Quercetina îmbunătățește starea redox miocardică la șobolanii cu diabet de tip 2

Pentru mai multe informații contacteazătina.xiang@wecistanche.com

Obiectiv. Datele emergente indică acest lucrustresul oxidativeste strâns asociat cu patogeneza bolilor cardiovasculare în diabetul zaharat de tip 2 (T2DM). Prezentul studiu și-a propus să evalueze efectul celui mai abundent flavonoid în dieta umanăquercetină(Q) cu privire la starea redox miocardică la șobolanii cu T2DM.

Metode. T2DM a fost indus la șobolanii masculi Wistar printr-o dietă bogată în calorii (timp de 14 săptămâni) și două injecții cu streptozotocină (25 mg/kg bw) aplicate în patru săptămâni de dietă, o dată pe săptămână timp de două săptămâni. Q a fost administrat intragastric prin gavaj într-o doză de 10 sau 50 mg/kg de greutate corporală timp de 8 săptămâni începând din a 8-a zi după ultima injecție cu streptozotocină. Șobolanii martor au primit tampon citrat și la șapte zile după ultima injecție STZ, nivelurile bazale de glucoză au fost măsurate la toate animalele.

Rezultate. Administrarea de Q a crescut sensibilitatea la insulină la șobolanii diabetici cu un efect mai pronunțat la o doză de 50 mg/kg bw. Q a scăzut și oxidarea radicalilor liberi în mitocondriile inimii animalelor diabetice, limitând astfel formarea de produse proteice de oxidare avansată într-o doză- în mod dependent și a normalizat activitatea enzimelor antioxidante (superoxid dismutază, glutation peroxidază, glutation reductază) în mitocondriile cardiace, independent de doza utilizată. În plus, Q în ambele doze a prevenit dezvoltarea stresului oxidativ la șobolanii T2DMcardiomiociteprin reducerea activităților NADPH oxidazei și xantinoxidazei.

Concluzii. Descoperirile demonstrează că Q în ambele doze de 10 mg/kg și 50 mg/kg poate proteja de dezvoltarea stresului oxidativ în cardiomiocite la șobolanii diabetici. Datele prezente indică faptul că utilizarea Q poate contribui la ameliorarea riscului cardiovascular la pacienții cu DZ2.

Cuvinte cheie: quercetină, diabet zaharat tip 2, cardiomiocite, stres oxidativ

Diabetmellitus (DM) este una dintre urgențele de sănătate globale cu cea mai rapidă creștere din secolul 21*. Potrivit Federației Internaționale de Diabet, 463 de milioane de oameni din întreaga lume au avut diabet zaharat în 2019 și se presupune că acest număr va ajunge la 700 de milioane până în anul 2045. DZ este asociată cu o gamă largă de afecțiuni cardiovasculare care cresc, în mod colectiv, riscul de deces cardiovascular cu 132. procent la diabetici comparativ cu persoanele fără DZ (IDF Diabetes Atlas 2019).

Se știe că DM provoacă modificări specifice în structura și funcția miocardului independent de boala coronariană sau hipertensiunea este definită în mod obișnuit ca cardiomiopatie diabetică (DCM). DCM se manifestă prin disfuncție diastolică urmată de anomalii ale funcției sistolice, care pot duce la insuficiență cardiacă. (Liu et al.2014). De asemenea, se știe că tulburările metabolice în cardiomiocite la DCM (hipertrofie, inflamație, apoptoză, fibroză) sunt strâns asociate cu dezvoltarea stresului oxidativ (Kayama et al.2015).

Speciile reactive de oxigen (ROS), inclusiv anionul superoxid, radicalul hidroxil și peroxidul de hidrogen sunt molecule de semnalizare critice cu roluri importante atât în ​​fiziologia cardiacă, cât și în boli. Ambele surse citosolice, inclusiv NADPH oxidaze (NOX), xantin oxidaza (XO), ciclooxigenazele și enzimele citocrom P450, precum și sursele mitocondriale, cum ar fi lanțul respirator și monoaminoxidazele, contribuie la pool-ul intracelular de ROS. În condiții fiziologice, semnalizarea ROS cardiacă reglează dezvoltarea inimii și maturarea cardio-miocitelor, manipularea calciului cardiac, cuplarea excitație-contracție și tonusul vascular. Cu toate acestea, condițiile patologice ale producției nereglementate de ROS conduc la niveluri crescute de ROS, ceea ce poate duce lastresul oxidativprin deteriorarea oxidativă a ADN-ului, proteinelor și lipidelor, precum și disfuncția mitocondrială și moartea celulelor (Peoples et al. 2019). Într-adevăr, producția dereglată de ROS și stresul oxidativ au fost implicate în multe boli cardiace, inclusiv cardiomiopatia diabetică (Ritchie și Abel 2020).

Producția excesivă de ROS de către mitocondrii poate afecta direct funcția contractilă a miocardului prin modificarea oxidativă a enzimelor și canalelor ionice care participă la reglarea ciclului de excitație-relaxare (Brown și Griendling 2015; Bai et al. 2016). ROS stimulează proliferarea cardiomiocitelor și activează fibroblastele și metaloproteinazele matriceale, care duc la hipertrofie și remodelare a miocardului având ca rezultat formarea insuficienței cardiace (DOria et al.2020). Prin urmare, se sugerează că acțiunea farmacologică care vizează reducerea supraproducției de ROS poate fi eficientă pentru prevenirea și corectarea complicațiilor cardiovasculare diabetice.

În prezent, s-a stabilit că aportul alimentar de polifenoli naturali, în special de flavonoide, poate reduce riscul de diabet și boli cardiovasculare, iar mecanismele de protecție pot depinde nu numai de efectele antioxidante și antiinflamatorii ale flavonoidelor, dar pot include și acestea. proprietăți care afectează glicemia, utilizarea glucozei și secreția de insulină (Ghorbaniet al.2019; Lutz et al.2019).

Quercetină(Q;3,5,7,34-pentahidroxi flavon) este cel mai abundent flavonoid din dieta umană. Există o gamă largă de funcții biologice ale Q, inclusiv efecte asupra căilor implicate în inflamație, diabet și boli cardiovasculare (Zahedi et al. 2013). Mai multe studii au demonstrat mecanismele efectelor antidiabetice ale Q, inclusiv

scăderea peroxidării lipidelor, creșterea activității enzimelor antioxidante (de exemplu, superoxid dismutază, SOD; glutation peroxidază, GPX; catalază, CAT), absorbție redusă a glucozei în intestin datorită inactivării transportorului GLUT2 și alții (Shi et al.2019; Salehi et al.2020). Efectul cardioprotector al lui Q asupra diferențiatelorcardiomiocite, din cauza inactivării căilor de semnalizare protein kinazei activate de mitogen și protein kinazei B, a fost, de asemenea, demonstrat (Daubney et al.2015).

Cercetările viitoare dedicate înțelegerii mecanismelor de acțiune cardioprotectoare în diabet ar putea contribui la îmbunătățirea îngrijirii diabetului.

Scopul prezentei lucrări a fost de a studia efectul quercetinei asupra statusului redox al cardiomiocitelor la șobolani cu diabet zaharat de tip 2 (T2DM).

Materiale și metode

Produse chimice. Toate substanțele chimice utilizate au fost de calitate a reactivului analitic și au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO, SUA). Quercetina a fost furnizată de PJSCSICBorshchahivskiy Chemical-Pharmaceutical Plant (Kiev, Ucraina) și conținea un minim de 96,5% din substanța activă.

Design experimental. Prezentul studiu a fost aprobat de comitetul de bioetică al „Institutului V. Dani-levsky pentru probleme de patologie endocrină a Academiei Naționale de Științe Medicale din Ucraina” (Harkiv, Ucraina) și realizat în conformitate cu Convenția Europeană pentru Protecția Animalelor Vertebrate. Folosit în scopuri experimentale și în alte scopuri științifice (Strasbourg, 1986).

Experimentele au fost efectuate pe 32 de șobolani Wistar masculi (12-în vârstă de o săptămână, 200-230 g greutate corporală, bw), care au fost găzduiți în cuști de plexiglas (3 animale per cușcă) la o temperatură de 22±1 grad C într-un ciclu de lumină/întuneric constant de 12-oră.

S-a folosit modelul animal de T2DM indus de o dietă bogată în calorii combinată cu injecții multiple cu doze mici de streptozotocină (STZ). Modelul oferă dezvoltarea a două caracteristici principale ale T2DM: dieta bogată în calorii inițiază rezistența la insulină și STZ în doză mică induce o afectare ușoară a secreției de insulină. Astfel, modelul imită istoria naturală a evenimentelor bolii (de la rezistența la insulină până la disfuncția celulară), precum și caracteristicile metabolice ale DZT2 uman (Skovso 2014).

Șobolanii intacți de control (n=8) au fost hrăniți cu o dietă standard timp de 14 săptămâni. Șobolanii experimentali (n=24) au fost hrăniți cu o dietă bogată în calorii care conținea 15% untură, 25% zaharoză, 1% săruri biliare și 59% hrană standard, timp de 14 săptămâni. Animalele aveau acces liber la apă. În patru săptămâni, șobolanii experimentali au fost injectați intraperitoneal (.p.injectat cu STZ (25 mg/kg bw) o dată pe săptămână timp de două săptămâni (Lin et al. 2010). Sobolanii de control au primit tampon citrat urmând aceeași schemă. La șapte zile după ultima injecție STZ, glucoza bazală a fost măsurată la toate animalele, iar șobolanii experimentali au fost împărțiți în trei grupe: șobolani diabetici netratați (Diabet, n=8) și șobolani diabetici tratați cu Qin în doză de 10 mg/kg bw (Diabet). plus Q10,n=8)sau 50 mg/kg bw (Diabet plus Q50, n{=8)o dată pe zi intragastric prin gavaj timp de 8 săptămâni după inducerea diabetului. Șobolanii diabetici netratați au primit vehicule împreună cu aceeași schemă .

Animalele au fost sacrificate conform protocolului comisiei de etică.

Măsurarea homeostaziei glucozei. Testul de toleranță la insulină intraperitoneală (IPITT) a fost efectuat la șobolani aflați în post peste noapte. Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate inițial la starea bazală ({{0}} min), apoi animalelor li s-a administrat ani. p. injectare de insulină 0,25 U/kg bw (Actrapid, Novo Nordisk, Agsvaerd, Danemarca) urmată de o injectare ip de glucoză (2 g/kg) (Bowe et al.2014). Ulterior, nivelurile de glucoză din sângele din coadă au fost măsurate folosind un analizor de glucoză Eksan-G (Analita Firm Joint Stock Company Ltd., Vilnius, Republica Lituania) la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după încărcarea cu glucoză.

Izolarea mitocondriilor. Mitocondriile au fost izolate prin proceduri convenționale. Inima de șobolan proaspăt excizată a fost omogenizată într-un mediu care conține {{0}}.18 M KCI, 10 mM EDTA, 0,5% albumină serică bovină (BSA), 10 mM HEPES, pH 7,4. Omogenații au fost curățați de resturi și nuclee prin centrifugare de două ori la 500 g (10 min la 4 grade). Mitocondriile au fost granulate din supernatanți la 10000 g (15 min la 4 grade) și resuspendate într-un tampon de izolare.

Fracțiile supernatante post mitocondriale au fost utilizate pentru determinarea activităților XO și NOX. Pentru a elimina EDTA și albumina, granulele mitocondriale au fost centrifugate la 10000g (15 min,4 grade) și resuspendate în tampon de spălare care conține 0,18 M KCl și 10 mM HEPES (pH7,4) de două ori (DiLisa și colab., 1994) .

Spectrofotometrie. Toată spectrofotometria a fost efectuată utilizând spectrofotometrul UV-VIS cu fascicul dublu Shimadzu UV-1800 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonia).

Măsurarea produselor proteice de oxidare avansată (AOPP). Determinarea nivelurilor AOPP a fost efectuată prin metoda modificată a lui Witko-Sarsat și colegii (Sagor et al.2015). Mitocondriile inimii (0,2 mg proteină) au fost tratate cu 0,1% Triton-X100 și diluate în soluție de PBS(pH7,4). KI (1,16 M) a fost adăugat la mediul de testare, urmat 2 minute mai târziu prin adăugarea de acid acetic glacial. Absorbanţa amestecului de reacţie a fost citită imediat la 340 nm faţă de martor. Concentrațiile AOPP au fost exprimate ca echivalent în nmol cloramină T/mg proteină.

Măsurarea activității enzimelor. Activitatea NOX a fost examinată ca producție de O2 dependentă de NADPH prin fracțiunea supernatantului post mitocondrial utilizând reducerea fericitocromului c inhibabil cu SOD (Li și colab. 2002). Fracția postmitocondrială a omogenatului de inimă (1 mg proteină) a fost suplimentată cu 10 mM Tris-HCl (pH7,8), 500 μMcitocrom c, 100 μM NADPH, a fost incubată la 37 grade C timp de 30 de minute cu sau fără 200 U/ml SOD. Reducerea citocromului a fost măsurată prin citirea absorbanței la 550 nm (8=21 mM{-1 cm-).

Activitatea XO a fost testată în soluție de PBS echilibrată în aer (pH7,4) care conținea o fracțiune postmitocondrială a omogenatului inimii (1 mg proteină) la 37 de grade după adăugarea de xantină (concentrația finală 360 μM) prin măsurarea producției de acid uric din modificare. în absorbanță la 295 nm (e=9500M-'cm-') (Lee et al.2014).

Activitatea Mn-SOD în suspensia mitocondrială a fost detectată prin inhibarea reducerii nitroblue tetrazoliului (NBT) cauzată de sistemul xantină-XO ca generator de O2 și absorbanța a fost în cele din urmă determinată la 560 nm. Amestecul de reacție conținea mitocondrii cardiace (0.02 mg proteină),0, 0,05M tampon carbonat (pH10,2), 0,1 mM EDTA, 0,1 mM xantină, 25μM NBT,1 mU/ml XO. Rezultatele au fost exprimate în unități arbitrare (au) de activitate SOD per mg proteină. Unul înseamnă cantitatea de enzimă care provoacă inhibarea cu 50% a ratei de reducere a NBT (Wang et al. 2018).

Activitatea glutationului reductază (GR) a fost măsurată prin urmărirea oxidării NADPH la 340 nm în reacția de reducere a glutationului oxidat (GSSG). Pentru a efectua reacția, mitocondriile din inimă (0,1 mg proteină) au fost incubate timp de 10 min la 37 de grade în tampon de testare care conține 20 mM Tris-HCl （pH7,4）, 0,25 EDTA mM, FAD 10 μM, GSSG 3 mM și NADPH 0,1 mM (Raza și John 2004).

Estimarea activității GPX a fost făcută pe baza capacității enzimei de a cataliza degradarea hidroperoxidului de terțbutil folosind glutation redus (GSH) ca substrat. Amestecul de reacție (pH7.0) conținea mitocondrii cardiace (0,1 mg proteină), 0,56 mM NADPH, 1,0 U/ml GR, 7,5 mM sodiu azidă, GSH 5 mM, EDTA 5 mM și tampon fosfat 0.05 M. S-a adăugat hidroperoxid de terţ-butil (23 mM) pentru a iniţia reacţia. Viteza de formare a GSSG a fost determinată prin reacția GR de la o scădere a absorbanței sondelor la 340 nm (Antunes et al.2002).

Măsurarea conținutului de proteine ​​din probe. Proteina mitocondrială a fost determinată prin metoda Lowry modificată de Miller, cu BSA ca standard (Lowry et al.1951; Miller 1959).

Analize statistice. Datele sunt prezentate ca medie ± eroarea standard a mediei (SEM). Testul Shapiro-Wilk a fost folosit pentru a testa normalitatea distribuției datelor. Pentru comparații multiple de date cu o distribuție normală, a fost efectuată o analiză parametrică unidirecțională a varianței (ANOVA) și a fost utilizată metoda Student-Newman-Keuls pentru a testa diferențele de medie. Valorile au fost considerate semnificative statistic la p<>

Rezultate

Am dezvăluit că nivelul de glucoză bazală la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în calorii și injectați cu STZ a fost semnificativ mai mare decât în ​​grupul de control (Tabelul 1). În plus, zonele de sub curbele glicemice (ASC) obținute în timpul IPITT au fost aproape de trei ori mai mare la animalele diabetice comparativ cu cele martor (Tabelul 1, Figura 1) Aceste date confirmă dezvoltarea deficienței relative de insulină și a rezistenței la insulină la șobolanii experimentali.

Administrarea de Q nu a avut un impact semnificativ asupra hiperglicemiei bazale la animalele diabetice. Cu toate acestea, Q a afectat sensibilitatea la insulină la șobolanii cu T2DM într-o manieră dependentă de doză, scăzând ASC IPITT cu 27% în grupul experimental care a primit 10 mg/kg de medicament și cu 41% în grupul care a primit 50 mg/kg de Q, comparativ cu animalelor care primesc vehicul (Tabelul 1, Figura 1).

Nivelul AOPP din mitocondriile cardiace ale șobolanilor experimentali a fost crescut cu 66%, confirmând dezvoltarea stresului oxidativ în T2DM (Figura 2). Administrarea a dus la scăderea acumulării de AOPP în inima animalelor cu diabet zaharatasupra dozei de medicament. În grupul experimental care a primit 50 mg/kg de Q, concentrația de AOPP a scăzut la nivelul grupului de control, sugerând proprietăți antioxidante ale Q (Figura 2).

După cum se poate observa în Figura 3, stresul oxidativ în mitocondriile cardiace ale șobolanilor cu T2DM a fost însoțit de activitatea indusă a enzimelor antioxidante - Mn-SOD, GPO și GR. Administrarea Q în ambele doze a normalizat activitățile enzimelor antioxidante studiate la animalele diabetice la nivelul grupului martor (Figura 3).

S-a constatat că T2DM a fost asociat cu o creștere de 65% și 52% a activităților NOX și XO, două surse citosolice primare de O2 în cardiomiocite, respectiv, în fracția postmitocondrială a omogenatului inimii la șobolanii experimentali (Figura 4). Utilizarea Q a condus la normalizarea activităților NOX și XO în inima animalelor diabetice, independent de doză (Figura 4).

Discuţie

În prezent, stresul oxidativ definit ca o creștere susținută a radicalilor liberi din cauza unui dezechilibru în producerea și utilizarea acestora este considerat a fi un mecanism universal care combină diferitele căi patogenetice ale complicațiilor cardiovasculare diabetice (Huynh et al.2014).

Stresul oxidativ indus de hiperglicemie joacă un rol principal în patogeneza DZT2 (Shah și Brownlee 2016). Principalele caracteristici patologice ale T2DM sunt reducerea secreției de insulină și scăderea sensibilității la hormon în țesuturile periferice. În prima etapă a studiului nostru, rezistența la insulină a fost modelată la șobolani folosind o dietă bogată în calorii. Timp de patru săptămâni, șobolanii care au primit o dietă bogată în calorii au fost. p. injectat cu STZtore produc un deficit relativ de insulină. Nivelurile crescute ale glicemiei bazale și creșterea ASC în IPITT au indicat dezvoltarea deficienței de insulină și a rezistenței la insulină la animalele model.

Administrarea de Q nu a afectat nivelurile de hiperglicemie bazală la șobolanii diabetici, dar a îmbunătățit sensibilitatea la insulină într-o manieră dependentă de doză. Rezultatele sunt în concordanță cu datele din alte studii privind capacitatea lui Q de a reduce rezistența la insulină (Shi et al. 2019). Q-ul crește utilizarea glucozei în țesuturile periferice și reduce producția hepatică de glucoză. Flavonoidul activează un mecanism independent de insulină care implică protein kinaza dependentă de AMP, care stimulează translocarea transportorului de glucoză GLUT4 în membrana plasmatică a mușchilor scheletici și reglează în jos enzimele cheie ale gluconeogenezei din ficat (fosfoenol-piruvat carboxikinaza și glucoza {{ 6}}fosfatază) (Eid și Haddad 2017). Îmbunătățirea sensibilității la insulină de către Q se poate datora și capacității sale de a crește expresia adiponectinei în țesutul adipos alb, independent de expresia receptorilor activați de proliferatori de peroxizomi (Wein et al. 2010).

Efectul antidiabetic al Q poate fi realizat și prin reducerea absorbției glucozei în intestin prin inactivarea transportorului de glucoză GLUT2 (Gaueret al.2018) și inhibarea activității -glucozidazelor intestinale (Pereira et al. 2011). În plus, s-a demonstrat că Q inhibă enzima 1l-hidroxisteroid dehidrogenaza-1, care joacă un rol cheie în dezvoltarea obezității și a DZT2 prin afectarea acțiunii hormonilor glucocorticoizi în ficat, țesutul adipos și pancreas. -celule (Torres-Piedra et al.2010).

Se presupune că atât dezvoltarea, cât și progresia complicațiilor diabetului se datorează unei creșteri a producției de ROS (Kayama et al. 2015). În cardiomiocite, ROS sunt generate de lanțul mitocondrial de transport de electroni (ETC), NOX și XO (Tsutsui). et al.2011). Se poate susține că mitocondriile sunt principalii factori care contribuie la stresul oxidativ la T2DM (Shah și Brownlee 2016). Dezvoltarea stresului oxidativ în mitocondrii este însoțită de întreruperea căilor de semnalizare sensibile la redox, scăderea fosforilării oxidative și a producției de ATP, deteriorarea ADN-ului mitocondrial și, prin urmare, o creștere suplimentară a producției de ROS. Ca rezultat, cascada patogenă de evenimente moleculare, care se amplifică, duce la lansarea căilor de semnalizare proapoptotică și moartea celulelor. Având în vedere importanța mitocondriilor în metabolismul celular, disfuncția lor poate duce la diferite boli, inclusiv patologia cardiovasculară. Disfuncția mitocondrială apare la pacienții cu boală coronariană, cardiomiopatie, insuficiență cardiacă, accident vascular cerebral și T2DM (Bai et al.2016).

În studiul nostru, dezvoltarea stresului oxidativ în mitocondriile cardiace ale șobolanilor diabetici este evidențiată de acumularea de AOPP. Concentrația de AOPP este un marker relativ nou al stresului oxidativ, care reflectă starea generală redox a proteinelor din celule și țesuturi. AOPP sunt raportate a fi crescute la pacienții cu DZ, boli cardiovasculare, hipertensiune arterială, ateroscleroză (Conti et al.2019), iar nivelul se corelează cu rezistența la insulină și prezența complicațiilor diabetice severe (Gradinaru și colab. 2013; Taylor et al. 2015). Modificările proteinelor oxidative joacă un rol cheie în dezvoltarea disfuncției miocardice diabetice. Modificările redox ale structurilor proteinelor pot duce la disocierea subunităților catalitice ale enzimelor, desfășurarea, agregarea sau fragmentarea proteinelor implicate în contractilitate, cuplarea excitație-contracție, plierea proteinelor, apărarea antioxidantă, metabolismul și manipularea Ca2* în inima diabeticului (Varga). et al. 2015). De asemenea, s-a constatat că AOPP induce semnalizarea proapoptotică în cardiomiocite, ceea ce duce la dezvoltarea DCM (Zhang et al.2016).

La animalele tratate cu Q într-o doză de 10 mg/kg, a fost observată o reducere semnificativă a AOPP în mitocondriile inimii, în timp ce o doză de 50 mg/kg Q a normalizat complet acest marker în comparație cu șobolanii care au primit vehicul.

Efectul antioxidant al Q-ului în mitocondrii poate include mai multe mecanisme principale. Flavonoidele au capacitatea de a elimina ROS datorită configurației hidroxil a inelului B din structură (Kumar și Pandey 2013). Captarea directă a O,-generată în complexul mitocondrial II al ETC în mitocondriile izolate ale inimii de șobolan a fost demonstrată pentru Q (Dudy-lina și colab. 2019). În plus, flavonoidele pot atenua formarea ROS în mitocondrii prin inhibarea complexului I și III al ETC. Inhibarea Q a activității complexului I a scăzut semnificativ producția de H2O2 în mitocondriile izolate ale inimii de șobolan (Lagoa et al.2011). În plus, s-a descoperit că reducerea generării de ROS mitocondriale de către flavonoide este asociată cu proprietăți de decuplare parțială, în special în mitocondriile cardiace (Bernatoniene et al.2014). În plus, s-a demonstrat că flavonoidele stimulează biogeneza mitocondrială prin inducerea coactivatorului transcripțional PGC-la și a regulatorului său din amonte SIRT1. Acesta din urmă duce la stimularea unei serii de factori de transcripție (NRF1, NRF2 și legați de estrogen-a), implicați în reglarea metabolismului energetic și conservarea homeostaziei în mitocondrii (Kicinska și Jarmuszkiewicz 2020).

Ca rezultat al experimentului nostru, creșterea stresului oxidativ în mitocondriile inimii la șobolani diabetici a fost însoțită de inducerea activității enzimelor antioxidante - Mn-SOD, GPO și GR. Este bine stabilit că un mecanism major în apărarea celulară împotriva stresului oxidativ este activarea căii de semnalizare dependente de Keapl/Nrf-2-, care controlează expresia genelor ai căror produse proteice sunt implicate în detoxicarea și eliminarea oxidanți reactivi (Nguyen și colab. 2009). În acest sens, inducerea observată a enzimelor antioxidante în inima animalelor de experiment este implementarea feedback-ului negativ care vizează menținerea homeostaziei redox.

Administrarea de Q în ambele doze a condus la o scădere a activității Mn-SOD, GPO și GR în mitocondriile cardiace ale animalelor de experiment la valori indiferente din punct de vedere statistic față de grupul de control. Deși se știe că Q induce activitatea enzimelor de mai sus (Shi et al. 2019), rezultatele noastre indică faptul că efectul antioxidant al lui Q în cardiomiocite în T2DM este realizat mai mult prin capacitatea sa de a preveni hiperproducția de ROS și, prin urmare, dezvoltarea disfuncție mitocondrială, decât prin stimularea sistemului de apărare antioxidantă. Anterior, s-a demonstrat că utilizarea Q crește capacitatea oxidativă a mitocondriilor și activitatea unor enzime din ciclul Krebs în inima șobolanilor cu T2DM (Gorbenko et al.2019).

După cum sa menționat mai sus, mitocondriile sunt sursa primară, dar nu singura, de ROS în cardiomiocite. Al doilea factor important în dezvoltarea stresului oxidativ în inima diabetică este NOX, cu NOX2 și NOX4 ca izoforme miocardice majore. Funcția principală a NOX este de a genera ROS. NOX2 este localizat în membrana plasmatică și participă la semnalizarea redox intracelulară a receptorului angiotensinei II și a altora, în timp ce NOX4 are în special un semnal de localizare mitocondrială și prezintă activitate constitutivă (Cave et al. 2005). S-a demonstrat că incubarea cardiomiocitelor de șobolan cu proteine ​​glicate precoce a stimulat producția de ROS printr-o activare dependentă de protein kinaza C(PKC) a NOX2 (Zhang și colab. 2006). În plus, hipertrofia cardiacă, fibroza și apoptoza s-au dovedit a fi asociate cu NOX2 suprareglat în inima șoarecilor cu DM de tip 1 și de tip 2 (Ritchie și colab. 2007; Huynh și colab. 2013). O sursă suplimentară de ROS în cardiomiocite este XO, care catalizează oxidarea hipoxantinei și xantinei la acid uric folosind O, ca receptor de electroni și producând O și H2O2, în acest proces. Deși contribuția reacției XO la dezvoltarea stresului oxidativ în diabet nu a fost studiată suficient, s-a demonstrat că inhibitorii XO ameliorează disfuncția cardiovasculară în modelul de insuficiență cardiacă indusă de stimulare (Amado și colab. 2005). În studiul nostru, T2DM a condus la o creștere semnificativă a activităților NOX și XO în inima șobolanilor experimentali. În același timp, administrarea Q independent de doză a normalizat activitatea enzimelor. Până în prezent, mai multe studii au arătat capacitatea lui Q de a inhiba activitatea NOX atât prin reducerea expresiilor subunităților sale, cât și prin prevenirea activării sale prin stimuli extracelulari. Al doilea mecanism ar putea fi realizat prin reducerea fosforilării subunității reglatoare p47phox datorită efectului inhibitor al flavonoidelor asupra PKC (Redondo et al.2012; Jimenez et al. 2015). În plus, se știe că O și metaboliții săi inhibă activitatea XO într-un mod selectiv, formând structura conjugată cu trei inele cu situsul activ și interacțiuni specifice de legare de hidrogen cu resturi relevante catalitic ale enzimei (Taka-Hama și colab. 201l; Cao et al.2014).

În rezumat, studiul nostru a arătat că Q într-o manieră dependentă de doză a scăzut oxidarea radicalilor liberi în mitocondriile miocardice ale șobolanilor cu T2DM, limitând astfel formarea de AOPP. În plus, Q într-o doză atât de 10 mg/kg, cât și de 50 mg/kg a prevenit dezvoltarea stresului oxidativ în inima șobolanilor diabetici, reducând activitățile NOX și XO. Datele obținute sugerează că utilizarea Q poate contribui la ameliorarea riscului cardiovascular în DZ2.