Studiul proteomic cantitativ dezactivează calea fibrinogenului în boala hepatică polichistică Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Rezultate
3.1. Rinichii și ficatul nu urmează aceleași mecanisme chistice
Studiile anterioare au arătat că inactivarea precoce a genei Pkd1 (înainte de p12) declanșează dezvoltarea rapidă a bolii polichistice (fereastră chistică), în timp ce inactivarea după p14 duce la formarea târzie a chistului după 4-5 luni, cu un fenotip ușor (fereastră non-chistică) [19]. Folosind același model ortolog de ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], am investigat dacă această fereastră de dezvoltare renală corespunde în timp cu o fereastră similară de dezvoltare hepatică. Pentru a face o comparație directă cu studiile noastre anterioare [37], șoarecii au fost induși cu tamoxifen să inactiveze gena Pkd1 în zilele postnatale 14 (p14) și 12 (p12) și sacrificați la vârsta de 30 de zile (p30). Interesant, am observat un fenotip chistic în ambele momente cu un grad diferit de boală (ușoară și severă), sugerând că rinichiul și ficatul au ferestre de dezvoltare chistică independente (Figura 1a) și/sau posibile momente diferite și progresie a bolii. . Nu s-au găsit diferențe între bărbați și femele la această vârstă de sacrificare între ambele ferestre de inactivare (n=6 a fost utilizat pentru fiecare grup de mutanți). Animalele mutante p14 au prezentat un fenotip mai blând decât grupul mutant p12 cu valori mai mici ale indicelui chistic, numărului de chisturi și funcției hepatice în funcție de valoarea serului ALP (Figura 1b-d). Acesta este primul studiu care arată diferite ferestre/mecanisme de dezvoltare pentru deficiența hepatică și renală Pkd1. Aceste diferențe moleculare vor trebui determinate în studii viitoare.
Figura 1. Caracterizarea fenotipului hepatic chistic în stadiile p12 și p14 din ziua 30. Deleția Pkd1 la p12 poartă o cistogenie mai severă. (a) Imagini macroscopice și microscopice reprezentative ale hematoxilinei-eozină colorate din ficatul Pkd1cond/cond; Tam-Cre mouse Wild Type (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre−) și Mutant (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ ) cu deleția genei Pkd1 indusă de tamoxifen în ziua 14 postnatală (grupul p14) și 12 (grupul p12). Toți șoarecii au fost sacrificați la p30. Bară de scară, 2 mm (panoul superior) 100 µm (panoul inferior). n reprezintă numărul de probe per grup, iar Bd înseamnă ductul biliar. (b, c) Indicele chistic hepatic și numărul de chisturi ale diferitelor fenotipuri. (d, e) Valorile ALP și ALT din serul sanguin. Barele reprezintă medii ± SEM în toate cazurile. p < 0,05 prin testul t Student (cu două cozi) a fost considerat drept un rezultat semnificativ. ns nu reprezintă semnificație. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Faceți clic pentru a cistanche herba pentru boli de rinichi
3.2. Shotgun și Analiza Proteomică SWATH-MS în PLD
După cum se face referire în Figura 2, am efectuat analize diferențiale de proteom la ambele stadii chistice (p12-boală chistică severă- și p14-boală chistică ușoară-) ale mutanților (KO) în comparație cu animalele de tip sălbatic (WT), pentru a identifica și caracterizează mecanismele moleculare relevante care suferă cistogenie hepatică și progresia bolii.
Figura 2. Schema de flux de lucru ilustrată. Am folosit un model murin ADPKD (Pkd1cond/cond; șoareci Tam-Cre) în care inactivarea genetică a Pkd1 a fost indusă de administrarea de tamoxifen în ziua 10 postnatală (p10) și p11 (progresia rapidă a bolii) sau p15 și p16 (progresia întârziată a bolii). ) conform trecerii de dezvoltare a cistogenezei renale, definind cele două grupe ale studiului denumite p12 și respectiv p14 [19]. Pentru ambele grupuri, am folosit un n egal sau mai mare de șase indivizi de tip sălbatic (WT) și mutant (KO) în fiecare condiție și toate animalele au fost sacrificate la p30. Am studiat proteomul diferențial al ficatului WT și KO în ambele severități ale bolii chistice hepatice (Figura 1), folosind atât analiza proteomică cantitativă SWATH-MS, cât și analiza DDA-MS de achiziție dependentă de date. Dintre proteinele cu o schimbare semnificativă a abundenței, am folosit bioinformatica Figura 2. Schema de flux de lucru ilustrată. Am folosit un model murin ADPKD (șoareci Pkd1cond/cond; Tam-Cre) în care inactivarea genetică a Pkd1 a fost indusă de administrarea de tamoxifen în ziua 10 postnatală (p10) și p11 (progresia rapidă a bolii) sau p15 și p16 (progresia întârziată a bolii). ) conform trecerii de dezvoltare a cistogenezei renale, definind cele două grupe ale studiului denumite p12 și respectiv p14 [19]. Pentru ambele grupuri, am folosit un n egal sau mai mare de șase indivizi de tip sălbatic (WT) și mutant (KO) în fiecare stare și toate animalele au fost sacrificate la p30. Am studiat proteomul diferențial al ficatului WT și KO în ambele severități ale bolii chistice hepatice (Figura 1), folosind atât analiza proteomică cantitativă SWATH-MS, cât și analiza DDA-MS de achiziție dependentă de date. Dintre proteinele cu o schimbare semnificativă a abundenței, am folosit instrumente bioinformatice pentru a detecta noi ținte și căi terapeutice implicate în boală. În cele din urmă, am validat acele ținte utilizând mai întâi strategii in silico (analiza DDA vs SWATH) și în cele din urmă strategii in vivo, precum și RT-qPCR, Western blot și imunohistochimie. p înseamnă ziua postnatală
Modelul de expresie a proteinelor în cistogeneza hepatică În primul rând, am efectuat analiza spectrometriei de masă proteomice prin achiziție dependentă de date DDA-MS sau DDA. Această analiză permite caracterizarea proteomului din probe complete și individuale, asigurând prezența/absența proteinelor cu sensibilitate ridicată dar fără a oferi cuantificarea acestora. Am luat în considerare exclusiv toate proteinele exprimate diferențiat în mai mult de cinci probe independente dintr-un total de șase probe, pentru stadiile p14 și p12 ale indivizilor de tip sălbatic și, respectiv, mutanți (Figura S1). La p14, au fost identificate 1 proteine exclusiv WT (sau reglate în jos pentru boală) și 7 proteine exclusive MUT (reglate în sus), în timp ce la p12 au fost observate opt proteine exclusive WT și șase exclusive MUT (Figura S1).
Apoi, am folosit o metodă care ne-a permis să cuantificăm proteinele exprimate diferențial. Am efectuat o analiză proteomică cantitativă SWATH-MS pe aceleași probe pe care le-am folosit pentru DDA, obținând ~ 1500 de proteine per probă și mai mult de 2000 de proteine în fiecare grup de studiu. În primul rând, am efectuat normalizarea sumei suprafeței totale (TAS) pentru a evalua că eșantioanele noastre au urmat un model de distribuție normal, așa cum se arată în figurile S2 și S3. Apoi, am studiat proteina cu diferențe semnificative între grupurile Wild Type și Mutant. Tabelul 1 prezintă proteinele cu o schimbare semnificativă a abundenței cu o creștere de două ori (reglată în sus) sau scădere (reglată în jos) și o valoare p ajustată semnificativă (în conformitate cu testul t Student parametric) în WT vs. Probele MUT la p14 și p12. În total, șase proteine au arătat diferențe semnificative în abundența proteinelor între grupurile WT p14 și MUT-p14 (cinci proteine reglate în sus și una proteină reglată în jos). Între WT-p12 și MUT-p12, 26 de proteine (20 de proteine reglate în sus și 6 proteine reglate în jos) au prezentat diferențe semnificative (Figura 3a și Tabelul 1). Grafic, aceste variații pot fi observate prin diagramele vulcanilor, care au fost generate prin reprezentarea grafică a modificărilor log(2) pentru toate proteinele identificate față de valoarea lor p-log(10) (Figura 3b). Diferențele semnificative între nivelurile abundenței proteinelor pot fi vizualizate în harta termică cu valori individualizate în funcție de zonele bibliotecii spectrale și nivelul său de grupare în analiza hărții de căldură a clusterului (Figurile 3c și S4). Aceste clustere detectate de analiza SWATH-MS ne ajută să identificăm acele eșantioane separate calitativ, care urmează să fie luate în considerare pentru analiza cantitativă (Figura S5). O analiză statistică multivariată nesupravegheată a fost efectuată utilizând analiza componentelor principale (PCA) pentru a compara datele dintre eșantioane (Figura S6). Harta termică și datele PCA au demonstrat reproductibilitatea între triplicatele eșantionului, deoarece cele trei replici s-au grupat strâns în ambele analize. Putem observa atât în analiza PCA, cât și în analiza clusterului hărții termice (Figurile S5 și S6) cum unele probe nu s-au grupat corect, suprapunându-se între ambele clustere. Cu toate acestea, putem observa tendința de a separa datele în clusterele Wild Type și Mutant. Numărul mai mic de proteine cu diferențe semnificative în p14 vs p12 ar putea fi justificat de gradul diferit de severitate (Figura 2), sugerând că numărul de proteine și căi crește în funcție de severitatea și starea bolii fenotipului chistic.
3.3. Clustering, îmbogățirea căilor și analiza interacțiunii proteină-proteină a expresiei genelor în PLD
Pentru a stabili funcția legată de proteinele exprimate diferențial identificate prin analiza SWATH-MS, am folosit mai multe instrumente bioinformatice și forme de analiză. Analizele de termeni și căi de gene ontologie (GO) au fost efectuate folosind FunRich [39,40], String [41] și Reactome [42]. Proteinele au fost sortate în analiza de îmbogățire a genelor FunRich. În ceea ce privește procesul biologic, grupul cel mai îmbogățit de proteine pentru grupul p14 (chistic ușor) a fost legat de transportul acizilor grași și biosinteza prostaglandinelor, iar pentru grupul p12 (chistic sever) cu activitate fibrinogen/fibrină, aderență celulă-celulă/matrice și metabolism proces (Figura 4a, panoul superior). ANXA2 și complexul de fibrinogen au fost cele două componente celulare cele mai îmbogățite în grupurile p14 și, respectiv, p12. În plus, spațiul extracelular a fost componenta celulară cu cel mai mare procent de proteine în ambele grupuri (Figura 4a, panoul inferior). În mod similar, aceeași analiză a fost stabilită cu analiza șirurilor, identificând diferite procese metabolice ca principal proces biologic, iar spațiul extracelular ca componentă celulară cea mai îmbogățită; în concordanță cu rezultatele GO (Figura S7a). În cele din urmă, am repetat analiza cu platforma Reactome, constatând că metabolismul și sistemul imunitar erau căile cele mai îmbogățite (Figura S7b).
De asemenea, a fost efectuată analiză proteină-proteină sau cluster bazată pe analiza șirurilor pentru a investiga posibile interacțiuni proteină-proteină (interacțiuni cu dovezi experimentale). Numeroase interacțiuni cu proteine au fost identificate în diferite grupuri (Figura S8), dar un grup la p14 și altul la p12 au fost cele mai relevante pe baza numărului de interacțiuni dintre proteine și a nivelului de exprimare (Figura 4b). Clusterul p14-conține proteina anexină A2 (ANXA{2_P{{07356) asociată cu mai multe funcții celulare, cum ar fi fibrinoliza, motilitatea celulară (în celulele epiteliale), o proteină înrudită cu actina citoscheletul și interacțiunile celulă-matrice [43], interacționând cu alte două proteine implicate în transportul lipidic intracelular (FABP1_P12710 și FABP5_Q05816). Interesant este că un alt grup relevant de proteine a fost identificat în clusterul p12-cu o interacțiune proteină-proteină foarte puternică între mai mulți fibrinogeni (FGL{1_Q71KU9, FIBB{_Q8K0E8, FIBA{{22) }}E9PV24 și FIBGG_Q8VCM7). Fibrinogenii sunt implicați în creșterea hepatocitelor și mediază răspândirea trombocitelor din sânge, colagenul interstițial și leziunile fibrotice [44]. În plus, s-a descoperit că proteine suplimentare interacționează cu fibrinogene (Figura S8), cum ar fi componenta p amiloid seric (SAMP_P12246), hemopexina (HEMO{_Q91X72) sau hidroxiacid oxidaza 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). În concordanță cu rezultatele șirului, ANXA2 și complexele de fibrinogen au fost, de asemenea, componentele celulare cele mai îmbogățite identificate prin analiza FunRich (Figura 4a). În mod interesant, când am comparat datele obținute prin analiza DDA și SWATH, am confirmat că mai multe proteine identificate prin SWATH au fost identificate și prin analiza DDA, inclusiv câteva legate de proteinele complexe de fibrinogen (SAMP/Apcs și S10A9/S100a9; Tabelul S3).
3.4. Validarea analizei SWATH-MS demască complexul de fibrinogen ca un nou mecanism molecular legat de PLD
Pe baza acestor date, am selectat din analiza SWATH-MS (Figura S9) proteinele modificate legate de complexul de fibrinogen în stadiile p12 și p14 pentru validarea in vivo cu RT-qPCR, Western blot și imunohistochimie, pentru a stabili confirmarea lor cât mai posibilă. ținte ale bolii. Opt din 10 dintre aceste proteine selectate au fost validate la nivel de ARNm prin RT-qPCR (Figura 5); unul suprareglat la 14-etapa (ANXA2_P07356) și la p12-grup (SAMP{_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO{_Q91X72, FIBA{_E9PV24 și FIBG{_Q8VCM7) și unul jos- reglementat la grupul p12 (HAOX2_Q9NYQ2). În mod interesant, expresia genică a celor două proteine cu mai multă distanță sau mai puține interacțiuni cu grupul de fibrinogen (ILK și S10A9) au fost singurele care nu au fost validate (Figura 5c).
Reglarea în sus a complexului de fibrinogen (proteinele ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG și HAOX2) a fost confirmată în continuare prin analiza Western blot (WB) (Figura 6). În general, expresia genelor și WB au fost foarte în concordanță cu datele proteomice SWATH-MS. În cele din urmă, am efectuat și validarea imunohistochimică a complexului de fibrinogen în probe de ficat mutant și polichistic (Figura 7). Colorarea fibrinogenului a fost puternic reglată în celulele epiteliale care căptușesc chistul și dilatațiile canalelor biliare (Figura 7a). Aceste rezultate demascează, pentru prima dată, complexul de fibrinogen ca o posibilă cale legată de cistogenia hepatică și ca o posibilă țintă terapeutică viitoare pentru PLD.
Figura 5. Validarea posibilelor ținte PLD prin RT-qPCR. Expresia genică a 8 până la 10 ținte selectate corelate cu datele SWATH-MS. RT-qPCR ale anexei A2 țintă p14 selectate reglate în sus (Anxa2) (a); p12 reglat în sus vizează componenta p amiloid, ser (Apcs, gena SAMP), fibrinogen-like 1 (Fgl1), lanț de fibrinogen beta (Fgb), hemopexină (Hpx), lanț de fibrinogen alfa (Fga), lanț de fibrinogen gamma (Fgg) (b), kinaza legată de integrină (Ilk) și proteina de legare de calciu S1{0{{30}} A9 (S1{00a9) (c); și p12 țintă țintă hidroxiacid oxidaza 2 (Hao2) (d). n=6 a fost utilizat pentru fiecare grup de proteine. Gapdh a fost folosit ca genă de menaj. Barele reprezintă medii ± SEM. Sa folosit testul t Student cu două cozi și o valoare de p < 0,05 a fost considerată semnificativă. ns: nesemnificativ (p mai mare sau egal cu 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Figura 7. Complexul de fibrinogen este reglat în sus în epiteliul chistic. (a, b) Imagini reprezentative ale imunohistochimiei fibrinogenului în canalul biliar (panoul superior) și parenchimul hepatic (panoul inferior) (a) și cuantificarea acestuia (b). n=6 a fost folosit pentru fiecare grup. Analiza imunohistochimică a arătat o reglare în sus a fibrinogenului prin epiteliul chistic. Probele au corespuns grupului p12. Barele de scară reprezintă 100 µm. Bd înseamnă canal biliar. Barele reprezintă medii ± SEM. Sa folosit testul t Student cu două cozi și o valoare de p < 0,05 a fost considerată semnificativă. *** p < 0,001.
Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
