Rapamicina modifică alternativ dinamica mitocondrială în celulele dendritice pentru a reduce leziunea de reperfuzie ischemică renală
Feb 22, 2022
Abstract:Celulele dendritice (DC) sunt celule imunitare unice care pot lega răspunsurile imune înnăscute și adaptive, iar imunometabolismul afectează foarte mult fenotipul lor. Rapamicina este un compus macrolidic care are funcții imunosupresoare și este utilizat pentru a preveni pierderea grefei în transplantul de rinichi. Studiul actual a evaluat potențialul terapeutic al DC tratate cu rapamicină ex-vivo pentru a protejarinichiîntr-un model de șoarece de acutăleziuni renale (AKI). Pentru tratamentul unic cu rapamicină (S) (Rapa-S-DC), Veh-DC au fost tratate cu rapamicină (10 ng/mL) timp de 1 oră înainte de LPS. În schimb, tratamentul multiplu cu rapamicină (M) (Rapa-M-DC) a fost expus la 3 tratamente timp de 7 zile. Doar multiple tratamente ex-vivo cu rapamicină ale DC au indus o reprogramare persistentă a metabolismului mitocondrial. Aceste DC au avut de 18-ori mai multe mitocondrii, au avut rate de consum de oxigen de aproape 4-ori mai mari și au produs mai mult ATP în comparație cu Veh-DC (DC de control tratate cu Veh). Analiza căii a arătat că semnalizarea IL10 este o cale majoră care contribuie la imunofenotipul alterat după tratamentul cu Rapamicină în comparație cu vehiculul cu citokine semnificativ mai scăzute Tnfa, Il1b și Il6, în timp ce regulatorii conținutului mitocondrial Pgc1a, Tfam și Ho1 au rămas crescuți. În mod critic, transferul adoptiv al CD-urilor tratate cu rapamicină la beneficiarii de WT cu 24 de ore înaintea bilateralrinichiischemia a protejat în mod semnificativ perinichide la accidentare cu o îmbunătățire semnificativă de 3-ori înfunctia rinichilor. În sfârșit, infuzia de DC care conțin un număr mai mare de mitocondrii (tratate ex-vivo cu mitocondrii izolate sănătoase (10 µg/mL) cu o zi înainte) a protejat, de asemenea, parțialrinichide la IRI. Aceste studii demonstrează că infuzia preventivă de DC reprogramate ex vivo care au un conținut mai mare de mitocondrii are capacitatea terapeutică de a induce un fenotip reglator antiinflamator pentru a protejarinichide la accidentare.
Cuvinte cheie:celula dentritica; rapamicina; mitocondriile; leziuni renale acute; leziune de reperfuzie ischemică
IntroducerePatobiologia acutăleziuni renaleeste multifactorială și implică interacțiuni complexe întrerenalcelule parenchimatoase și celule imunitare [1,2]. Înrinichi,celulele dendritice convenționale (DC) sunt subgrupul major de celule imune și se găsesc intim în spațiul interstițial de-a lungul întreguluirinichi[3–5]. DC sunt unul dintre tipurile de celule primare implicate în imunitatea înnăscută și sunt esențiale în asigurarea protecției împotriva agenților patogeni. Lucrarea noastră publicată anterior folosind DC derivate din măduva osoasă a demonstrat că terapia cu DC poate regla diferite răspunsuri imune înnăscute și adaptative asociate cu AKI [6,7].
DC sunt localizate extensiv în toate țesuturile, cu un subset de DC (CD11c plus DC) rezidând înrenalparenchim. Cu toate acestea, aceste CD11c plus DC joacă, de asemenea, un rol patogen în agravareleziuni renaleîn urma leziunii de ischemie-reperfuzie (IRI) [8]. IRI este definită ca o leziune rezultată din reintroducerea sângelui oxigenat într-un organ după o perioadă de ischemie și este adesea observată în infarctul miocardic, accident vascular cerebral și transplantul de organe solide. Ca răspuns la IRI, CD11c plus DC cuprind o parte considerabilă din infifiltratul de celule inflamatorii înrenaltesut.
DC-urile sunt capabile să recunoască modelele moleculare asociate patogenului (PAMP) prin diverși receptori de recunoaștere a modelelor localizați pe suprafața DC, cum ar fi receptorii tolllike (TLR) și receptorii NOD-like. Legarea receptorilor de recunoaștere a modelelor (PRR) de PAMP-urile lor specifice are ca rezultat activarea mai multor căi, care includ răspunsuri proinflamatorii, sinteza peptidelor antimicrobiene și inducerea imunității adaptative mediate de limfocite [9]. Cercetări semnificative au fost dedicate studierii modificărilor bioenergeticii celulare a DC la activarea de către PAMP. S-a stabilit că activarea DC cu lipopolizaharide (LPS; un PAMP distinct de bacteriile gramnegative), prin legarea la receptorul specific TLR4 are ca rezultat o schimbare metabolică de la fosforilarea oxidativă foarte eficientă la un proces foarte asemănător cu metabolismul Warburg sau glicoliza aerobă. . Metabolismul Warburg se caracterizează prin devierea piruvatului generat din glicoliză către conversia în lactat pentru producerea de energie și departe de transportul în mitocondrii pentru a fi supus catabolismului prin ciclul TCA, în ciuda disponibilității suficiente a oxigenului. O explicație pentru acest fenomen implică unul dintre numeroasele efecte în aval ale activării TLR4, care este activitatea crescută a serin/treonin kinazei ținta rapamicinei la mamifere (mTOR). Inhibarea mTOR de către rapamicină păstrează funcția mitocondrială în DC activate prin reglarea în jos a iNOS, cu DC tratate cu rapamicin stimulate în prezența LPS prezentând niveluri reduse de glicoliză aerobă [10]. Inhibitorii mTORC1 precum rapamicina sunt utilizați în prezent în transplantul de organe solide ca o posibilă alternativă pentru inhibitorii de calcineurină pentru a evita cronicizarea.renaldeteriorarea alogrefei, deoarece are, de asemenea, potențialul de a extinde CD4 plus CD25 plus celulele T reglatoare [11,12]. Cu toate acestea, utilizarea rapamicinei în transplant poate duce la complicații inflamatorii care includ edem periferic, creșterea creatininei și trombocitopenie. Studiile anterioare au demonstrat că efectele adverse ale stimulilor hipoxici sunt sporite de expunerea la LPS și atenuate de rapamicină [8,13].
Scopul este de a dezvolta metode de utilizare a medicamentelor de grad clinic aprobate de FDA, cum ar fi Rapamicina, pentru a induce DC de reglementare care pot controla răspunsurile imune înnăscute și adaptive nedorite. Scopul acestui studiu a fost de a determina mecanismele de protecție potențiale ale BMDC stimulate cu rapamicină într-un model preclinic de șoarece derinichiIRI. Tratamentul ex-vivo al BMDC cu rapamicin evită orice efecte adverse în afara țintei și complicațiile inflamatorii asociate cu injecțiile sistemice cu medicamente. Doza și momentul optim pentru majoritatea compușilor sau medicamentelor farmacologice depind de diverși parametri. În celulele canceroase, doza mică de rapamicină, comparativ cu doza mare, inhibă diferențial mTORC1 și mTORC2, rezultând fie inhibarea parțială, fie completă a progresiei ciclului celular [14]. Pentru toate studiile noastre de condiționare a BMDC ex-vivo din manuscrisul actual, am ales doza mică de 10 ng/mL de rapamicină pe baza studiilor raportate anterior cu BMDC tolerogene [15,16]. Momentul câte doze (trei sau una) s-a bazat pe munca noastră publicată anterior cu propagarea BMDC-urilor de șoarece și adăugată cu GMCSF [17,18]. Datele noastre actuale demonstrează că atât tratamentele unice, cât și multiple ale DC cu rapamicin induc răspunsuri imunogene mai puțin robuste (citokine inferioare și molecule co-stimulatoare) după stimularea LPS. Transferul DC-urilor tratate cu rapamicină fie unic, fie multiplu protejează în mod egalrinichide la IRI în modele singeneice (șoareci C57BL/6 BMDC → C57BL/6) sau alogene (BALB/c BMDC → șoareci C57BL/6) ale IRI. Cu toate acestea, tratamentul multiplu ex-vivo cu rapamicin (3 tratamente timp de 7 zile), pe lângă reducerea răspunsurilor imunogene, a crescut, de asemenea, numărul și funcția mitocondriilor (Seahorse Analyzer) în comparație cu DC tratate cu vehicul. Aceste observații experimentale sugerează că DC cu un număr mai mare de mitocondrii au potențialul de a deveni reglementare, iar transferul acestor DC poate protejarinichidin leziunea ischemică. După cum a demonstrat studiul nostru recent folosind DC tratate cu FTY720 [18], transplanturile farmacologice sau mitocondriale care induc un număr mai mare de mitocondrii în celulele imune (DC sau macrofage) determină, de asemenea, aceste celule să aibă un fenotip antiinflamator, un efect posibil din cauza menținerii mitocondriilor. fosforilare oxidativă (OXPHOS) și cu trecere redusă la glicoliză pentru energie după stimulare. În aceste efecte, am crescut exogen numărul de mitocondrii în DC pentru a testa dacă un număr mai mare de mitocondrii poate induce un fenotip reglator prin utilizarea transplanturilor mitocondriale. Transferul acestor Mito-DC protejatrinichide la IRI; totuși, spre deosebire de Rapa-DC, aceste Mito-DC nu au răspunsuri imunogene reduse (MHCII, molecule co-stimulatoare și citokine) după stimularea LPS, indicând posibil faptul că creșterea numărului de copii mitocondriilor poate depăși modificările funcționale induse de stimularea LPS exogenă. În acest studiu și așa cum s-a demonstrat anterior [6,7,18], DC injectate sistemic (tratate cu vehicul, rapamicină sau mitocondrii) în doză de jumătate de milion se găsesc predominant doar în splină și se găsește puțin sau deloc semnal. înrinichi. În splină, cum ar fi CD-urile FTY720-, rapamicina și CD-urile bogate în mitocondrii pot induce un răspuns anti-inflamator care rezultă în protecție împotrivarinichiIRI. Aceste descoperiri seminale oferă dovezi noi care sugerează creșterea numărului mitocondrial (exogen prin transplanturi mitocondriale sau prin intervenție farmacologică (FTY720 sau rapamicină)) în celulele imune poate fi o nouă modalitate terapeutică pentru a regla în cele din urmă răspunsurile lor imunologice pentru prevenirea și/sau tratamentele timpurii aleleziuni renale.
Materiale și metode
ȘoareciToate procedurile și manipularea animalelor au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, iar numărul de protocol Bajwa UTHSC, 18-080, data aprobării 28.09.2018 a fost aprobat de Universitatea din Comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor din Tennessee Health Science Center (UTHSC). Politicile privind îngrijirea animalelor de laborator urmează Politica Serviciului de Sănătate Publică privind îngrijirea umană și utilizarea animalelor de laborator. Toate rezultatele sunt raportate într-o manieră conformă cu ghidurile ARRIVE [19]. Pentru toate studiile de transfer, șoarecii C57BL/6J și BALB/c au fost achiziționați de la The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, SUA). Șoarecii au fost menținuți în carcasă standard de vivarium cu un ciclu de lumină/întuneric de 12-h pe o dietă de mâncare și apă era disponibilă gratuit.
Leziunea de ischemie-reperfuzie renală Toate procedurile chirurgicale detaliate au fost urmate așa cum a fost raportat anterior [18]. Șoarecii masculi C57BL/6 (8-12 săptămâni) au fost supuși la 26-min ischemie bilaterală urmată de reperfuzie de 20-24 ore. Pe scurt, toți șoarecii masculi au fost anesteziați cu o injecție intraperitoneală (ip) dintr-un amestec de ketamina și xilazină, cu injecție subcutanată de buprenorfină și plasați pe un tampon cald pentru a menține temperatura corpului la 34,5-36 ◦C. Șoarecii au fost apoi randomizați la condiția de operare simulată sau IRI. S-a efectuat incizia laterală a flancului. Temperatura corpului a fost verificată și menținută pe toată perioada ischemică. Șoarecii operați cu șmecherie au suferit aceeași procedură, cu excepția prinderii vaselor și a închiderii rănilor chirurgicale. Șoareci care aveau unulrinichifără reperfuzie la 24 de ore după ischemie au fost excluse din toate analizele.
Evaluarea funcției renale și a histologieiSângele a fost recoltat sub anestezie din sinusul retro-orbital, iar creatinina plasmatică (mg/dL) a fost determinată prin utilizarea unei metode enzimatice cu modificări minore din protocolul producătorului (Diazyme Laboratories, Poway, CA, SUA) și azot din urină din sânge (BUN). ) și măsurarea creatininei a fost efectuată utilizând un kit QuantiChrom Urea Assay Kit (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, SUA) așa cum s-a descris anterior [18,20]. Pentru histologie,rinichiau fost fixate peste noapte în 4% PLP sau 10% formol și încorporate în parafifină.Rinichiau fost pregătiți pentru colorarea H&E așa cum s-a descris anterior [18] și fotografiile au fost realizate cu ajustarea luminozității/contrast făcută cu microscopul EVOS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Pentru cuantificarea scorului leziunii tubulare, secțiunile au fost evaluate prin numărarea procentului de tubuli care au prezentat necroză celulară, pierderea marginii periei, formarea gipsului și dilatarea tubului, după cum urmează: 0=normal; 1=Mai mic sau egal cu 10 la sută ; 2=10 până la 25 la sută; 3=26 până la 50 la sută; 4=51 până la 75 la sută; 5=Mai mare sau egal cu 75 la sută . Cinci până la 10 fifields din fiecare medulă exterioară au fost evaluate și marcate într-o manieră orboasă. Modificarea histologică a fost exprimată ca necroză tubulară acută (ATN), punctată așa cum a fost descris anterior [7,21]. Celulele apoptotice au fost detectate prin testul TUNEL (kit In Situ Cell Death Detection, TMR Red; Roche, Basel, Elveția) conform instrucțiunilor producătorului.
Cultură și transfer adoptiv de măduvă osoasă (BM)-derivate-celule dendritice (DC).Au fost utilizați șoareci masculi C57BL/6J sau BALB/c WT cu vârsta de 8-10 săptămâni pentru a genera DC din precursori întregi de BM [22]. Supernatantul bogat în GMCSF a fost derivat din celule J558L transfectate stabil cu GMCSF de șoarece. Linia celulară a fost un cadou generos de la Dr. Ira Mellman (Departamentul de Biologie, Universitatea Yale, New Haven, CT, SUA). Pe scurt, BM proaspăt izolat a fost cultivat cu 6 ng/mL GMCSF de șoarece recombinant (în total 3 tratamente) timp de 8 zile în RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Doza optimă de 10 ng/ml rapamicină a fost decisă după testarea diferitelor doze (0,1–10 ng/ml). BMDC au fost tratați cu rapamicină 10 ng/mL (Sigma, St. Louis, MO, SUA) pentru un total de trei tratamente sau 1-tratament peste noapte). BMDC au fost tratate cu lipopolizaharidă agonistă TLR4 (LPS; Escherichia coli serotip 0111:B4: 100 ng/mL; Sigma-Aldrich); sau vehicul (1 × PBS) timp de 24 de ore în mediu de cultură pentru studii singeneice (șoareci C57BL/6J BMDC → C57BL/6J) și lăsat netratat pentru studii alogene (șoareci BALB/c BMDC → C57BL/6J). Celulele au fost spălate și 0,5 × 106 celule per șoarece au fost injectate intravenos (iv) în șoareci naivi cu 1 zi înainte de bilateral.rinichiIRI. BMDC-urile au fost etichetate cu MitoTracker CMXRos Red sau MitoTracker Deep Red (100 nM, 30 min @ 37 °C, Invitrogen) sau Mitosox (5 uM; 10 min @ 37 °C; Invitrogen).
PCR cantitativ în timp realNivelul de expresie relativ al ADN mitocondrial (ADNmt) a fost măsurat așa cum a fost descris anterior [23]. Pe scurt, ADN-ul genomic total a fost izolat și s-au folosit cantități egale (5 ng) pentru RTPCR folosind ND1 ca primeri surogat pentru ADNmt și primeri HK2 pentru ADN nuclear (nADN) pentru șoarece și ND6 pentru ADNmt uman, așa cum s-a descris anterior [23,24]. ARN-ul total a fost izolat și transcris invers la ADNc, iar RT-PCR a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [7,25,26].
Izolarea și cuantificarea mitocondriilorMitocondriile au fost izolate din celulele HEK293 așa cum s-a descris anterior [18]. Pe scurt, plăci de 60 cm de celule HEK293 au fost colectate prin adăugarea a 5 mL de tampon de omogenizare (300 mmol/L zaharoză, 10 mmol/L HEPES-KOH, 1 mmol/L EGTA-KOH, pH 7,4) cu 1 mg Subtilisin A protează de la Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich). Un protocol detaliat pentru izolarea mitocondriilor poate fi găsit în manuscrisul nostru publicat anterior [18].
2 Bioanalizator de flux SeahorseBMDC vechi de șapte zile au fost transferate pe o placă de cultură de țesut Seahorse 24-, și a fost măsurată rata de consum de oxigen (OCR), iar parametrii au fost calculați așa cum s-a descris anterior [25] cu următoarea modificare. După măsurarea frecvenței respiratorii bazale, inhibitori de oligomicină (Sigma; 2 µM), FCCP (Sigma; 1,5 µM; cianură de carbonil 4- (triflfluorometoxi)-fenilhidrazonă (FCCP)) și inhibitori ai lanțului de transport de electroni (complexul I și III), rotenonă (Sigma; 0,5 uM) și antimicină A (Sigma; 0,5 uM)) au fost injectate secvenţial în timpul testului. Respirația mitocondrială bazală, respirația legată de ATP, scurgerea de protone (consumul de oxigen non-ATP), respirația maximă, respirația non-mitocondrială, capacitatea respiratorie de rezervă, raportul de control respirator și eficiența de cuplare au fost determinate în celule întregi conform lui Brand și colab. . [27]; N=4-5 godeuri au fost utilizate pentru fiecare grup experimental și experimentele au fost repetate de minim 3 ori.
Analiza citometrică în flux, Western Blot și ELISAAchiziția datelor de citometrie în flux a fost efectuată pe un FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, SUA) cu upgrade Cytek {{{0}}color flflow cytometry (Cytek Development, Inc., Fremont, CA, SUA). Datele au fost analizate de software-ul FlowJo 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, SUA) așa cum a fost descris anterior [6,7,28]. Pentru mediul ELISA a fost colectat de la BMDC la 24 de ore după tratamentul cu 100 ng/mL LPS. Nivelurile de TNF, IL6 sau IL10 au fost măsurate utilizând kituri ELISA de șoarece (Invitrogen) urmând protocolul producătorului și așa cum a fost descris anterior [18]. Veh- sau Mito-DC tratate cu și fără LPS timp de 6 sau 24 de ore au fost utilizate pentru a izola proteinele totale folosind tampon de liză RIPA suplimentat cu cocktail de inhibitor de protează și fosfatază (Thermo Fisher Scientific, Vernon Hills, IL, SUA). Pentru GAPDH, supernatantele lizatelor au fost fie fierte (10 minute la 100 ◦C), iar lizatele au fost lăsate la temperatura camerei timp de 10 minute pentru cocktailul OXPHOS de rozătoare (Abcam, Cambridge, MA, SUA) [18]. Au fost descrise anterior metode mai detaliate [18].
Date și analize statisticeGraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, SUA) a fost folosit pentru a analiza și prezenta datele. Datele au fost analizate, după transformare, dacă a fost nevoie pentru a genera o distribuție normală, prin 2-test t cu coadă sau 1-mod ANOVA cu analiză post-hoc, după caz. Testul t nepereche cu două cozi a fost utilizat pentru analiza a două grupuri. p Mai mic sau egal cu 0,05 a fost folosit pentru a indica semnificația.
Rezultate
Tratamentele multiple cu rapamicina (Rapa-M) induc un număr mai mare de mitocondrii și mai puține DC imunogeneC57BL/6 WT DC-uri au fost izolate și propagate timp de 8 zile în prezența GMCSF și vehicul (1X PBS) sau rapamicină (10 ng/mL), în total trei tratamente. DC au fost tratate cu 100 ng/mL LPS peste noapte. DC tratate cu LPS au fost utilizate pentru RNASeq sau marcate cu diferiți coloranți mitocondriali. Datele RNASeq au confirmat datele anterioare că tratamentul cu rapamicina induce mai puține DC imunogene cu citokine pro-inflamatorii mai scăzute care reglează răspunsurile imune înnăscute și adaptive cu IL10 ca cale majoră de schimbare (Figura materialului suplimentar S1A, B și Tabelul S1). În comparație cu tratamentul cu vehicul, tratamentul cu rapamicină a crescut conținutul mitocondrial în BMDC (Figura 1A) așa cum s-a verificat cu MitoTracker CMXRos Red (50 nM) cu și fără LPS. În mod similar, a existat o etichetare semnificativ mai mare cu MitoTracker Deep Red (100 nM) și o etichetare semnificativ mai mică cu MitoSox (5 uM) și după stimularea LPS peste noapte în Rapa-M-DC comparativ cu Veh-DC (Figura 1B, C). Semi-cuantificarea histogramelor MFI pentru toți coloranții mitocondriali (Figura 1D). În plus, Veh- și Rapa-M-DC au fost colorați folosind JC-1 pentru a verifica dacă tratamentul cu Rapamicin a modificat potențialul membranei mitocondriale. Tratamentul multiplu cu rapamicină nu modifică potențialul inițial al membranei mitocondriilor în comparație cu BMDC-urile de control tratate cu vehicul, așa cum se arată prin imunoffluorescență (Figura materialului suplimentar S2A) și citometrie în flux (Figura materialului suplimentar S2B, C).
(Veh) și etichetat cu (A) MitoTracker CMXRos (50 nM) sau (B) MitoSox (5 µM) sau (C) MitoTracker Deep Red (100 nM) . (D) Analiza semi-cuantificată a MFI a coloranților mitocondriilor etichetate cu date de citometrie în flux. (E) DC-urile au fost însămânțate într-un analizor Seahorse XF-24e, stimulate cu și fără LPS timp de 24 de ore, iar rata de consum de oxigen (OCR) a fost determinată în timpul tratamentelor secvențiale cu oligomicină (1), FCCP (2) și antimicină A/rotenonă (3). (F) Cuantificarea producției bazale de OCR și ATP. (G) nivelurile de ARNm de Pgc1a și Tfam în Veh-DC și Rapa-M-DC tratate cu 100 ng/mL LPS sau lăsate nestimulate timp de 24 de ore. (H) Analiza citometriei în flux a MHC II, moleculelor co-stimulatoare (CD40/80/86) și expresia PDL1 a fost determinată cu și fără stimulare LPS. (I) ELISA pentru IL10, IL6 și TNF din Veh-DC și Rapa-M-DC tratate cu 100 ng/mL LPS timp de 24 de ore. (J-L) niveluri de ARNm de Il10, Tnfa și Il6 în Veh-DC și Rapa-M-DC tratate cu 100 ng/mL LPS sau lăsate nestimulate timp de 24 de ore. * p mai mic sau egal cu 0,05, ** p mai mic sau egal cu 0,01 și *** p mai mic sau egal cu 0,001, ANOVA unidirecțional urmat de post-testul lui Tukey. Datele reprezintă medii ± SEM de triplicate.
Funcția mitocondrială alterată, analiza bioenergetică a fost evaluată folosind Seahorse Bioanalyzer. După cum sa raportat anterior [18], LPS a redus consumul de oxigen în comparație cu controalele Veh în Veh-DC, așa cum era de așteptat (Figura 1E, linie albastră spre neagră). Interesant, DC-urile rapa-M cu sau fără LPS au OCR bazal mai mare (Figura 1E, linie verde spre albastră la momentul zero). Rapa-M-DC a demonstrat un eșec în creșterea capacității respiratorii maxime după injectarea FCCP în celulele nestimulate care a fost menținută cu stimularea LPS, demonstrând că rapamicina abate capacitatea respiratorie de rezervă, așa cum a raportat anterior munca noastră cu FTY-DC [18]. DC tratate cu LPS au redus producția de ATP, măsurată prin OCR (albastru spre negru) în comparație cu Veh-DC. Rapa-M-DC a demonstrat o producție semnificativ mai mare de ATP în comparație cu Veh-DC atât în DC-urile nestimulate, cât și în cele stimulate cu LPS (Figura 1F). Rapa-M-DC-urile au afișat niveluri crescute de ARNm pentru receptorul activat de proliferatorul peroxizomului co-activator gamma 1-alfa (Pgc1a) în comparație cu Veh-DC-urile (Figura 1G) și expresia genei pentru Pgc1a și factorul de transcripție mitocondrial A (Tfam). ) au fost menținute în Rapa-M-DC-uri după stimularea LPS. Aceste date indică faptul că propagarea BMDC-urilor în prezența rapamicinei a crescut conținutul mitocondrial, OCR bazal și producția de ATP.
Pentru a testa dacă rapamicina, în plus față de creșterea numărului și funcției mitocondriilor, a indus și o schimbare a moleculelor co-stimulatoare DC după ce a fost testat LPS. Interesant este că după tratamentul cu LPS, Rapa-M-DC au niveluri de expresie semnificativ mai scăzute ale moleculelor de prezentare a antigenului co-stimulator (CD80, CD{86 și CD4{0), MHCII și PDL1 comparativ cu Veh-DC (Figura 1H, albastru vs. roșu). În mod interesant, Rapa-M-DC au avut niveluri de expresie similare pentru PDL1 în comparație cu Veh-DC, dar au avut o creștere semnificativă a raportului PDL1/CD86 după stimularea LPS în comparație cu Veh-DC tratate cu LPS în care PDL1/CD{{ 18}} a scăzut (Veh/Veh 0,59 ± 0.03 față de Veh/LPS 0,43 ± 0.{{33 }}02, p < 0.001="" și="" rapa/veh="" 0,56="" ±="" 0,001="" vs="" rapa/lps="" 0,73="" ±="" 0,02,="" p="">< 0,05).="" nu="" s-au="" observat="" modificări="" semnificative="" ale="" expresiei="" cd11c="" între="" veh-="" și="" rapa-m-dc,="" deși="" rapa-m-dc="" a="" avut="" un="" semnal="" de="" împrăștiere="" lateral="" mai="" mic,="" indicând="" dimensiunea="" mai="" mică="" a="" celulelor="" după="" stimularea="" lps="" (datele="" nu="" sunt="" prezentate).="" rapa="" m-dc="" au="" avut="" niveluri="" relative="" mai="" mari="" de="" mtdna/ndna="" comparativ="" cu="" veh-dc="" (105,7="" ±="" 8,7="" vs="" 196,8,9="" ±="" 49,3),="" demonstrând="" că="" tratamentul="" cu="" rapamicina="" crește="" numărul="" de="" mitocondrii="" dc.="" rapamicina="" a="" scăzut="" semnificativ="" expresia="" genelor="" il6,="" il10="" și="" tnfa="" induse="" de="" lps="" și="" concentrațiile="" de="" proteine="" ale="" tnf="" și="" il6,="" dar="" a="" menținut="" niveluri="" mai="" mari="" de="" il10="" în="" comparație="" cu="" veh-dc="" tratat="" cu="" lps="" (figura="" 1i-l).="" alte="" gene="" despre="" care="" se="" știe="" că="" sunt="" reglementate="" de="" rapamicină="" (autofagie="" sau="" inflamație)="" sunt="" enumerate="" în="" tabelul="" material="" suplimentar="" s2.="" genele="" după="" lps="" indicate="" în="" verde="" au="" fost="" reglate="" în="" jos,="" iar="" în="" roșu="" au="" fost="" reglate="" în="" sus="" în="" comparație="" cu="" tratamentul="" vehiculului="">
Transferul Rapa-M-DC protejează rinichii de leziuni ischemiceToate DC au fost activate cu 100 ng/mL LPS înainte de transfer în toate studiile singeneice (șoareci C57BL/6 BMDC → C57BL/6). O jumătate de milion de DC au fost injectate cu o zi înainte de 26-min bilateralrinichiIRI. Schema designului studiului (Figura 2A). Ca martor, șoarecii au fost injectați cu 1 × PBS ca martori fără celule (NC). În comparație cu șoarecii tratați cu NC și Veh-DC, șoarecii tratați cu Rapa-M-DC au protejat în mod semnificativrinichidin leziuni, creatinina plasmatică (Figura 2B); modificări similare ale BUN au fost observate la acești șoareci [Sham 41,30 ± 3,4 vs NC 159,75 ± 3,2 vs Veh-DC 151,82 ± 1,5 vs Rapa-M-DC 114,68 ± 16,3; p < 0,05="" nc="" sau="" veh-dc="" vs="" rapa-m-dc].="" modificările="" morfologice="" (figura="" 2c,="" d)="" au="" fost="" paralele="" cu="" studiile="" funcționale.="" șoarecii="" tratați="" cu="" rapa-m-dc="" au="" mai="">rinichiNivelurile de ARNm ale Kim1 [Veh DC 0.016 ± 0.009 față de Rapa-M-DC {{2{{23} }}}.0{01 ± 0.002], Ngal [Veh-DC 2,14 ± 1,2 vs Rapa-M-DC 0,12 ± 0,09] și Tnfa [Veh-DC 0,19 ± 0,15 față de Rapa-M-DC 0,0005 ± 0,0002] comparativ cu șoarecii tratați cu Veh-DC. În aceste studii și așa cum sa demonstrat anterior [6,7,17,18], șoarecii tratați cu Veh-DC la o doză de jumătate de milion au modificări comparabile înfunctia rinichilorșirinichiprofilul citokinei. În studiile de transfer singeneic, șoarecii tratați cu Rapa-M-DC au apoptoză redusă (marcare la capătul de digoxigenină deoxiuridină mediată de deoxinucleotidil transferază terminală [TUNEL]) în comparație cu șoarecii tratați cu Veh-DC (Veh-DC 3,8 ± 1,4 vs Rapa-). M-DC 1,1 ± 0,6;p <0,05); imaginile="" reprezentative="" din="" analiza="" tunel="" sunt="" prezentate="" în="" materialul="" suplimentar="" figura="" s3.="" în="" mod="" interesant,="" nu="" au="" existat="" modificări="" semnificative="" ale="" numărului="" de="" neutrofile="" infifiltrante="" la="" șoarecii="" tratați="" cu="" rapa-m-dc="" în="" comparație="" cu="" veh-dc="" (datele="" nu="" sunt="" prezentate),="" sugerând="" că="" șoarecii="" tratați="" cu="" rapa-m-dc="" ar="" putea="" să="" nu="" aibă="" modificări="" ale="" chemokinelor,="" deși="" funcția="" acestor="" celule="" imune="" înnăscute="" infifiltrante="" poate="" fi="">
Tratamentul unic cu rapamicina (Rapa-S) induce mai puține DC imunogene fără a modifica dinamica mitocondrialăApoi am testat dacă un singur tratament cu rapamicină a fost suficient pentru a induce un fenotip de reglementare, făcând astfel fezabilitatea inducerii fenotipului DC de reglementare mai relevantă clinic. DC-urile WT au fost izolate și propagate timp de 8 zile în prezența GMCSF, în total trei tratamente. DC vechi de șapte zile au fost tratate cu rapamicină (10 ng/mL) înainte de tratamentul cu 100 ng/mL LPS pentru incubare peste noapte și au fost etichetate a doua zi cu MitoTracker CMXRos Roșu (50 nM). În comparație cu tratamentul cu vehicul, tratamentul cu Rapa-S nu modifică conținutul mitocondrial în BMDC (Figura 3A) cu și fără LPS. În mod similar, nu a existat nicio modificare în etichetare cu MitoTracker Deep Red (100 nM) și MitoSox (5 µM) și după stimularea LPS peste noapte în Rapa-S-DC în comparație cu Veh-DC (Figura 3B, C). Semi-cuantificarea histogramelor MFI pentru toți coloranții mitocondriali (Figura 3D). În mod similar, în cazul analizei cu mai multe tratamente, Veh- și Rapa-S-DC au fost colorați folosind JC{{20}} pentru a verifica dacă un singur tratament cu rapamicină modifică potențialul membranei mitocondriale. Tratamentul unic cu rapamicină nu modifică potențialul inițial al membranei mitocondriilor în comparație cu BMDC-urile de control tratate cu vehicul, așa cum se arată prin imunoffluorescență (Figura materialului suplimentar S2A) și citometrie în flux (Figura materialului suplimentar S2B, C). LPS a redus consumul de oxigen în comparație cu comenzile Veh în Veh-DC, așa cum era de așteptat (Figura 3E, linie albastră spre neagră). Rapa-S-DC-urile nu au avut nicio modificare în OCR bazal (Figura 3E, linie verde spre albastră la momentul zero). Când producția de ATP a fost cuantificată, LPS a redus producția de ATP măsurată prin OCR (albastru până la negru) în Veh-DC și Rapa-S-DC (Figura 3F). Cu toate acestea, Rapa-S-DC-urile au afișat niveluri crescute de ARNm pentru Pgc1a în comparație cu controalele Veh, iar aceste niveluri au fost menținute în Rapa-S-DC-uri după LPS (Figura 3G), s-au observat puține sau nicio schimbare în nivelurile de transcriere ale Tfam. Apoi, am testat dacă un singur tratament cu rapamicin a indus o schimbare a moleculelor co-stimulatoare DC după LPS. Interesant este că după tratamentul cu LPS, Rapa-S-DC au niveluri de expresie semnificativ mai scăzute ale moleculelor de prezentare a antigenului co-stimulator (CD80, CD86 și CD4{0), MHCII, și PDL1 în comparație cu Veh-DC (Figura 3H). Rapa-S-DC au avut un nivel de expresie similar pentru PDL1 în comparație cu Veh-DC și au avut scăderi semnificative similare ale raportului PDL1/CD86 după stimularea LPS în comparație cu Veh-DC (Veh/Veh 0. 59 ± 0,03 față de Veh/LPS 0,43 ± 0,002, p < 0,001="" și="" rapa-s/veh="" 0,69="" ±="" 0,02="" față="" de="" rapa-s/lps="" 0,56="" ±="" 0,008,="" p="">< 0,05).="" tratamentul="" unic="" cu="" rapamicin="" a="" redus="" în="" mod="" semnificativ="" expresia="" genică="" a="" il6,="" il10="" și="" tnfa="" induse="" de="" lps,="" împreună="" cu="" concentrații="" mai="" mici="" de="" proteine="" de="" il10,="" cu="" modificări="" mici="" sau="" deloc="" ale="" tnf="" și="" după="" tratarea="" cu="" lps="" (figura="" 3i-l).="" alte="" gene="" cunoscute="" care="" urmează="" să="" fie="" reglate="" de="" rapamicin="" (autofagie="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" și="" lamp2]="" sau="" inflamația="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" și="" ho1])="" au="" fost="" doar="" parțial="" reglate="" în="" comparație="" cu="" vehiculele="" dc="" după="" stimularea="" lps="" (suplimentar="" tabelul="" de="" materiale="">
Transferul Rapa-S-DC protejează rinichii de leziuni ischemiceToate DC au fost activate cu 100 ng/mL LPS sau tratate cu rapamicin (10 ng/mL) înainte de transfer în toate studiile singeneice (C57BL/6 BMDC → C57BL/6 șoareci). O jumătate de milion de DC au fost injectate cu 1 zi înainte bilateralrinichiIRI. Schema designului studiului (Figura 4A). Ca martor, șoarecii au fost injectați cu 1 × PBS ca martori fără celule (NC). În comparație cu șoarecii tratați cu Veh-DC, șoarecii tratați cu Rapa-S-DC au protejat în mod semnificativrinichide la leziuni ale creatininei plasmatice (Figura 4B); modificări similare ale BUN au fost observate la acești șoareci [Veh-DC 151,82 ± 1,5 vs Rapa-S-DC 139,53 ± 3,8]. Modificările morfologice (Figura 4C, D) au fost paralele cu studiile funcționale. Șoarecii tratați cu Rapa-S-DC au mai micirinichiNivelurile ARNm ale Kim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}{{20}}9 față de Rapa -S-DC 0.{0{04 ± 0,002], Ngal [Veh DC 2,14 ± 1,2 vs Rapa-S-DC 0,14 ± 0,008] și Tnfa [Veh-DC 0,196 ± 0,196 ± 0,15 vs Rapa-S-DC 0,0017 ± 0,001] comparativ cu șoarecii tratați cu Veh-DC.
Transferul BMDC alogen al Rapa-M-DC sau Rapa-S-DC protejează în mod egal rinichii de leziuni ischemiceO jumătate de milion de DC au fost injectate cu o zi înainte bilateralrinichiIRI pentru studii de transfer alogene (șoareci BALB/C BMDC→C57BL/6). Schema designului studiului (Figura 5A). Ca martor, șoarecii au fost injectați cu 1x PBS ca martori fără celule (NC). În comparație cu șoarecii tratați cu Veh-DC, șoarecii tratați Rapa-M-DC sau Rapa-S-DC au protejat semnificativrinichide la rănire (Figura 5B). Modificările morfologice (Figura 5C, D) au fost paralele cu studiile funcționale. Șoarecii tratați cu rapamicină DC au mai micirinichiNivelurile de ARNm ale Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 față de Rapa-M-DC 0. 005 ± 0.0{{{30}}2 împotriva Rapa-S-DC 0.{{37} }05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 vs RapaM-DC 0,19 ± 0,11 vs Rapa- S-DC 0,05 ± 0,01] și Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs Rapa-M-DC 0,007 ± 0,003 vs Rapa-S-DC 0,008 ± 0,005] comparativ cu șoarecii tratați cu Veh-DC. În studiile de transfer alogenic, șoarecii tratați cu Rapa-M-DC sau Rapa-S-DC au redus apoptoza TUNEL în comparație cu șoarecii tratați cu Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 vs Rapa-M-DC 7,2 ± 2,5 vs Rapa- S-DC 9,1 ± 0,1).
DC încărcate cu mitocondrii exogene (Mito-DC) cu dinamică mitocondrială mai mare și fenotip mai imunogen după stimularea LPSDC-urile WT au fost izolate și propagate timp de 8 zile în prezența GMCSF, în total 3 tratamente. DC vechi de șapte zile au fost tratate peste noapte cu mitocondrii umane exogene (1 0 µg/mL). În comparație cu tratamentul cu vehicul, mitocondriile DC tratate cu mitocondrii au mitocondrii mai mari. Mitocondriile au fost izolate din linia de celule umane HEK293. BMDC-urile au fost analizate pentru prezența mitocondriilor umane în DC-urile WT de șoarece folosind primeri ADNmt umani pentru NADH dehidrogenază (ND). Conținutul relativ uman de [mtDNA] în Veh-DC a fost de {{10}},26 ± 0,10 față de 16,8 ± 0,59; p < 0,001,="" o="" creștere="" de="" 63-ori="" a="" adn-ului="" genomic="" izolat="" din="" bmdc.="" o="" limitare="" a="" testului="" actual="" este="" că="" măsoară="" adnmt="" uman="" sau="" moue="" în="" raport="" cu="" adn-ul="" nuclear,="" iar="" cantitatea="" mică="" de="" adnmt="" uman="" detectată="" în="" veh-dc="" s-ar="" putea="" datora="" unei="" suprapuneri="" minore="" în="" secvența="" nd="" în="" testul="" pcr="" sau="" posibilității,="" deoarece="" suntem="" care="" prezintă="" expresie="" relativă="" la="" adn-ul="" nuclear="" de="" șoarece.="" pentru="" a="" determina="" dacă="" conținutul="" mitocondrial="" mai="" mare="" a="" modificat="" și="" funcția="" mitocondrială,="" analiza="" bioenergetică="" a="" fost="" efectuată="" folosind="" seahorse="" bioanalyzer.="" lps="" a="" redus="" consumul="" de="" oxigen="" în="" comparație="" cu="" comenzile="" veh="" în="" veh-dc,="" așa="" cum="" era="" de="" așteptat="" (figura="" 6a,="" linie="" albastră="" spre="" neagră).="" mito-dc-urile="" au="" ocr="" bazal="" mai="" mare="" (figura="" 6a,="" linie="" verde="" spre="" albastră="" la="" momentul="" zero).="" la="" tratamentul="" cu="" decuplator="" fccp,="" mito-dc="" a="" demonstrat="" un="" eșec="" în="" creșterea="" capacității="" respiratorii="" maxime="" în="" celulele="" nestimulate="" care="" a="" fost="" menținută="" cu="" stimularea="" lps,="" demonstrând="" că="" tratamentul="" cu="" mitocondrii="" izolate="" abate="" capacitatea="" respiratorie="" de="" rezervă="" (probabil="" pentru="" că="" deja="" la="" ocr="" maxim="" în="" stare="" bazală).="" când="" producția="" de="" atp="" a="" fost="" cuantificată,="" lps="" a="" redus="" producția="" de="" atp="" măsurată="" prin="" ocr="" (albastru="" spre="" negru)="" în="" veh-dc.="" mito-dc="" a="" demonstrat="" o="" producție="" bazală="" ocr="" și="" atp="" semnificativ="" mai="" mare="" în="" comparație="" cu="" veh-dc="" în="" dc-urile="" stimulate="" de="" lps="" (figura="" 6b).="" mito-dc-urile="" au="" afișat="" niveluri="" crescute="" de="" arnm="" pentru="" pgc1a="" și="" tfam="" interesant="" semnificativ="" mai="" scăzut="" în="" comparație="" cu="" controalele="" veh="" (figura="" 6c).="" diferențele="" dintre="" pgc1a="" și="" tfam="" în="" acest="" set="" de="" experimente="" după="" stimulările="" lps="" în="" comparație="" cu="" datele="" din="" figurile="" 1="" și="" 3="" se="" datorează="" probabil="" utilizării="" bmdc-urilor="" balb/c.="" în="" comparație="" cu="" bmdc-urile="" c57bl/6,="" dc="" de="" la="" balb/c="" au="" modificări="" semnificative="" în="" producția="" de="" mitocondrii="" și="" citokine="" după="" stimulare="" [29,30].="" posibilitatea="" datorită="" acestor="" modificări="" ale="" dc,="" istoric="" am="" folosit="" un="" timp="" ischemic="" mai="" mare="" la="" șoarecii="" balb/c="" comparativ="" cu="" c57bl/6="" pentru="" a="" avea="">rinichiaccidentare [6,18]. Aceste date indică faptul că transferul de mitocondrii sănătoase exogene are ca rezultat creșterea conținutului mitocondrial, OCR bazal și producția de ATP. Acest lucru sugerează potențialul pentru un fenotip antiinflamator în DC după tratamentul cu mitocondrii exogene, așa cum se arată în studiul nostru anterior [18]. Apoi, testăm dacă DC tratate cu mitocondrii exogene care are ca rezultat creșterea numărului și funcției mitocondriale au indus, de asemenea, o schimbare a moleculelor co-stimulatoare DC după LPS. În mod remarcabil, cu și fără stimulare LPS, Mito-DC au niveluri de expresie semnificativ mai mari ale moleculelor de prezentare a antigenului co-stimulator (CD80, CD86 și CD40), MHCII și PDL1 în comparație cu Veh-DC (Figura 6D). În plus, Mito-DC-urile au avut un nivel de expresie mai mare pentru PDL1 în comparație cu Veh-DC; cu toate acestea, au avut, de asemenea, o creștere a raportului PDL1/CD86 după stimularea LPS în comparație cu Veh-DC tratate cu LPS (datele nu sunt afișate). Mito-DC a redus semnificativ expresia genică a Tnfa indus de LPS, dar expresia genică mai mare a Il6 și Il10 în comparație cu Veh-DC și concentrații mai mici de proteine de TNF și IL10, dar a menținut niveluri mai mari de IL6 în comparație cu Veh-DC tratat cu LPS (Figura 6E). –H). Alte gene cunoscute a fi reglate de mitocondrii (autofagie [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b și Lamp2] sau inflamație [Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hif1a și Ho1]) au fost parțial reglate după stimularea LPS (Tabelul Material suplimentar S3). Veh-DC și Mito-DC au fost tratate cu LPS timp de 6 și 24 de ore. Au fost măsurate modificările relative ale complexului mitocondrial. Mito-DC tratați cu și fără LPS au niveluri semnificativ mai mari de proteine ale complexelor mitocondriale IV, II și I și niveluri semnificativ mai scăzute ale Complexelor V și III în comparație cu Veh-DC (Figura 6I). Analiza semi-cantitativă a exprimării proteinei relative a complexelor mitocondriale la GAPDH (Figura 6J). Petele de lungime completă sunt furnizate ca figuri suplimentare (Figurile materiale suplimentare S4–S7).
Figura 6. DC-urile încărcate cu mitocondrii (Mito-DC) au funcție mitocondrială și imunogenitate mai ridicate după stimularea LPS în comparație cu Veh-DC. Veh-DC vechi de șapte zile și au fost incubate cu 10 µg/mL mitocondrii HEK293 cu o zi înainte de tratamentul cu 1{00 ng/mL LPS pentru încă 24 de ore sau lăsate nestimulate ( Veh). (A) La 24 de ore după adăugarea mitocondriilor, DC au fost însămânțate într-un analizor Seahorse XF-24e, stimulate cu și fără LPS timp de 24 de ore, iar rata consumului de oxigen (OCR) a fost determinată în timpul tratamentelor secvențiale cu oligomicină (1) ), FCCP (2) și antimicină A/rotenonă (3). (B) Cuantificarea producției bazale de OCR și ATP. (C) Nivelurile de ARNm de Pgc1a și Tfam în Veh-DC și Mito-DC tratate cu 100 ng/mL LPS sau lăsate nestimulate timp de 24 de ore. (D) Analiza citometriei în flux a MHCII, moleculelor co-stimulatoare (CD40/80/86) și expresia PDL1 a fost determinată cu și fără stimulare LPS. (E) ELISA pentru IL10, IL6 și TNF din Veh-DC și Mito-DC tratate cu 100 ng/mL LPS timp de 24 de ore. (F-H) niveluri de ARNm de Tnfa, Il6 și Il10 în Veh-DC și Mito-DC tratate cu 100 ng/mL LPS sau lăsate nestimulate timp de 24 de ore. Datele reprezintă medii ± SEM, * p mai mic sau egal cu 0,05, ** p mai mic sau egal cu 0,01 și *** p mai mic sau egal cu 0,001, ANOVA unidirecțional urmat de post-testul lui Tukey. Datele reprezintă medii ± SEM de triplicate.
Transfer alogen BMDC al Mito-DC ProtectsRinichidin leziunea ischemică O jumătate de milion de DC au fost injectate cu 1 zi înainte bilateralrinichiIRI pentru studii de transfer alogenic Mito-DC (șoareci BALB/C BMDC→C57BL/6). Schema designului studiului (Figura 7A). Ca martor, șoarecii au fost injectați cu 1x PBS ca martori fără celule (NC). În comparație cu șoarecii tratați cu Veh-DC, șoarecii tratați cu Mito-DC au protejat în mod semnificativrinichide la rănire (Figura 7B). Modificările morfologice (Figura 7C, D) au fost paralele cu studiile funcționale. Șoarecii tratați cu Mito-DC au mai micirinichiNivelurile de ARNm ale Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.02 față de Mito-DC 0.{02 ± 0.01], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 vs Mito-DC 0,39 ± {{29} },20] și Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs Mito-DC 0,0028 ± 0,0013] comparativ cu șoarecii tratați cu Veh-DC. În studiile de transfer alogenic, șoarecii tratați cu Mito-DC au redus apoptoza TUNEL în comparație cu șoarecii tratați cu Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 vs Mito-DC 3,0 ± 1,2).
Discuții În studiul curent am demonstrat protecția împotrivarinichiIRI indus de transferul adoptiv al DC tratate cu rapamicină (fie o singură dată, fie de mai multe ori) reglează alternativ funcția DC care depinde de modificările relative ale dinamicii mitocondriilor. Atât tratamentul(le) unic, cât și multiplu cu rapamicină induce CD imunogenice reduse (citokine inferioare și molecule co-stimulatoare). Transferul fie al Rapa-M-DC-urilor sau al Rapa-S-DC-urilor protejeazărinichidin leziunea de reperfuzie ischemică, indicând starea imunogenă redusă a DC modificate cu rapamicină induce protecție. În plus, transferul de Veh-DC care a avut creșteri tranzitorii ale numărului de mitocondrii protejează, de asemenearinichidin IRI (Figura 8A–D)). Din aceste studii putem concluziona că injectarea de DC mai puțin imunogene este esențială pentru inducerea protecției împotriva IRI, un proces care poate fi realizat prin tratament farmacologic (rapamicina) sau prin transferul de mitocondrii exogene sănătoase. După cum s-a raportat anterior [31] și a confirmat în studiile noastre RNAseq, în general, nu există o semnătură tolerogenică clară asociată cu DC modulate cu rapamicină. Deși DC-urile rapamicinei prezintă unele modificări semnificative ale genelor după stimularea LPS în comparație cu DC-urile vehiculului, acestea s-au limitat la RapaM-DC-urile cu semnalizare mediată de citokine și producție de citokine mai scăzute (semnalizare TNF prin producția de NF-kB și IFN), toate critice în ambele răspunsurile imune înnăscute și adaptative. După cum a fost raportat și confirmat anterior în studiul nostru, semnalizarea IL-10 a fost identificată ca calea principală care a fost diferită în DC tratate cu rapamicină cu FDR de 5,87 × 10 4 (Figura materialului suplimentar S1), o citokină caracteristică a semnăturii tolerogene în DC.
Din punct de vedere istoric, CD-urile tolerogene (Tol-DC) sunt identificate ca fiind afectate de maturare sau semi-imature cu o expresie scăzută a co-stimulatoarelor (CD80, CD86, CD40) cu producție crescută de IL10 însoțită de secreție scăzută de IL12 și IFN. , o capacitate mai scăzută de a amorsa celulele T și potențialul de a induce Treg după o stimulare proinflamatoare [32,33]. DC reglatoare sau tolerogene pot fi diferențiate in vitro prin utilizarea de medicamente imunosupresoare sau compuși precum FTY720 [18] sau rapamicina (studiul actual), sau citokine antiinflamatorii precum IL10 [34] sau prin modificare genetică.
Rolul celulelor dendritice în leziunea renală acută (AKI)Deși s-au făcut progrese farmacologice majore pentru prevenirea sau tratarea diferitelor leziuni, niciuna nu este disponibilă pentru AKI, astfel încât aceasta rămâne o povară majoră pentru sănătate [35]. Mai mult, pentru prevenirea sau reducerea răspunsurilor imune adaptative mediate de respingerea alogrefei sau a bolii autoimune, utilizarea medicamentelor imunosupresoare nespecifice este asociată cu efecte secundare adverse. Astfel, utilizarea unui tip de celulă imunitară, cum ar fi DC, care poate viza răspunsurile imune înnăscute și adaptative, reprezintă avantaje. În plus, DC-urile sunt celule importante în imunitate sau toleranță, iar ideea de a utiliza DC reglatoare sau tolerate ex-vivo în terapiile bazate pe celule pentru cancer, tulburări autoimune și transplant a fost investigată [36]. Strategiile farmacologice (FTY720 [18]) sau biologice (modificate genetic) induc DC reglatoare sau tolerogene (Tol-DC) [37], care fie sunt rezistente la maturare, fie au niveluri de maturare mai scăzute, fie sunt activate alternativ, care în cele din urmă exprimă niveluri scăzute de MHC I. sau MHC II și molecule co-stimulatoare precum CD40, CD80 și CD86. Folosind șoareci transgenici CD11c-DTR, am publicat anterior studii care au demonstrat că epuizarea DC-urilor cu toxina difterice a protejat în mod semnificativ șoarecele.rinichidin leziunea de reperfuzie de ischemie (IRI) [7,38] și, dimpotrivă, o creștere dependentă de doză a numărului de DC a exacerbatleziuni renale[7], sugerând că DC ar putea juca un rol major în reglarea AKI. Este demn de menționat că în AKI, modelul de AKI care este utilizat (chimioterapia cu cisplatină sau ischemie) dictează rolul pe care îl joacă DC-urile de a modifica răspunsurile imunologice. În AKI indusă de cisplatină, ablația DC, fie prin utilizarea șoarecilor transgenici, fie prin injecția cu clodronat lipozomal, are ca rezultat mai multe leziuni, deoarece IL-10 produsă din DC în acest model este în cele din urmă necesară pentru a atenua leziunile nefrotoxice [39,40].
Rapamicina: inflamație, celule imunitare, leziune de reperfuzie ischemică (IRI)Studiile publicate anterior au demonstrat rolul protector al rapamicinei în modelele AKI folosind studii IRI care au implicat reglarea infifiltrarii celulelor NKT și ameliorând astfel funcția.leziuni renale[41], în acest studiu, șoarecii au fost tratați oral de trei ori cu rapamicină cu 24 de ore, 1 oră înainte de ischemie și 12 ore după ischemie. Dozarea orală cronică la șoareci cu o zi înainterinichiIRI și în fiecare zi după (până la 7 zile) au dus la o creștere mai mareleziuni renaledatorita inhibitiei derenalproliferarea celulelor tubulare la 1 și 3 zile după ischemie [42]. Acest lucru a fost evident ca într-un model de șoarece de obstrucție ureterală unilaterală (UUO), în care tratamentul cu rapamicină s-a amelioratrinichifibroza prin inhibarea directă a semnalizării mTOR în miofibroblaste și macrofage interstițiale [43]. Aceste studii sugerează că rapamicina poate avea efecte opuse în diferite cazuri acute versus cronicerinichimodele. Cu toate acestea, diferite studii au raportat un rol dăunător al rapamicinei în modelele animale de IRI. Doza orală de rapamicină (4 mg/zi) timp de 7 zile la porcii Yorkshire a afectat vasorelaxarea dependentă de endoteliu și a crescut necroza miocardică într-un model de ocluzie a arterei coronare [44]. Cu toate acestea, la șoareci, tratamentul acut cu rapamicină (cu o oră înainte de ischemie, injecție intraperitoneală) a indus protecția cardio-reglată prin reglarea semnalizării JAK2-STAT3 pentru a proteja împotriva infarctului miocardic [45]. În funcție de calea (gavaj sau subcutanat sau intraperitoneal), dozarea (0.1–6 mg/kg/zi), momentul (devreme sau întârziat) [46] și tipul de model utilizat (inima [47] , ficat [48] saurinichi[41,49]), rapamicina s-a dovedit a fi protectoare [47] sau nu protectoare [50].
Terapia celulară și rapamicinaPropagarea BMDC-urilor de șoarece sau a monocitelor CD14 umane plus pe care le considerăm cronice a indus un fenotip alternativ de protecție sau de reglare în DC, care a reglementat atât răspunsurile imune înnăscute, cât și cele adaptive. În boala letală grefă contra gazdă, DC generate cu rapamicin au scăzut MHC II și moleculele co-stimulatoare, dar au avut o populație mai mare de IL12 producătoare după stimularea LPS. Aceste IL12 producătoare de Rapa-M-DC au îmbunătățit apoptoza celulelor T aloreactive, un mecanism care a implicat IFN [51]. În mod similar, monocitele CD14 plus propagate în prezența rapamicinei au produs, de asemenea, IL12p70 mai ridicate împreună cu niveluri IL27 care au reglat funcția celulelor NK, modificând astfel răspunsurile celulelor T alogene prin IFN [52]. Înrinichi,transferul de Treg tratate cu rapamicină a suprimat semnificativ răspunsurile celulelor T, celulelor mieloide și miofibroblastelor, rezultând îmbunătățirea acute și cronice.boală de rinichicomparativ cu tratamentul direct al șoarecilor cu Rapamicin [53]. În mod similar, transferul adoptiv al celulelor supresoare derivate din mieloid (MDSC) tratate cu rapamicină la șoareci s-a îmbunătățitfunctia rinichilorcu leziuni histologice diminuate și infifiltrarea celulelor imune [54]. Aceste studii oferă dovezi că terapia celulară care implică tratamentul celulelor cu rapamicină înainte de injectare evită efectele secundare adverse care ar putea fi asociate cu tratamentul sistemic cu rapamicină. În plus, am testat utilizarea metforminei sau a unor compuși precum 5-aminoimidazol-4-carboxamidă-1- -4- ribofuranozid (AICAR) pentru a induce un fenotip reglator în DC de șoarece pentru a testa rolul lor în modificarearinichiIRI. La fel ca strategia de dozare utilizată cu rapamicina (Rapa-S-DC), am tratat BMDC-urile cu doze mici de metformină (1 mM) sau AICAR (1 mM) în ziua 7 împreună cu LPS. Am injectat sistemic 0.5 x 106 de metformin-DC sau AICAR-DC cu o zi înainterinichiIRI. Șoarecii tratați fie cu metformin-DC sau AICAR-DC au fost protejați în mod semnificativ în comparație cu șoarecii tratați fie cu NC, fie cu Veh-DC (observații nepublicate, laborator Bajwa). Astfel, mai multe medicamente sau compuși care induc modificări metabolice sau activează calea AMPK ar putea merita testate fie singure, fie în combinație. Este de remarcat faptul că utilizarea mai multor combinații de medicamente sau compuși (metformină sau AICAR) care ar putea completa efectele protectoare ale rapamicinei nu a fost încă explorată atunci când se evaluează utilizarea lor în BMDC. În celulele canceroase, combinarea AICAR cu rapamicina crește eficacitatea rapamicinei pentru a suprima în continuare mTORC2 pentru a induce apoptoza [55]. În celulele T, utilizarea combinată de metformină și rapamicină a fost, de asemenea, testată ca potențial regulator metabolic al punctului de control pentru a influența funcția celulelor T [56]. Astfel, aceste modalități terapeutice combinate ar trebui testate în viitor cu BMDC tolerogene sau de reglementare ca potențiali regulatori direcți sau indirecti ai punctelor de control metabolice.
Rapamicina: Rolul mitocondriilor în celulele dendritice și macrofageFuncțiile DC și macrofagele sunt reglate de metabolismul mitocondrial. Macrofagele de tip 1 [57,58] și DC imunogene (activare mediată de TLR) au tranziție metabolică în care fosforilarea oxidativă mitocondrială este inhibată de oxidul nitric (NO) sintetizat endogen și angajamentul la rate glicolitice aerobe mari [59]. Activarea DC-urilor sau a macrofagelor de către mai mulți agoniști TLR (LPS sau CpG) duce la o creștere rapidă a glicolizei, urmată de o scădere a OXPHOS și a potențialului membranei mitocondriale [59-61]. Un anumit rol pentru mitocondrii a fost demonstrat cu DC tratate in vitro cu vitamina D; aceste DC au crescut producția de OXPHOS, masa mitocondrială și mROS [62], studiul nostru recent folosind FTY720 [18] a arătat modificări similare în DC (OXPHOS mai mare și imunogenitate mai mică), s-a demonstrat că tratamentul acut cu rapamicin prelungește durata de viață celulară a DC care au fost dependente de conservarea funcției mitocondriale [10] prin inhibarea NO. Spre deosebire de creșterea duratei de viață a DC, aceleași grupuri au raportat, de asemenea, că expunerea acută sau scurtă la rapamicină în DC le face, de asemenea, activatori potenți ai celulelor CD8 plus T specifice antigenului, sporind astfel controlul melanomului B16 ca vaccinare la șoareci [63]. Tratamentul acut (90 min) al DC derivate de monocite umane cu rapamicin suprimă moleculele imunostimulatoare induse de LPS și potențialul alostimulator care a implicat incapacitatea DCS tratată de a crește semnalizarea NF-kB [64]. În macrofage, rapamicina suprimă producția de IL1 și IL-18după stimularea LPS, proces care implică și reducerea ROS mitocondriale (mtROS) prin inhibarea directă a căilor NLRP3 inflflamasome-p38 MAPK-NF-kB [65]. DC condiționată cu rapamicină (Rapa-DC) de la șoareci și oameni se comportă diferit, comparativ cu Rapa-DC de șoarece, Rapa-DC umană s-a dovedit a fi parțial rezistent la maturare după citokine proinflamatorii și prezintă heterogenitate în reglarea expansiunii celulelor T efectoare și funcția [66]. Multe dintre proprietățile imunoreglatoare ale DC-urilor derivate din monocite condiționate de rapamicină și rolul lor în transplant au fost revizuite în mod elegant de Macedo și colab. [67].
Descoperirile noastre actuale indică faptul că DC tratate cu rapamicină unică sau multiple au un fenotip imunogen și imunostimulator redus după stimularea LPS. Transferul acestor DC-uri protejeazărinichide la IRI. Rapamicina reglează alternativ dinamica mitocondriilor; numai tratamentul multiplu induce un număr mai mare de mitocondrii. Aceste date sugerează că dinamica mitocondrială DC (conținut mai mare de mitocondrii), împreună cu un fenotip mai puțin imunogen indus de rapamicin, protejează în mod cooperantrinichide la este o leziune chimică. Deși mai interesant, datele noastre cu DC tratate cu mitocondrii exogene indică faptul că un număr mai mare de mitocondrii poate depăși starea mai imunogenă a DC după stimularea LPS pentru a proteja, de asemenea,rinichide la IRI. Va fi interesant de confirmat dacă un număr mai mare de mitocondrii în DC modifică răspunsurile celulelor T, DC-urile au capacitatea de a modifica răspunsul imunitar, așa cum a indicat studiul nostru anterior. Datele noastre preliminare indică, în studiile de proliferare a celulelor T alogene, DC cu un număr mai mare de mitocondrii suprimă proliferarea celulelor T CD4 în reacțiile limfocitelor mixte (MLR, date neprezentate). În prezent, nu este clar dacă DC cu numere mitocondriale mai mari pot induce un răspuns Treg care ar putea contribui pozitiv la protejarearinichide la IRI. Acestea vor fi punctul central al următoarelor noastre studii.
Concluzii În rezumat, am demonstrat că BMDC-urile pot reglementaleziuni renaleprintr-un mecanism care implică biogeneza mitocondriilor fie prin tratamente multiple cu rapamicină, fie prin creșterea exogenă a numărului de mitocondrii prin utilizarea mitocondriilor exogene. Concluzionăm că DC de reglementare (DC cu numere mai mari de mitocondrii) pot fi utile înrinichiIRI, precum și în alte stări inflamatorii, cum ar fi transplantul și tulburările autoimune pentru a preveni sau trata leziunile.