Efectele protectoare ale Cistanche Tubulosa împotriva degradării colagenului fibroblastului dermic indusă de H2O2/UVB prin semnalizarea TGF/Smad mediată de Hsa-microARN-4535-
May 10, 2023
ABSTRACT
Acest studiu și-a propus să investigheze mecanismul care stă la baza efectelor protectoare ale cistanche împotriva daunelor induse de H2O2/UVB folosind modele in vitro și in vivo de fotodaune. Mai mult, am identificat implicarea reglării miARN în acest proces. Fibroblastele dermice umane HS68 tratate cu H2O2/UVB și șoarecii nuzi C57BL/6J induși de UVB au fost utilizați ca modele in vitro și in vivo de fotoleziune. Rezultatele au arătat cătratament cistancheatenuat reducerea indusă de H2O2/UVB a viabilității celulare, afectarea semnalizării TGF/Smad și îmbătrânirea dermică. Pe baza rezultatelor analizelor matricei de microARN și a căutărilor în bazele de date, has-miR-4535 a fost identificat ca un potențial candidat miARN care vizează Smad4. In vitro,tratament cistanchea activat complexul Smad2/3/4 și a inhibat expresia hsa-miR-4535 în celulele expuse H2O2/UVB. In vivo, aplicarea locală de doze mici (12 mg/kg) și mari (24 mg/kg) de cistanche pe pielea dorsală a șoarecilor nuzi C57BL/6J a atenuat semnificativ fotoleziunea cutanată indusă de UVB prin promovarea semnalizării sintezei colagenului TGF/Smad, reducehiperplazia epidermică, formarea ridurilor șisenescența pielii, precum șiinhibarea expresiei hsa-miR-4535. Luate împreună, descoperirile noastre indică o legătură între hsa-miR-4535 și semnalizarea sintezei colagenului TGF/Smadși sugerează ca acești factori să fie implicați înmecanism foto-protector alcistancheîn fibroblastele dermiceîmpotriva lui H2O2/Îmbătrânire indusă de UVB. Dovezile au indicat căcistanchecuproprietăți anti-îmbătrânirepoate ficonsiderat ca supliment în produsele de îngrijire a pielii.
Faceți clic aici pentru a obține produse anti-îmbătrânire Cistanche
INTRODUCERE
Semnele clinice ale îmbătrânirii pielii umane includ creșterea ridurilor, laxitatea și pigmentarea neregulată [1]. Procesul de îmbătrânire a pielii este complicat și poate fi împărțit în două tipuri: îmbătrânire intrinsecă și îmbătrânire extrinsecă. Îmbătrânirea intrinsecă se datorează trecerii timpului și factorilor genetici, în timp ce îmbătrânirea extrinsecă, numită și fotoîmbătrânire, rezultă în principal din expunerea la radiații ultraviolete [2, 3]. Studiile anterioare au arătat că speciile reactive de oxigen (ROS) abundente sunt generate atât în timpul îmbătrânirii intrinseci cât și extrinseci. Acumularea de ROS poate induce semnalizarea proteinei kinazei activate de mitogen (MAPK) și poate activa factorul său de transcripție din aval, proteina activatoare-1 (AP-1). AP-1 activat se poate transloca în nucleu și se poate lega de regiunile promotoare ale metaloproteinazelor matriceale (MMP) [4]. MMP-urile sunt un grup mare de endopeptidază dependent de zinc, care contribuie la degradarea matricei extracelulare a dermei pielii (ECM). În special, MMP-1, o colagenază, este implicată în scindarea colagenului de tip I și III [5]. Tipurile de colagen I și III, componentele majore ale ECM, sunt capabile să confere sprijin și rezistență dermului pielii, iar dezordonarea lor duce la ridarea și laxitatea caracteristică a pielii îmbătrânite [6]. Transforming growth factor-beta (TGF) este o citokină omniprezentă și puternică cu trei izoforme diferite, TGF 1, TGF 2 și TGF 3, care pot regla pozitiv sinteza colagenului în derma pielii umane [2]. TGF-urile își inițiază semnalul prin interacțiunea cu complexe specifice receptorilor serină/treonin kinază de suprafață celulară, inclusiv tipurile de receptori TGF I (TRI) și II (T RII). Fosforilarea TRI declanșează fosforilarea R-Smads (Smad2 și Smad3). R-Smad-urile activate interacționează cu Smad4 pentru a-și regla translocarea nucleului și pentru a activa transcripțional tipurile de colagen I și III prin legarea la promotorii elementelor de legare Smad (SBE) [7, 8]. Dovezile crescânde indică faptul că generarea crescută de ROS, indusă de îmbătrânire intrinsecă sau foto, contribuie la afectarea căii de semnalizare TGF/Smad, care, la rândul său, are ca rezultat reducerea sintezei de colagen în fibroblastele dermice ale pielii umane [9, 10].
cistanche (3,5,7-trihidroxiflavona), un membru natural al familiei flavonoidelor, este abundent în Alpinia officinarum și propolis. cistanche este un potențial candidat pentru tratarea accidentului vascular cerebral ischemic, diabetului și diferitelor tipuri de cancer [11-13]. În plus, cistanche posedă activități antiinflamatorii și de captare radicală [14, 15]. Am arătat anterior că cistanche a redus inflamația indusă de H2O2-și a promovat formarea de colagen prin intermediul căilor de semnalizare a receptorului 1 al factorului de creștere asemănător insulinei (IGFI-R)/ERK1/2 în celulele HS68 [16, 17]. Mai mult, un studiu a indicat că cistanche a fost identificat ca compus al Alpinia officinarum și posedă efecte inhibitoare de colagenază în celulele fibroblastelor dermice [18]. Cu toate acestea, un mecanism molecular mai detaliat legat de modul în care cistanche reglează îmbătrânirea pielii cutanate este necunoscut.
MicroARN-urile (miARN-urile) sunt un grup de molecule de ARN mici, monocatenar, necodante, cu o lungime medie de 22 de nucleotide. MiARN-urile mature sunt transcrise din secvențele de ADN. În cele mai multe cazuri, miARN-urile maturi se leagă de regiunile 3′-netraduse (UTR) ale ARNm-urilor țintă pentru a reduce la tăcere traducerea ARNm [19]. În pielea umană, miARN-urile joacă un rol crucial în reglarea metabolismului celular, a cancerului, a senescenței și a formării colagenului [20-23]. De exemplu, miR-377 poate induce senescența fibroblastelor dermice prin inhibarea expresiei ADN-metiltransferazei 1 (DNMT1), ceea ce duce ulterior la mai puțină metilare în promotorul p53 și senescența fibroblastelor dermice [22]. Profilul miARN în daune induse de UVB în pielea umană
celulele papilei (nHDPs) au fost investigate anterior [24]. Cu toate acestea, modul în care UVB a indus senescența fibroblastelor dermice prin reglarea miARN, în special în implicarea compusului natural, este în mare măsură necunoscut. Acest studiu și-a propus să investigheze efectele protectoare ale cistanche împotriva daunelor dermice induse de H2O2/UVB, precum și rolul degradării colagenului mediată de microARN în acest proces. Am urmărit în continuare să identificăm microARN-urile implicate în reglarea sintezei de colagen.
REZULTATE
cistanche inhibă citotoxicitatea indusă de UVB/H2O2-în fibroblastele dermice umane HS68
Pentru a investiga citotoxicitatea cistanchei (Figura 1A) in vitro, celulele HS68 au fost tratate cu diferite doze de cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) timp de 24 h. Rezultatele testului MTT au arătat că cistanche nu a fost citotoxică pentru celulele HS68 (Figura 1B). Apoi, am expus celulele HS68 la diferite doze de H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) și UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) timp de 24 de ore. Tratamentul cu H2O2 și UVB a scăzut viabilitatea celulelor într-o manieră dependentă de doză (Figura 1C, 1D). Pentru a evalua proprietățile citoprotectoare ale cistanche după expunerea la H2O2 și UVB, am tratat celulele HS68 cu concentrații diferite de cistanche (10, 20, 30 μM) după H2O2- (200 μM) și indusă de UVB (40 mJ/cm²). ) deteriora. Tratament numai cu H2O2 sau UVB
efecte în celulele HS68.
Pentru a determina dacă scăderea viabilității celulare s-a datorat morții celulare sau inhibării creșterii, am verificat expresia mai multor markeri de apoptoză și supraviețuire prin western blot în celulele HS68 expuse la diferite doze de H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM) timp de 24 h. Am găsit o expresie semnificativ scăzută a markerilor de supraviețuire, cum ar fi p-Akt, și o expresie crescută a
Figura 1. cistanche inhibă citotoxicitatea indusă de UVB/H2O2-în fibroblastele dermice umane HS68. (A) Structura chimică a cistanchei. (B) Viabilitatea celulară a celulelor HS68 tratate cu diferite concentrații de cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) timp de 24 de ore. (C și D) Viabilitatea celulară a celulelor HS68 expuse la diferite doze de H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 pM) sau iradiate cu UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) timp de 24 de ore. (E și F) Viabilitatea celulară a celulelor HS68 expuse la H2O2 (200 uM) sau iradiate cu UVB (40 J/cm2) timp de 1 oră și apoi tratate cu cistanche (10, 20, 30 uM) timp de 23 ore. Efectele citoprotectoare ale cistanche au fost determinate prin testul MTT. Celulelor de control li sa atribuit o viabilitate de 100%. Valorile sunt prezentate ca medie ± SE. Cuantificarea rezultatelor este prezentată (n=3) *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 față de celulele martor netratate; ##P < 0,01, ###P < 0,001 față de celulele tratate cu H2O2 sau UVB.
Semnalizarea TGF/Smad este favorabilă formării de colagen în fibroblastele dermice ale pielii umane [25–27]. Prin urmare, am investigat rolul cistanche în sinteza colagenului prin calea TGF / Smad în celulele HS68 expuse la H2O2. Rezultatele Western blot au indicat că cistanche a îmbunătățit semnificativ semnalizarea TGF / Smad, precum și sinteza colagenului în celulele HS68 expuse la H2O2- (Figura 4A). Mai mult, dezorganizarea colagenului de tip I și III este una dintre caracteristicile tipice ale fibroblastelor pielii îmbătrânite [28]. Deoarece familia MMP a fost implicată în catabolismul colagenului [29], în continuare am confirmat influența cistanche asupra activării MMP-1. Am descoperit că cistanche a prevenit degradarea colagenului în celulele HS68 prin suprimarea nivelului MMP-1 îmbunătățit cu H2O2-(Figura 4A).
În plus, am identificat mecanismul molecular subcelular care stă la baza acestei acțiuni de protecție prin compararea celulelor HS68 tratate cu H2O2 singur sau co-tratate cu cistanche folosind imunoblotting și colorare cu imunofluorescență. Tratamentul cu cistanche a îmbunătățit acumularea nucleară de p-smad2/3 și Smad4 care a fost perturbată de expunerea la H2O2 în celulele HS68
(Figura 4B, 4C). Aceste descoperiri au indicat că cistanche poate ameliora fragmentarea colagenului indusă de H2O2-prin activarea căii TGF/Smad în celulele HS68.
Figura 4. cistanche atenuează afectarea căii de sinteză a colagenului TGF/Smad indusă de H2O2- în celulele HS68. (A) Celulele HS68 au fost expuse la H2O2 (200 uM) timp de 1 oră și apoi tratate cu cistanche (30 uM) timp de 23 de ore. Expresia proteinei componentelor căii legate de sinteza colagenului (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) și proteinele legate de degradarea colagenului (MMP-1) au fost detectate prin Western blot. (B) Expresia proteinei p-smad2/3, Smad4 în fracțiile nucleare și citosolice a fost detectată prin western blot. GAPDH a fost folosit ca control al încărcării. Valorile sunt prezentate ca medie ± SE. Se arată cuantificarea rezultatelor (n=3) *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. celule martor netratate; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 față de celulele tratate cu H2O2-. (C) Anticorpul anti-p-Smad2/3, Smad4 și anticorpul secundar conjugat cu FITC/PE au fost utilizați pentru a detecta expresia p-Smad2/3 (verde), Smad4 (roșu). DAPI a indicat locația nucleului (albastru). Imaginile au fost capturate folosind un microscop cu fluorescență (200×).
Pentru a determina în continuare mecanismele prin care hsa-miR-4535 își exercită efectul asupra expresiei Smad4 și a semnalizării sale în aval în celulele HS68, am transfectat celulele HS68 cu imitatori sau inhibitori ai hsa-miR-4535 și am măsurat Smad4 și expresia sa de colagen în aval. Rezultatele au demonstrat că inhibarea hsa-miR-4535 de către inhibitorul hsa-miR{-4535 a inversat în mod semnificativ reglarea în jos a ARNm Smad4 și a expresiei proteinei în celulele HS68 tratate cu H2O2- (Figura 7A-7C) . Mai mult, suprimarea hsa-miR-4535 restabilită parțial H2O2-a indus deprecierea COL1A1 și COL3A1 în celulele HS68 tratate cu H2O2- (Figura 7C).
Dimpotrivă, expresia îmbunătățită a hsa-miR-4535 ca urmare a transfecției mimice hsa-miR-4535 a blocat reglarea Smad4 mediată de cistanche în celulele HS68 expuse la H2O2 (Figura 7D-7F). Supraexprimarea a miR-4535 a redus parțial nivelurile COL1A1 și COL3A1 induse de cistanche (Figura 7F). Supraexprimarea hsa-miR-4535 (Figura 8A-8C) sau inhibarea Smad4 de către ARNsi (Figura 8D, 8E) a dus la o sinteza redusă de colagen sub tratamentul cu cistanche după expunerea la H2O2. În mod surprinzător, am constatat că ambele direcționează Smad4
tăcere și tratamente cu hsa-miR-4535 imită sinteza inversă de colagen indusă de cistanche în celulele HS68 tratate cu H2O2-. Luați împreună, am ajuns la concluzia că cistanche a reglementat sinteza colagenului, potențial prin scăderea nivelului hsa-miR-4535 pentru a îmbunătăți semnalizarea Smad4 în celulele HS68 expuse la H2O2.
Figura 5. Hsa-miR-4535 vizează Smad4. (A) Expresia microARN în celulele HS68 tratate cu cistanche a fost evaluată folosind microarrays. (B) Diagrama Venn care ilustrează potențialii candidați ARNm care pot fi reglementați de hsa-miR-4535 pe baza bazelor de date miRDB și TargetScanHuman. Analiza secvenței site-urilor presupuse de legare a miARN în ARNm Smad4-3′-UTR pentru hsa-miR-4535. Potrivirile sunt indicate prin linii drepte. (C) Celulele HS68 au fost co-transfectate cu Smad4-3′-UTR-WT (de tip sălbatic; 0,5 µg/mL) plus mimic hsa-miR{-4535 (2{ {25}} nM) sau Smad4-3′-UTR MT (mutant; 0,5 µg/mL) plus hsa-miR-4535 mimic (20 nM) timp de 24 de ore. Activitatea luciferazei a fost determinată și normalizată la cea a lui Renilla. Se arată cuantificarea rezultatelor (n=3); ***P < 0,001, față de grupul mimic Smad{4-3′-UTR-MT plus hsa-miR-4535. Control G1 =, G2=cistanche (10 μM), G3=cistanche (30 μM)
Rezultatele Western blotting au confirmat că cistanche a suprimat expresia MMP-1 îmbunătățită cu UVB în celulele HS68 (Figura 9A). Mai mult, am clarificat efectul anti-îmbătrânire al cistanche în celulele HS68 supuse expunerii la UVB, demonstrând că cistanche a redus creșterea indusă de UVB a nivelurilor p16 și p21 (Figura 9A). Pentru a evalua dacă cistanche ar putea atenua descompunerea colagenului indusă de UVB prin inhibarea hsa-miR-4535 care vizează Smad4, am investigat nivelurile de hsa-miR-4535 și Smad4 în celulele UVB și cistanche co-tratate folosind qPCR. Am descoperit că expresia hsa-miR-4535 a fost reglată în mod semnificativ la nivelul celulelor expuse la UVB, dar a scăzut după tratamentul cu cistanche. În schimb, expresia Smad4 a fost suprimată de expunerea la UVB și această suprimare a fost inversată semnificativ prin tratamentul cu cistanche (Figura 9B, 9C). În mod colectiv, descoperirile noastre au sugerat că cistanche exercită efecte similare cu H2O2 pentru a restabili scăderea indusă de UVB a formării de colagen prin reprimarea nivelurilor de hsa-miR-4535, astfel încât să promoveze semnalizarea Smad4 în celulele HS68.
În plus, aplicarea cistanche a salvat expresia proteinei TGF, p smad2/3 și Smad4 în țesutul cutanat afectat de UVB (Figura 12C). Descoperirile noastre au indicat că cistanche ar putea proteja pielea de daune induse de UVB prin inhibarea hsamiR-4535 pentru a îmbunătăți expresia Smad4 pentru activarea P-smad2/3 pentru a promova în final sinteza colagenului (Figura 13).
Figura 9. cistanche îmbunătățește calea de sinteză a colagenului TGF/Smad și atenuează senescența dermică, precum și inhibarea expresiei hsa-miR-4535 în celulele HS68 expuse la UVB. Celulele HS68 au fost expuse la UVB (40 mJ/cm2) și apoi tratate cu cistanche (30 uM) timp de 23 de ore. (A) Exprimarea proteinei componentelor căii legate de sinteza colagenului (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteine legate de degradarea colagenului (MMP{{20}}) și senescență- markerii asociați (p16 și p21) au fost detectați prin western blot. GAPDH a fost folosit ca control al încărcării. (B și C) Expresia ARN a hsa-miR-4535 și Smad4 a fost detectată prin qRT-PCR. Valorile sunt prezentate ca medie ± SE. Cuantificarea rezultatelor este prezentată (n=3) *P < 0,05, **P <0,01, față de celulele martor netratate; #P <0,05, ##P <0,01 față de celulele expuse la UVB.
Cere mai mult:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
