Efectele protectoare ale noului decoct Wenshen Shengjing asupra afectării sintezei testosteronului și a apoptozei spermatogene induse de ciclosporină
Mar 03, 2022
Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN , XIYAN WANG , XUENAN WANG , WANSHENG ZHANG4 , ZHANXUAN SUN1 , XUAN XUAN LIANG , XUE ZHANG , WENJUN LI și ZHIXIN LI
Abstract
Prezentul studiu și-a propus să investigheze potențialele efecte protectoare ale noului decoct Wenshen Shengjing (noul WSSJD; inclusiv Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, solarul Cynomorium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum și Angelica Sinensis) privind afectarea indusă de ciclosporină a sintezei testosteronului și apoptoza spermatogenă la șoareci. Un total de 90 de șoareci Kunming masculi adulți au fost împărțiți în următoarele 6 grupuri: martor (fără intervenție), dimetilsulfoxid (DMSO; au primit doar DMSO), ciclosporină A (CSA), citrat de clomifen (CC; CsA plus CC, 15 mg/kg). /zi), WSSJD (CsA plus WSSJD, medicament brut 12 g/kg/zi) și WSSJD nou (CsA plus WSSJD nou, medicament brut 12 g/kg/zi). Toți șoarecii au fost tratați timp de 30 de zile prin gavaj oral. Testiculele au fost ulterior fixate și colorate cu hematoxilină și eozină pentru a evalua dezvoltarea epiteliilor seminifere. Tehnicile imunohistochimice au fost utilizate pentru a detecta expresia receptorului hormonului luteinizant (LHR) și a clivajului lanțului lateral P450 (P450scc) în celulele Leydig testiculare. În plus, apoptoza celulelor spermatogene din testicule a fost detectată utilizând un test de etichetare a nick-end dUTP mediat de deoxinucleotidil transferază terminală, iar citometria în flux a fost utilizată pentru a analiza rata de supraviețuire și apoptoza timpurie a spermatozoizilor în epididim. În comparație cu grupurile CsA și CC, noua administrare de WSSJD a crescut semnificativ nivelurile de testosteron seric și expresiile LHR și P450scc în celulele Leydig testiculare (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Introducere
Ciclosporina A (CSA) este un agent imunosupresor utilizat în mod obișnuit care vizează în mod specific celulele T și inhibă secreția de interleukină-2 și crește dramatic rata de succes a transplanturilor de ficat, rinichi și cornee, precum și rata de supraviețuire a destinatari (1-3). Cu toate acestea, imunosupresia indusă de utilizarea pe termen lung a CsA crește semnificativ riscul de boli cardiovasculare, infecții și tumori maligne (4). Eid și colab. (5) au raportat că concentrația și motilitatea spermatozoizilor au fost corelate negativ cu concentrația de CsA seric la primitorii de transplant de rinichi de sex masculin, sugerând că CsA poate induce disfuncția sistemului reproducător la primitorii de sex masculin. În plus, s-a documentat că CsA poate fi responsabilă pentru spermatogeneza afectată și deteriorarea sistemului reproducător masculin (6).
Studiile anterioare au demonstrat că CsA a scăzut nivelurile de testosteron seric prin influențarea biosintezei și secreției de testosteron în testicule. He et al (7) au observat că șobolanii tratați cu 40 mg/kg/zi CsA au prezentat niveluri semnificativ mai mari de hormon luteinizant (LH) și niveluri semnificativ mai scăzute de testosteron în ser, ceea ce duce la o dezvoltare testiculară afectată. Ali și colab. (8) au raportat că tratamentul cu CsA a scăzut expresia receptorului LH (LHR) pe membrana celulelor Leydig, care a scăzut ulterior sinteza și secreția de testosteron mediată de LH din celulele Leydig. Un alt studiu realizat de Seethalakshmi et al (9) a raportat că CsA a scăzut nivelul de testosteron prin inhibarea activității 17 alfa-hidroxilazei necooperant și a activității 17 -hidroxisteroid dehidrogenazei în mod competitiv în timpul biosintezei testosteronului, iar locul principal pentru inhibarea CsA a fost întreruperea adenozinei ciclice. stimulare cu monofosfat. În plus, acest raport a indicat că scăderea secreției de testosteron indusă de CsA în celulele Leydig a influențat direct dezvoltarea sistemului reproducător masculin și menținerea capacității de reproducere. Seethalakshmi et al (10) au injectat testosteron exogen în șobolani tratați cu CsA pentru a crește nivelurile de testosteron endogen. S-a observat că dozele crescute de testosteron exogen au restabilit semnificativ greutatea organelor de reproducere, nivelurile serice ale hormonului foliculo-stimulant (FSH) și au crescut numărul de celule germinale, indicând astfel că afectarea spermatogenezei indusă de CsA poate fi parțial prevenită de exogen. administrarea de testosteron (10). Cu toate acestea, testosteronul exogen s-a dovedit a fi insuficient în repararea țesutului testicular deteriorat, deoarece secreția de testosteron și spermatogeneza erau încă influențate de CsA și s-au observat rate mari de apoptoză în spermatozoizi și celulele spermatogene (10).
Decoctul Wenshen Shengjing (WSSJD) constă din 15 medicamente pe bază de plante, inclusiv Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, solarul Cynomorium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum și Angelica Sinensis (11). S-a demonstrat că WSSJD ameliorează apoptoza spermatogenă indusă de ciclofosfamidă (11). Pentru a îmbunătăți și mai mult efectul terapeutic al WSSJD, prezentul studiu a dezvoltat un nou WSSJD bazat pe mecanismul de afectare a țesutului testicular indus de CsA prin ajustarea dozei componentelor WSSJD. Studiile farmacologice moderne au demonstrat că catifea coarne în WSSJD poate funcționa ca un hormon sexual (12); Radix Astragali poate îmbunătăți proliferarea și furnizarea de nutrienți a celulelor Sertoli testiculare (13), iar Panax ginseng poate scădea nivelul de hiperoxid testicular și poate inhiba apoptoza spermatogenă (14). De asemenea, medicamentele menționate mai sus pot crește funcția rinichilor și pot stimula dezvoltarea celulelor spermatogene (12-14). Citratul de clomifen (CC) s-a demonstrat că exercită un efect terapeutic asupra infertilității masculine în studii clinice anterioare (15,16). În plus, CC a fost asociată cu îmbunătățirea parametrilor de testosteron și spermă, iar mecanismele de protecție ale CC pot fi similare cu cele ale WSSJD (15,16). În plus, într-un studiu realizat de Wang și colab. (17), CC a fost utilizat ca control al tratamentului pentru a investiga efectul medicinei chinezești Shengjing asupra tulburărilor spermatogenezei la șoareci. Pe baza acestui fapt, CC a fost utilizat ca control pozitiv în studiul de față.
În studiul de față, mecanismul care stă la baza efectului protector al noilor WSSJD în țesuturile testiculare a fost investigat pentru a determina eficacitatea terapeutică a medicamentului modificat. Elucidarea mecanismului de protecție poate oferi o bază pentru utilizarea noilor WSSJD în ameliorarea daunelor spermatogene induse de CsA.
Efectele Cistanche deserticola: Prevenireaafectarea spermatogenă
Materiale și metode
animale. Un total de 90 de șoareci Kunming masculi (în vârstă de 8-săptămâni; 35-40 g) au fost furnizați de Institutul de Produse Biologice Changchun Co., Ltd. (Changchun, China). Prezentul studiu a fost realizat cu aprobarea Comitetului de Etică al Universității Medicale Jilin (Changchun, China). Șoarecii au fost găzduiți la 21±3˚C și 55-65% umiditate relativă sub un ciclu de 12 ore întuneric-luminos. Șoarecilor li s-a oferit acces gratuit la o dietă standard pentru șoareci de laborator și apă sterilă.
Pregătirea WSSJD. Cele 15 componente ale medicinei chineze ale WSSJD, inclusiv Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, solarul Cynomorium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum și Angelica Sinensis (11), au fost achiziționate de la Tongrentang (Beijing, China). Aceste materiale au fost decoctate după metoda tradițională a decoctului medicinal chinezesc (18). Pe scurt, ingredientele au fost cântărite conform rețetei și s-au adăugat în total 250 ml apă distilată pentru a scufunda ierburile. Ierburile au fost înmuiate timp de 30 de minute și ulterior încălzite. Ierburile au fost mai întâi fierte timp de 10 minute și apoi focul a fost redus la fiert timp de 20 de minute. După 30 de minute de încălzire, decoctul lichid a fost separat de ierburi, care au fost apoi decoctate cu 200 ml apă distilată la 80°C timp de încă 30 de minute. Acest proces a fost repetat și volumul final de lichid de decoct a fost filtrat prin 4-5 straturi de tifon. Lichidul a fost, de asemenea, stors din ierburi în decoctul filtrat. Decoctul a fost ulterior încălzit la 80°C într-o baie de apă timp de 6-7 ore până când concentrația a atins 2 g de medicament brut/ml, iar decoctul a fost păstrat la 4°C înainte de utilizare. noul WSSJD a fost preparat pe baza formulării WSSJD cu ajustări minore la dozele de Panax ginseng, Cynomorium solarium, Radix Astragali și Epimedium brevicornum. Metoda de decoctare a fost aceeași cu cea a WSSJD. WSSJD nou compus din următoarele: Panax ginseng, 6 g; solar Cynomorium, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche deserticola, 9 g; Angelica Sinensis, 6 g; Semințe de milkvetch cu tulpină plată, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Cap mare Atractylodes Rhizome, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Cinnamomum cassia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, și Fructus Foeniculi, 3 g.
Concentraţiile extractelor de medicament brut au fost determinate după cum urmează: Greutatea materialului brut/volumul final. Această metodă de calcul este utilizată pe scară largă în studiul medicinei tradiționale chineze (19-21). Administrarea medicamentelor. Șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în 6 grupuri (15 șoareci per grup) și au fost administrați cu medicament intragastric. Loturile au fost următoarele: Control (soluție salină normală); dimetilsulfoxid (DMSO); CsA; CC; WSSJD; și WSSJD nou. Șoarecii din grupurile CsA, CC, WSSJD și noi WSSJD au fost injectați intraperitoneal (ip) cu 15 mg/kg/zi CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, China) timp de 30 de zile, așa cum s-a descris anterior (8). ). Șoarecii din grupul de control și DMSO au suferit o injecție zilnică ip cu un volum egal de soluție salină normală sau respectiv solvent DMSO, pe parcursul perioadei experimentale de 30-zi. Concentrația de DMSO diluat în soluție salină normală a fost de 3,25 procente (v/v). Grupul CC a fost administrat cu 21,6 mg/kg/zi CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, China) așa cum s-a descris anterior (13), care a fost, de asemenea, diluat în 3,25% (v/v) DMSO (pH{{14} }.2). Șoarecii din grupurile WSSJD și noi WSSJD au fost administrați cu 12 g de medicament brut/kg/zi de WSSJD și, respectiv, nou WSSJD.Colorare cu hematoxilină și eozină (H&E). Testiculele de șoareci au fost recoltate și fixate imediat în paraformaldehidă 4 procente (pH=7.2) la temperatura camerei timp de 24 de ore, urmată de deshidratare cu etanol, tratament cu xilen pentru a îndepărta etanolul, încorporare de ceară și secţionare. Secțiuni histologice (5 µm) au fost obținute folosind un microtom rotativ. Acestea au fost fixate pe lamele de sticlă pentru colorarea H&E. Secțiunile testiculare au fost observate folosind microscopia histopatologică pentru a evalua dezvoltarea tubilor seminiferi și pentru a obține date histometrice. Dezvoltarea tubilor seminiferi a fost evaluată utilizând sistemul de notare Johnsen (22).
ELISA. În ziua 30 de tratament, șoarecii au fost anesteziați cu 10% hidrat de clor (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) la 0,004 ml/g greutate corporală ip înainte de eutanasie cu CO2. Sângele trunchiului a fost recoltat și serul a fost separat și depozitat la -20˚C. Pe scurt, sângele a fost colectat în tuburi de 1,5 ml și depozitat la 4 °C peste noapte. Tubul a fost apoi centrifugat la 1300 xg la 4°C timp de 6 minute și serul a fost colectat. Trusele ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) au fost folosite pentru a determina conținutul seric de testosteron (cat. nr. EIA-2380) și LH (cat. nr. EIA-2385 ) conform protocolului producătorului. Densitatea optică (OD) a fost determinată folosind un cititor de microplăci Model 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA), iar nivelurile de testosteron și LH au fost determinate pe baza curbei standard.
Imunohistochimie. Țesuturile testiculare au fost fixate în formaldehidă 4% la temperatura camerei timp de 24 de ore și încorporate în parafină. Secțiunile de parafină au fost tăiate în secțiuni de 5 um și au fost ulterior deparafinate. Recuperarea antigenului a fost realizată prin incubarea secțiunilor în tampon citrat 0.01 M (pH=6.0) la 95-98˚C timp de 5 minute. Secțiunile au fost ulterior blocate cu 5% albumină serică bovină (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germania; A3675) la temperatura camerei timp de 1 oră. După blocare, secțiunile au fost incubate cu anticorpi policlonali de iepure împotriva LHR (nr. cat. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) sau scindarea lanțului lateral P450 (P450scc; nr. cat. ab75497; Abcam, Cambridge, Marea Britanie; ; 1:200) la 4˚C peste noapte în întuneric. Metoda complexului streptavidină-biotină (SABC) a fost utilizată pentru a detecta expresia LHR și P450scc folosind un kit SABC (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, SUA), conform protocolului producătorului. Pentru țesuturile izolate de la șoarecii martor negativ, anticorpul primar a fost înlocuit cu PBS. Celulele Leydig cu colorare galbenă sau maro pe membrană sau plasmă au fost considerate a fi celule LHR-pozitive. Din fiecare probă au fost obținute cinci lame și cinci câmpuri din zonele de țesut Leydig au fost selectate la întâmplare și evaluate la microscop cu fluorescență (mărire, x400). OD medie a celulelor pozitive din zonele de țesut Leydig a fost obținută folosind software-ul Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, SUA). Expresiile LHR și P450scc au fost proporționale cu valorile DO, valorile DO mai mari reprezentând expresii proteice mai mari.
Testul de etichetare nick-end dUTP (TUNEL) mediat de deoxinucleotidil transferaza terminală (TdT). Testiculele de șoareci au fost disecate, încorporate în ceară și secționate. Secțiunile (5-µm grosime) au fost apoi colorate folosind kitul de testare TUNEL (MK1024; Boster Biological Technology), conform protocolului producătorului. Pe scurt, țesuturile testiculare din grupele de control (soluție salină normală), DMSO, CsA, CC, WSSJD și noi WSSJD au fost colorate folosind o diluție 1:100 de anticorp digoxină marcat cu biotină timp de 30 de minute la 37 °C. Țesutul epitelial interstițial de șobolan colorat (furnizat în kit) a fost utilizat ca control pozitiv, iar probele incubate cu PBS în loc de anticorpi digoxină marcați cu biotină au fost utilizate ca control negativ. Frecvența celulelor TUNEL-pozitive care prezintă colorare nucleară verde a fost evaluată folosind un microscop confocal cu scanare laser. Un total de 10 câmpuri aleatorii au fost evaluate la mărire mare (x400) și au fost numărate celulele pozitive. S-a calculat numărul mediu de celule pozitive pe câmp.
Colorarea cu iodură de propidiu (PI) sau cu izotiocianat de fluoresceină cu anexină V (FITC) și analiza citometriei în flux. Epididimul cauda a fost recoltat în următorul sacrificiu și epiderma a fost tăiată cu o lamă pentru a elibera spermatozoizii din epididim în 2 ml PBS la 37°C pentru a obține suspensii de epididim. Suspensiile au fost ulterior incubate la 37°C timp de 10 minute pentru a permite spermatozoizilor să înoate. Agregările de spermă au fost aruncate și mostrele de spermă rămase au fost izolate și resuspendate în PBS pentru a da o concentrație de 106 celule/ml. Apoptoza spermatozoizilor a fost analizată folosind un kit de detectare a apoptozei Annexin V-FITC (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China), conform protocolului producătorului. Pe scurt, 1 ml de suspensie de spermă a fost colorat cu 10 pl PI sau cu 500 pl tampon de legare și 5 pl Annexin V-FITC la întuneric timp de 10 min la temperatura camerei. Celulele au fost analizate imediat prin citometrie în flux Epics XL (Beckman Coulter, Inc.) și folosind un sistem TetraONE™ (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Celulele aflate în stadiile incipiente ale apoptozei au fost identificate prin colorare pozitivă cu anexină V, iar celulele necrotice au fost identificate prin colorare cu PI pozitivă.
Analize statistice. Analiza datelor a fost efectuată folosind software-ul SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA) și a fost exprimată ca medie plus sau ± abatere standard, așa cum este indicat. Diferențele dintre grupuri au fost evaluate pentru semnificație folosind o analiză unidirecțională a varianței, urmată de testul post-hoc al lui Tukey. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche deserticola
Rezultate
Efectele noilor WSSJD asupra dezvoltării tubilor seminiferi testiculari. Pentru a investiga efectul protector potențial al noului WSSJD asupra dezvoltării tubilor seminiferi testiculari de șoarece, morfologia testiculelor de șoarece colorate cu H&E a fost comparată la microscopie cu lumină. Tubulii seminiferi ai șoarecilor din grupurile CsA și CC au prezentat o contracție a marginii tubulare, diametre scăzute ale tubului și straturi reduse de epiteliu seminifer testicular în comparație cu martor. În plus, celulele spermatogene au prezentat un aranjament dezordonat, numărul de celule spermatogene a fost redus și puțini spermatozoizi maturi erau vizibili în lumen (Fig. 1). La șoarecii din grupurile DMSO, WSSJD și noi WSSJD, au fost vizibile mai multe straturi de epitelii testiculare seminifere și marginea tubului seminifer a fost integrată fără contracție sau colaps (Fig. 1). Scorurile Johnsen nu au diferit semnificativ între grupul DMSO și grupurile de control sau între grupurile CC și DMSO. Cu toate acestea, scorul Johnsen a fost semnificativ scăzut în grupul CsA și grupul WSSJD în comparație cu grupul de control, iar scorurile WSSJD și noile grupuri WSSJD au fost semnificativ crescute în comparație cu grupul CC sau CsA (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Efectele noului WSSJD asupra testosteronului seric și LH. Au fost măsurate ulterior nivelurile de testosteron și LH din ser. Nivelurile serice de testosteron și LH nu au fost afectate după administrarea de DMSO. Prin contrast, testosteronul seric a fost reglat în mod semnificativ în jos, iar LH a fost semnificativ suprareglat la șoarecii tratați cu CsA, în comparație cu martorii (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Efectele noului WSSJD asupra expresiilor LHR și P450scc. Expresiile P450scc și LHR au fost evaluate în celulele Leydig testiculare prin imunohistochimie (Figurile 3 și 4). În grupul de control, LHR a fost exprimat pe membranele exterioare ale celulelor Leydig dintre tubii seminiferi (Fig. 3A), iar P450cc a fost exprimat în citoplasma celulelor Leydig testiculare (Fig. 4A). Tratamentul cu DMSO nu a avut un efect semnificativ asupra expresiilor LHR și P450scc. Prin contrast, tratamentul cu CsA a scăzut semnificativ expresiile LHR și P450scc în comparație cu șoarecii martor (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Efectul noului WSSJD asupra apoptozei celulelor spermatogene. Apoptoza celulelor spermatogene din testiculele de șoarece a fost analizată printr-un test TUNEL. Nucleii celulelor apoptotice au fost observați în principal în spermatogonie și spermatocite primare (Fig. 5A). Spermatogoniile sunt mai mari decât spermatocitele și sunt situate mai aproape de membrana bazală (23). Tratamentul cu DMSO nu a avut un efect semnificativ asupra numărului de celule spermatogene apoptotice din testicule. Prin contrast, tratamentul cu CsA a crescut semnificativ numărul de celule spermatogene apoptotice în comparație cu grupurile de control și DMSO (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Efectele noului WSSJD asupra supraviețuirii și apoptozei timpurii a spermatozoizilor. Pentru a verifica efectele protectoare ale noului WSSJD împotriva apoptozei spermatozoizilor induse de CsA, au fost determinate supraviețuirea și apoptoza timpurie a spermei în epididim. Spermatozoizii epididimal au fost colorați cu PI sau anexină V și analizați prin citometrie în flux (Fig. 6 și 7). În urma rezultatelor menționate mai sus, tratamentul cu CsA a redus semnificativ procentul de spermatozoizi vii și a crescut semnificativ procentul de spermatozoizi apoptotici timpurii (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Discuţie
S-a documentat anterior că utilizarea pe termen lung a CsA ca agent imunosupresor afectează capacitatea de reproducere (6). Xu (24) a raportat că morfologia și vitalitatea spermei la pacienții tratați cu CsA au fost semnificativ mai mici decât cele dintr-un grup netratat, așa cum sa observat în probele de sperma a 26 de primitori de transplant renal tratați cu diferite doze de CsA și 12 voluntari sănătoși. Sa observat, de asemenea, că ratele deformării capului spermatozoizilor au fost semnificativ mai mari la primitorii tratați cu CsA (24). Aceste rezultate au sugerat că CsA a avut un efect dependent de doză asupra parametrilor spermei. Prin urmare, sunt justificate studii pentru a identifica noi agenți farmacologici capabili să atenueze leziunile testiculare induse de CsA și să îmbunătățească capacitatea de reproducere masculină după transplantul de organe.
Micromediul specific al testiculului promovează spermatogeneza și astfel afectarea structurii și funcției testiculare poate duce la oprirea spermatogenă(25). Monteiro și colab. (26) au tratat șobolani Wistar cu CsA la o doză de 15 mg/kg pe zi timp de 56 de zile și au observat o proporție volumetrică crescută de țesut conjunctiv și o proporție volumetrică scăzută de celule Leydig la șobolanii tratați cu CsA. S-a observat, de asemenea, că CsA a provocat degenerarea epiteliului seminifer, ducând la vacuolizarea celulelor Sertoli, spermatide rotunde și alungite anormale și acumularea de citoplasmă reziduală la marginea epiteliului adiacent lumenului (26). În studiul de față, șoarecii Kunming au fost tratați cu 15 mg/kg CsA zilnic timp de 30 de zile, ceea ce a dus la contracția și scăderea diametrelor tubilor seminiferi, reducerea straturilor epiteliului seminifer, aranjarea dezordonată a celulelor seminifere, scăderea maturii. spermatozoizi în lumen și un scor Johnsen semnificativ scăzut.
În plus, tratamentul cu CsA a afectat grav structura testiculară. Prezentul studiu a evaluat, de asemenea, efectele protectoare ale noului WSSJD, ca un nou medicament chinezesc, asupra testiculelor șoarecilor tratați cu CsA. S-a observat că straturile epiteliale seminifere testiculare și aranjamentul celulelor seminifere au fost restaurate în urma tratamentului cu WSSJD nou. În plus, șoarecii din noul grup WSSJD au prezentat tubuli seminiferi integrati fără contracție sau colaps și au avut un scor Johnsen semnificativ mai mare în comparație cu șoarecii tratați cu CsA. Aceste rezultate au sugerat că WSSJD a reparat semnificativ leziunile testiculare induse de CsA, indicând că acest compus medicinal pe bază de plante poate fi un tratament eficient în prevenirea leziunilor testiculare induse de CsA. Dacă această reparație celulară depinde sau nu de nișa din epiteliu este, de asemenea, o întrebare importantă, care ar trebui investigată în studiile viitoare.
Axa hipotalamo-hipofizo-testiculare are un rol important în reglarea activității genitale (27). Dezvoltarea și funcționalitatea organelor genitale masculine sunt reglate de hormonii din hipotalamus și glandele pituitare (28). Krueger et al (29) au tratat șobolani Sprague Dawley cu 25 mg/kg/zi CsA sau 40 mg/kg/zi CsA timp de 6 zile și au observat că nivelurile serice de LH și FSH au crescut de 2-4 ori, în timp ce expresia P450scc a scăzut la 30% din cea din grupul de control. În plus, nivelurile de testosteron seric au fost semnificativ scăzute la șoarecii tratați cu CsA, rezultând în spermatogeneză afectată (29). În studiul de față, sa demonstrat că tratamentul cu CsA a scăzut semnificativ expresia LHR în celulele Leydig. Deși LH seric a fost crescut, scăderea expresiei LHR poate să fi afectat recuperarea mediată de LH a biosintezei testosteronului și să scadă expresia P450scc, ca enzimă limitatoare de viteză a biosintezei testosteronului (30), afectând astfel biosinteza testosteronului de către celulele Leydig. Ingredientele noi din noul WSSJD, cum ar fi coarnele de piloză, prezintă efecte similare cu hormonii sexuali (12), care pot îmbunătăți nivelul seric de testosteron și pot scădea nivelul seric de LH, crescând astfel expresia LHR și p450scc în celulele Leydig. În special, rezultatele prezente au indicat că noul WSSJD a stimulat biosinteza și secreția de testosteron în celulele Leydig pentru a promova spermatogeneza.
Stresul oxidativ indus de CSA și deteriorarea testiculelor induc displazia spermatozoizilor și a celulelor spermatogene (31). S-a raportat că tratamentul pe termen lung cu CsA dăunează sistemului antioxidant din țesuturile testiculelor animale, ducând la scăderea nivelurilor de glutation, glutation peroxidază și peroxid de hidrogen și niveluri crescute de dialdehidă malonică în testicule (31). Prin urmare, nivelurile excesive de specii reactive de oxigen din țesuturile testiculare nu pot fi eliminate, ceea ce duce la peroxidarea lipidelor membranei spermatozoizilor, deteriorarea ADN-ului și scăderea vitalității spermei. În studiul de față, s-a observat că tratamentul cu CsA a crescut semnificativ ruperea ADN-ului și rata apoptotică a celulelor spermatogene din tubii seminiferi. Rata de supraviețuire a spermatozoizilor în epididim a scăzut, de asemenea, în timp ce procentul spermatozoizilor apoptotici timpurii a crescut, ceea ce indică faptul că activitatea spermatogenă a testiculelor a fost afectată semnificativ. Türk și colab. (32) au documentat că efectul protector al acidului elagic asupra leziunilor testiculare induse de CsA a fost asociat cu stresul oxidativ la șobolanii masculi. Noul WSSJD utilizat în prezentul studiu conține diverse componente antioxidante, inclusiv medicamentul pe bază de plante Ginseng, despre care s-a demonstrat anterior că scade semnificativ nivelurile de hiperoxid în testicule (14).
În studiul de față, au fost investigate efectele noului WSSJD asupra deteriorării induse de CsA a sintezei testosteronului și a apoptozei spermatogene și s-a observat că noul WSSJD a scăzut semnificativ ratele de apoptoză ale celulelor spermatogene și ale spermatozoizilor și, astfel, au reparat daunele testiculare seminifere. epiteliu. Morfologia tubilor seminiferi testiculari și apoptoza celulelor spermatogene și spermatozoizilor au fost investigate folosind histochimie și citometrie în flux. Deși distribuția ciclului celular și producția zilnică de spermă nu au fost investigate, acestea vor fi în centrul studiilor viitoare ale grupului nostru.
WSSJD a crescut semnificativ nivelurile de testosteron la nivelul testiculelor și a scăzut apoptoza celulelor spermatogene și a spermatozoizilor, ceea ce a reparat eficient leziunile testiculare induse de CsA. Aceste rezultate indică faptul că noul WSSJD poate fi un agent farmacologic util în tratamentul și prevenirea leziunilor testiculare induse de CsA.
Cistanche deserticola roorts intregi
Referințe
1. Pedersen M și Seetharam A: Infecții după transplantul de ficat ortotopic. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.
2. Vora GK și Ciolino JB: Reacția alogrefei corneene asociată cu inflamație nonoculară. Cifra J Ophthalmol 20: 29-31, 2014.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P și Pistorio ML: Psychopathological aspects of kidney transplantation: Efficacy of a multidisciplinary team. World J Transplant 4: 267-275, 2014.
4. El-Gowelli HM și El-Mas MM: Modularea centrală a hipertensiunii induse de ciclosporină. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA și el-SaiedMA: Evaluarea caracteristicilor de mișcare a spermatozoizilor la primitorii de transplant renal infertili folosind analize computerizate. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F și Shalizar Jalali A: Atenuarea deteriorării spermatozoizilor induse de ciclosporină și a embriotoxicității prin extractul apos de fructe de crataegus monogyna. Celula J 15: 198-205, 2013.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G și Chen L: Efectele pe termen lung ale conversiei de la ciclosporină la rapamicină asupra funcției și morfologiei testiculare într-un model de transplant de șobolan. Transplant Proc 45: 763-769, 2013.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM și BelkahiaC: Un model animal de toxicitate testiculară prin ciclosporină: evaluare și protecție. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.
9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB și Menon M: Mecanismul acțiunii ciclosporinei în inhibarea biosintezei testosteronului de către celulele Leydig de șobolan in vitro. Transplant 53: 190-195, 1992.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA și Menon M: Menținerea cantitativă a spermatogenezei la șobolanii tratați cu ciclosporină prin administrarea exogenă de propionat de testosteron. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY și Li ZX: Efectele „Decoct Wenshen Shengjing” asupra apoptozei celulelor spermatogene induse de ciclofosfamidă și a dimetilării histonei H3K9. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (în chineză).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R și Tian SJ: Extracția hormonului sexual din catifea coarne cu CO2 supercritic. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (în chineză).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC și Tang F: Efectele Fructus Lycii și Radix astragali asupra funcției celulelor Sertoli în testiculele de șobolan. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (în chineză).
14. Xu L, Liu XH și Zhang L: Efectele ginsenozidelor totale asupra NO, NOS și capacitatea totală de antioxigen în testiculul șoarecelui. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (În chineză).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT și Hotaling JM: Siguranța și eficacitatea citratului de clomifen la bărbații hiperandrogeni și subfertili. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A și Abdelrahman S: Combinație de vitamina E și citrat de clomifen în tratarea pacienților cu oligo idiopatic ca azoospermie: un studiu prospectiv, randomizat. Andrology 3: 864-867, 2015.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH și Zhang YX: Shengjing Granule: An Effective Chinese Medicine for Spermatogenic Disturbance in Mice. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (în chineză).
18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (în chineză).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z și LiD: Formula Yiqi și Yangyin ameliorează leziunile sistemului hematopoietic induse de iradierea totală a corpului. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.
20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T și Makino T: Efectul Shin'iseihaito asupra reacției alergice murine induse de sensibilizarea nazală. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB și Yang Y: Decoctul Mahuang-xixin-fuzi reduce infecția cu virus gripal la șoarecii cu sindrom de deficiență renală-yang. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.
22. Johnsen SG: Testicular biopsie score count-o metodă pentru înregistrarea spermatogenezei în testiculele umane: valori normale și rezultate la 335 de bărbați hipogonadici. Hormoni 1: 2-25, 1970.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD și Singer-Sam J: Prepararea spermatogoniei, spermatocitelor și spermatidelor rotunde pentru analiza expresiei genelor folosind sortarea celulelor activate prin fluorescență. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Influența ciclosporinei A asupra parametrilor spermei pacienților după transplant renal. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL și Garde JJ: Dincolo de dimensiunea testiculelor: Legături între spermatogeneză și trăsăturile spermei la un mamifer de reproducție sezonier. PLoS One 10: e0139240, 2015.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL și Dolder H: Infuzia de Heteroperys aphrodisiaca reduce efectele colaterale ale ciclosporinei A asupra testiculului. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.
27. Oseko F, Note S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A și Imura H: Influența hiperprolactinemiei cronice induse de sulpiridă asupra axei hipotalamo-hipofizo-testiculare la bărbații normali. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR și Romano MA: Expunerea adulților la bisfenol A (BPA) la șobolani Wistar reduce calitatea spermei cu perturbări a axei hipotalamo-hipofizo-testiculare. Toxicologie 329: 1-9, 2015.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM și Maines MD: Depresia mediată de ciclosporină a receptorilor hormonilor luteinizanți și biosinteza hemului în testiculele de șobolan: un posibil mecanism pentru scăderea testosteronului seric. Endocrinologie 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ și Payne AH: Genotipul la locusul P450scc determină diferențe în cantitatea de proteină P450scc și producția maximă de testosteron în celulele Leydig de șoarece. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A, and Ceribaşi AO: Lycopene protects against cyclosporine A-induced testicular toxicity in rats. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A, and Ateşşahin A: Attenuation of cyclosporine A-induced testicular and spermatozoal damages associated with oxidative stress by elagic acid. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.
