centrifugare cu ultrasunete la 8000 rpm la 4 grade timp de 10 minute. Supernatantul a fost apoi pus pe gheață pentru testare și au fost adăugați reactivi pentru determinarea MDA, GSH-Px, SOD și, respectiv, CAT. Fiecare index a fost repetat în trei exemplare.

Larvele de pește zebra la 3dpf au fost incubate cu deprenyl（40 μM）sau 4,8 sau 16 ug/mL de PC-uri cu sau fără 400 μM MPTP timp de 4 zile. Apoi, 0,05 g de țesut de larve de pește zebra și 0,5 ml de extract au fost omogenizate într-o baie de gheață și apoi centrifugate la 4 grade timp de 10 minute. Supernatantul a fost pus pe gheață pentru testare. Reactivi au fost adăugați ulterior pentru determinarea MDA, GSH-Px, SOD și, respectiv, CAT. Fiecare index a fost repetat în trei exemplare.

4.7. Prepararea proteinelor cu celule întregi, citoplasmatice și nucleare

Pentru extracția proteinei cu celule întregi, celulele au fost colectate și incubate cu tampon de liză RIPA care conține 1% PMSF și 1% cocktail inhibitor de protează timp de 30 de minute pe gheață. Lizatele celulare au fost centrifugate, iar supernatantul a fost colectat și depozitat. Pentru prepararea fracționării subcelulare, probele de celule au fost procesate folosind trusa de extracție a proteinelor nucleare și citoplasmatice. Conținutul de proteine ​​a fost testat folosind testul BCA (Beyotime, Shanghai, China).

4.8. Transfectarea siRNA Nrf2

Nrf2-siRNA a fost folosit pentru a elimina Nrf2. Celulele PC12 au fost transfectate cu Nrf2-siARN (80 nM) sau control-siARN folosind Lipofectamine 2000, conform manualului. 4.9.Western Blotting

Probele de proteine ​​au fost rezolvate prin SDS-PAGE și transferate pe membrane de poliviniliden di-fluorură (PVDF). Petele au fost expuse la anticorpi primari adecvați: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH și anticorpi secundari conjugați cu peroxidază. Benzile de proteine ​​au fost vizualizate folosind ECL (Beyotime, Shanghai, China) plus reactivi de detectare Western blot [36,43].

4.10.Proba de comportament locomotorie

Larvele de pește zebra la 3dpf au fost incubate cu deprenil (40 μM) sau 4,8 sau 16 ug/mL de PC-uri cu sau fără 400 uM MPTP timp de 4 zile. Peștele zebră cu 7 dpf a fost apoi plasat în plăci de 24-godeuri (1 pește pe godeu și 12 larve pe grup) și a fost înregistrată distanța totală pe care a înotat fiecare pește în 10 minute. Comportamentul peștelui zebra a fost monitorizat și analizat folosind un sistem automat de urmărire video (Any-Maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, SUA)[66].

4.11. Extracția totală a ARN, transcripția inversă și reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real

ARN-ul a fost extras folosind RNAiso Plus urmând instrucțiunile producătorului. ARN-ul a fost transcris invers folosind un kit de reactiv PrimeScriptTMRT cu gDNA Eraser, urmând instrucțiunile producătorului. Analiza PCR cantitativă în timp real a fost efectuată pe un sistem PCR în timp real Applied Biosystems ViATM 7 folosind SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japonia). -actina a fost folosită ca genă de referință și expresia relativă a genei a fost calculată folosind metoda 2-△Ct. Secvențele de primer utilizate în cercetare sunt enumerate în Tabelul 1.

4.12. Pește-zebra Antitirozin Hidroxilază (TH) Imunocolorarea întregii monturi

Larvele de pește zebra la 1 dpf au fost incubate cu deprenyl （40 μM） sau ​​4,8 sau 16 ug/mL de PC-uri cu sau fără 400 uM MPTP timp de 2 zile (10 loturi de pești/grup). Larvele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă în PBS timp de 30 de minute. După fixare, au fost tratați pentru imunocolorarea întregii monturi a TH [67]. La temperatura camerei, 2 procente (v/o) ser de miel și 0,1 procente (g/ø) albumină serică bovină (BSA) au fost blocate în soluție salină tamponată cu fosfat Tween-20(PBST) timp de 1 oră. Au fost apoi expuși în tamponul de blocare la antitirozinăanticorp hidroxilază (1:200 diluat, Proteintech) timp de 2 ore, apoi clătit de 6 ori cu PBST. Etapa finală de imunocolorare a întregului montaj a fost efectuată în tampon de colorare cu 488 capră antiiepure (1:500) timp de 1 oră și spălată din nou cu PBST. După o dezvoltare suficientă a culorii, peștii zebra au fost montați plat cu 3,5 la sutămetilcelulozași fotografiat folosind un microscop confocal cu scanare laser Olympus.

4.13. Analize statistice

Analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) urmată de testul de comparație multiplă Tukey a fost utilizată pentru a compara mediile diferitelor grupuri. Graphpad Prism v6.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA) a fost folosit pentru analiza statistică și trasarea graficelor.

5. Concluzii

În concluzie, descoperirile noastre indică faptul că PC-urile exercită efecte neuroprotectoare prin activarea căii Nrf2/ARE și în aval.detoxifiereșiantioxidant enzime. Luate împreună, aceste informații sugerează că PC-urile pot fi utile pentru tratarea PD.

Acest articol este extras din Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules