Determinarea rapidă simultană a șase componente eficiente în Cistanche Tubulosa prin spectroscopie în infraroșu apropiat

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang și Yuhai Guo

Abstract:

Determinarea cantitativă a mai multor componente eficiente într-o plantă dată necesită de obicei o cantitate foarte mare de produse naturale autentice. În acest studiu, am propus o metodă rapidă și nedistructivă pentru determinarea simultană a echinacozidei, verbascozidei, manitolului, zaharozei, glucozei și fructozei înCistanche tubulosaprin spectroscopie în infraroșu apropiat (NIRS). Spectroscopia de reflexie difuză în infraroșu apropiat (DRS) și cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) au fost efectuate pe 116 loturi de probe de Cistanche tubulosa. Datele DRS au fost procesate folosind metode standard de varietate normală (SNV) și de corecție multiplicativă a dispersiei (MSC). Regresia parțială a celor mai mici pătrate (PLSR) a fost utilizată pentru a construi modele de calibrare pentru componentele de interes în Cistanche tubulosa. Toate modelele au fost apoi evaluate prin calcularea erorii pătratice medii de calibrare (RMSEC), coeficientul de corelație de calibrare (r). Valorile r ale tuturor celor șase modele de calibrare au fost determinate a fi mai mari decât 0,94, sugerând că fiecare model este de încredere. Prin urmare, modelele cantitative NIR raportate în acest studiu pot fi calificate pentru a cuantifica cu acuratețe conținutul a șase componente medicinale înCistanche tubulosa.

Cuvinte cheie: Cistanche tubulosa; cromatografie lichidă de înaltă performanță; spectroscopie în infraroșu apropiat; cele mai mici pătrate parțiale

Introducere

Cistanche(Hoffmg. Et Link) este un gen fanerogamic peren din familia de plante Orobanchaceae. Majoritatea speciilor aparținând genului Cistanche au fost folosite ca plantă medicinală de milenii în China; au reputația de tonic superior; și sunt cunoscute ca „Ginsengul deșerților” [1,2].Cistanche tubulosaeste un parazit obligatoriu al rădăcinilor plantei perene Tamarix Chinensis. A fost documentat în Farmacopeea Chineză ca sursă autentică de Cistanches Herba (nume chinezesc: Roucongrong) din ediția din 2005 [3]. Cercetările farmacologice moderne asupra speciilor Cistanche au fost inițiate în anii 1980 [4]. Investigațiile farmacologice au arătat că extractele de plante Cistanche posedă un spectru larg de activități, precum vindecarea deficienței renale și a constipației senile, avansarea capacității de învățare și memorare, anti-boala Alzheimer, creșterea imunității, anti-îmbătrânire, anti-oboseală etc. [1,5–7]. În ultimele trei decenii, studii farmacologice cuprinzătoare și sistematice au fost combinate cu investigații fitochimice pentru a lumina baza materială a efectelor benefice ale rădăcinilor plantelor Cistanche. Aceste studii indică faptul că glicozidele feniletanoide (PhG) au fost principalele componente eficiente în plantele Cistanche, jucând roluri cheie pentru tratamentul deficienței renale, impotenței [8], anti-îmbătrânire [9] și anti-Alzheimer [10]. Conținutul a două PhG (echinacozidă și verbascozidă) a fost cerut în Farmacopeea Chineză. Între timp, carbohidrații precum manitolul, zaharoza, glucoza și fructoza din plantele Cistanche dețin funcția laxativă, iar grupurile de carbohidrați din plantele Cistanche au fost folosite pentru tratamentul constipației [11].

Resursele sălbatice aleCistanche tubulosasunt distribuite în principal în zona din jurul deșertului Taklamakan din sudul Regiunii Autonome Xinjiang din China. Similar cu multe alte specii folosite ca medicamente tradiționale chinezești (MTC), C. tubulosa este de mare valoare economică și aproape dispărută în habitatul său sălbatic din cauza supra-colectării. Cultivarea C. tubulosa a început în anii 1990 în China pentru a asigura aprovizionarea cu materii prime pentru Cistanches Herba, precum și pentru a proteja resursele de plante sălbatice. Începând cu 2017, în prefectura Hotan din Xinjiang există aproape 13 mii ha de C. tubulosa cultivate [12,13]. Sunt necesare progrese în tehnologia de plantare, extinderea culturii, precum și îmbunătățirea calitățiiCistanche tubulosa.

Scopul principal al cultivăriiCistanche tubulosaeste de a produce Cistanches Herba, fiind bogat în acele componente eficiente. Cu toate acestea, conținutul componentelor eficiente din Cistanches Herba, cum ar fi PhG și oligozaharide, poate fi afectat semnificativ de mulți factori în timpul producției [12,13]. Ar trebui explorat un sistem de detectare în timp real a calității C. tubulosa. Prin urmare, este necesar să se dezvolte o metodă cu randament ridicat pentru a îndeplini pe deplin cerința de a analiza un număr mare de probe într-o perioadă scurtă de timp. În mod tradițional, determinarea acelor componente eficiente primare, cum ar fi PhG și carbohidrați, în C. tubulosa a fost de obicei realizată folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) [14,15]. Deși este precis și fiabil, este consumator de timp și laborios pentru colectarea și procesarea datelor. În plus, este nevoie de mult timp și efort pentru prepararea probei care implică de obicei pulverizarea, extracția și filtrarea testelor HPLC. Prin urmare, sunt necesare un principiu clar și un instrument ușor de utilizat pentru a obține o cantitate relativ mare de date. Din fericire, spectroscopia în infraroșu apropiat (NIRS) a fost utilizată pe scară largă pentru a evalua produsele agricole [16], alimentele [17], probele medicale [18] și produsele farmaceutice [19] deoarece este rapidă și nedistructivă. Prin urmare, NIRS ar putea corespunde exact cerințelor pentru măsurători eficiente ale TCM-urilor și nu este surprinzător că NIRS a fost aplicat pentru identificarea calitativă [20,21] și cuantificarea compușilor [22] în TCM.

În acest studiu, conținutul a șase componente eficiente, inclusiv echinacozidă, verbascozidă, manitol, zaharoză, glucoză și fructoză din 116 loturi de probe de C. tubulosa care au fost colectate de la prefectura Hotan din Xinjiang în perioada 2013-2015 au fost mai întâi determinate prin HPLC. Ulterior, modelele de calibrare ale acestor șase componente au fost stabilite cu metoda de regresie parțială a celor mai mici pătrate (PLSR). Aceste modele au fost apoi validate cu coeficientul de corelație și erorile de predicție din seturile de calibrare. Rezultatele au demonstrat că metoda dezvoltată ar putea fi folosită ca metodă fiabilă pentru analiza cantitativă a C. tubulosa.

Rezultat

Analiza HPLC

Conținutul de echinacozidă și verbascozidă a fost determinat printr-o metodă HPLC-UV bine definită în literatură [3,23] și patru carbohidrați (manitol, zaharoză, glucoză și fructoză) au fost determinate printr-o metodă HPLC-ELSD bine definită în literatura [24] pentru toate cele 116 probe. Pregătirea probelor și metodele de determinare au fost descrise în secțiunile 3.1 și 3.3. Figura 1 prezintă cromatogramele caracteristice ale standardelor mixte. Se poate observa că toate cele șase componente eficiente au fost separate la nivel de referință și, prin urmare, au putut fi cuantificate. Metoda HPLC a fost validată înainte de testarea probei. Principalele rezultate ale metodei HPLC sunt enumerate în tabelul 1. O relație liniară favorabilă (r=0.9998) și recuperarea (98,5 la sută ) a metodei de determinare a echinacozidelor sunt prezentate în rezultate, același rezultat ca toate cinci componente. Prin urmare, conținutul celor șase componente eficiente poate fi determinat cu precizie. Toate intervalele de conținut determinate sunt rezumate în Tabelul 1.

Analiza NIRS

Figura 2 prezintă spectrele NIR (4000–10,{000 cm-1) ale probelor de C. tubulosa. Au apărut vârfuri semnificative de absorbție de la 4000 cm-1 la 7500 cm-1 în toate probele, în timp ce au apărut fluctuații ușoare de la 7500 cm-1 la 10.000 cm-1. Deviația de bază a spectrelor NIR a avut loc deoarece proba a fost ușor afectată de factori precum dimensiunea particulelor și culoarea (Figura 2A). Pretratările matematice ale spectrelor au fost folosite pentru a reduce într-o oarecare măsură influența informațiilor inutile. Pretratările matematice au inclus prima derivație (prima derivație), a doua derivație (a doua derivație), varietate normală standard (SNV) și corecție multiplicativă a dispersiei (MSC). Figura 2B prezintă a doua derivație a spectrelor NIR ale C. tubulosa, iar variațiile semnificative care au apărut din trei regiuni, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 și 7000–7500 cm−1, sunt evident observate .

Stabilirea Modelelor Cantitative de Calibrare

Regresia parțială a celor mai mici pătrate (PLSR) este o metodă clasică de modelare și a fost aplicată pe scară largă în modelele cantitative datorită calității înalte a rezultatelor. Avantajele PLSR includ capacitatea sa bună de prognoză și simplitatea relativă. PLSR a fost, de asemenea, aplicat pe scară largă în stabilirea modelelor de calibrare cantitativă a TCM-urilor [25]. Pe baza spectrelor NIR pretratate și a modelului de analiză cantitativă NIR pentru cele șase componente eficiente din C. tubulosa a fost stabilit folosind metoda PLSR cu datele de analiză HPLC ca valori adevărate. Cele 116 probe au fost împărțite aleatoriu în seturi de calibrare și validare cu un raport de 3:1. Condițiile cele mai potrivite pentru calibrare au fost alese prin RMSEC scăzut și coeficient de corelație ridicat.

Selectarea benzii de undă pentru modelele de calibrare

Selectarea unei benzi de undă adecvate a fost un pas important pentru construirea modelelor de calibrare. În acest studiu, au fost comparate spectrele intervalului NIR de 4000-7500 cm-1 (recomandat de software-ul analist TQ) și 4{000-10.000 cm-1. S-a observat că acest interval nu era adecvat pentru calibrarea la intervalul cuprins între 4000 cm-1 și 7500 cm{-1 din Tabelul 2. Prin urmare, în studiul actual, intervalele spectrale pentru cei șase constituenți chimici au fost toate selectate din intervalul de la 4000 la 10.000 cm-1 prin compararea performanțelor RMSEC și a coeficientului de corelație.

Selectarea numărului optim de factori pentru modelele de calibrare

PLSR explică cantitatea maximă de variabilitate a datelor prin reducerea dimensionalității datelor spectrului prin calculul factorilor. Problema „subadaptarii” a apărut din cauza informațiilor insuficiente care a rezultat dintr-un număr limitat de factori; cu toate acestea, alegerea factorilor mai mari decât valorile optime introduse în model va duce la problema „supra-adaptarii”. Fie „subadaptarea”, fie „suprafitarea” va reduce puterea predictivă a modelelor stabilite [22]. Figura 3 arată relația dintre RMSECV și factori pentru toți cei șase compuși. Prin urmare, am selectat acei factori corespunzători celor mai mici valori ale RMSECV. Selecția optimă a factorilor pentru modelele de calibrare este listată în Tabelul 3.

Selectarea pretratării spectrale pentru modelele de calibrare

Un alt factor de influență cel mai critic pentru modelele de calibrare este pretratarea spectrală, care are ca scop reducerea influenței împrăștierii și derivei liniei de bază, îmbunătățirea raporturilor semnal-zgomot și eliminarea variațiilor neregulate. Metodele de corecție multiplicativă a împrăștierii (MSC) și standard standard variate (SNV) au fost utilizate pentru a elimina influența obișnuită a împrăștierii radiațiilor. Pentru a rezolva efectele derivei liniei de bază, s-au comparat spectrele derivate 1 și 2 și s-a selectat derivația a 2-a [26]. Pentru efectul dorit, am netezit spectrele cu algoritmul de filtru Savitzky–Golay (SG) înainte de derivare pentru a preveni mărirea zgomotului. Tabelul 3 prezintă informațiile despre pretratarea spectrală și rezultatele acesteia pentru modelele de calibrare.

Evaluarea modelelor stabilite

Un model de calibrare NIRS bun ar trebui să aibă valori RMSEC și RMSEP scăzute, precum și un coeficient de corelație ridicat (r) și diferențe mici între RMSEC și RMSEP [27–29]. Modelele de calibrare ale celor șase compuși selectați au fost stabilite conform procedurilor menționate mai sus (Tabelul 3). Valorile RMSEC și r pentru setul de calibrare al echinacozidului au fost 27,6 și, respectiv, 0,9808. Parametrii de performanță ai altor modele de compuși chimici sunt enumerați în Tabelul 3, din care putem concluziona că modelele stabilite rezultă rezultate de predicție satisfăcătoare și pot fi utilizate pentru analiza cantitativă rapidă a C. tubulosa. Diagramele de dispersie ale celor șase compuși chimici sunt prezentate în Figura 4 pentru a face modelele de calibrare mai descriptive și observate vizual. După cum se arată în Figura 4, au apărut diferențe minore între valorile predictive și cele măsurate, deoarece majoritatea punctelor au fost distribuite în jurul curbei regresive cu o ecuație ca y=x. Prin urmare, în Figura 4 au fost observate performanțe predictive excelente.

Materiale și metode

Pregătirea unei mostre

O sută șaisprezece probe de C. tubulosa au fost colectate de la prefectura Hotan din regiunea autonomă Xinjiang din 2013 până în 2015. Toate probele au fost cultivate, dar au fost colectate în diferite stadii de creștere. Greutatea proaspătă a probelor a variat între 20 g și 1000 g. După uscare la soare, probele uscate au fost zdrobite și cernute printr-o sită de plasă 60-[3,23].

Colectarea datelor spectroscopice NIR

Spectrele NIR ale probelor au fost colectate la un interval de 8 cm-1 peste regiunea spectrală de 4000-10.000 cm{-1 cu un sistem Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, SUA) echipat cu un adaptor de reflectivitate pentru fibră optică de mână. Fiecare spectru a fost obținut prin media a 64 de scanări. Toate probele au fost lăsate să se echilibreze la temperatura camerei (25 °C) înainte de scanarea spectrelor NIR pentru a se asigura că probele au fost analizate la aceeași temperatură. Umiditatea din laborator a fost menținută la un nivel ambiental.

Colectarea datelor HPLC

Pregătirea pentru extracție

Un gram de pulbere de C. tubulosa a fost extras cu 50 mL de 50% metanol într-un balon conic cu ultrasunete (500 W, 40 kHz) timp de 30 min. Extractul a fost depozitat la 4 ◦C. Supernatantul extractului a fost filtrat pentru a obține o probă pentru analiza HPLC [3,23].

Determinarea simultană a echinacozidei și verbascozidei cu HPLC-UV

Analiza cromatografică lichidă a fost efectuată pe un sistem UHPLC Shimadzu (Shimadzu, Kyoto, Japonia) format din două unități de livrare a solvenților LC{-20ADXR, o pompă LC-20AD, un prelevator SIL-20ACXRauto , un cuptor cu coloană CTO-20AC, un detector DAD SPD-M20A, un degazator DGU-20A3R și un controler ICBM-20.

O coloană Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) utilizată pentru separările cromatografice a fost menținută la 35 ◦C. Faza mobilă a constat din acetonitril (A) și 0,1% acid formic apos (B) și a fost livrată urmând programul de gradient, după cum urmează: 0-7 min, un gradient liniar de 10-20 procent A; 7–15 min, 20 la sută A; și 15–20 min, un gradient liniar de 20–10 la sută A. Rata similară a fazei mobile a fost de 0,4 ml/min. Monitorizarea UV a fost efectuată la 330 nm.

Determinarea simultană a manitolului, zaharozei, glucozei și fructozei cu HPLC-ELSD

HPLC a fost efectuată pe un sistem LC Agilent seria 1100 (Palo Alto, CA, SUA) constând dintr-un degazator aG1322A, o pompă cuaternară G1311A, un autosampler G1311A, un controler de temperatură pe coloană G1316A și un detector DAD G1315B.

O coloană Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) a fost folosită pentru separări cromatografice și menținută la o temperatură a coloanei de 25 ◦C. Faza mobilă a fost compusă din acetonitril și apă (77:23, v/v) și un aliat izocratic furnizat la o rată similară de 0,7 ml/min. Efluentul a fost monitorizat folosind un detector de împrăștiere a luminii prin evaporare (ELSD) cu parametri impliciti [23,24].

Procesarea datelor

TQ Analyst (versiunea 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, SUA) a fost utilizat pentru a efectua împărțirea seturilor de calibrare și validare, pretratarea matematică a spectrelor, stabilirea modelelor de calibrare și alte calcule. Pentru realizarea figurilor a fost folosită Origin (versiunea 9.1).

Concluzii

Mulțumiri: această lucrare a fost susținută de Proiectul național de planificare a științei și tehnologiei din China (2015BAD29B00-04).

Contribuții ale autorului: Xinhong Wang a conceput și proiectat experimentele. Xinhong Wang și Xiaoguang Wang au efectuat experimentele. Xinhong Wang și Yuhai Guo au scris lucrarea.

Conflicte de interese: Autorii declară că nu există conflicte de interese.

Referințe

1. Jiang, Y.; Tu, PF Analiza constituenților chimici la speciile de cistanche. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma cultivată ca cultură nouă în China. Genet. Resursă. Crop Evol. 2008, 56, 137–142. [CrossRef]

3. Editarea Comitetului pentru Farmacopeea Chineză. Farmacopeea Chineză, ed. 2005; Chemical Industrial Press: Beijing, China, 2005; Volumul 1, p. 90.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. Constituents of cistanchE herba (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]

5. Song, ZH; Lei, L.; Tu, PF Progrese în cercetarea activității farmacologice la plantele de cistanche huffing. Et link. Bărbie. Tradit. Iarbă. Drugs 2003, 34, 473–476.

6. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Efectele antioxidante ale feniletanoizilor din Cistanche deserticola. Biol. Farmacă. Taur. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, CQ Cercetări privind efectul glicozidelor feniletanoide (PEG) ale Cistanche deserticola asupra anti-îmbătrânire la șoarecii în vârstă indusă de D-galactoză. J. Chin. Med. Mater. 2008, 31, 1385–1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Studii farmacologice pe Cistanchis Herba. I. Efectele constituenților Cistanchis Herba asupra sexului și comportamentului de învățare la șoarecii stresați cronic. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131–1144. [CrossRef]

9. Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Ingredientele active anti-îmbătrânire din plante medicinale și nutraceutice utilizate în medicina tradițională chineză: mecanisme farmacologice și implicații pentru descoperirea medicamentelor. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Efectele neuroprotective ale terapiei cu plante Cistanches asupra pacienților cu boală Alzheimer moderată. Evid. Complement pe bază. Altern. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ZL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Studiu asupra constituenților laxative în Cistanche deserticola YC Ma. Mod. Bărbie. Med. 2015, 17, 307–310.

12. Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, TX; Wang, XY; Aierkan, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; et al. Tehnici de cultivare a Cistanche tubulosa și gazda sa Tamarix spp. Mod. Bărbie. Med. 2015, 17, 349–358.

13. Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tian, ​​YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Dezvoltarea industriei ecologice a cistanches herba pentru promovarea civilizației ecologice a regiunii deșertice de vest. Mod. Bărbie. Med. 2015, 17, 297–301.

14. Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Analiza cantitativă a cistanches herba folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu detectarea matricei de diode și spectrometrie de masă de înaltă rezoluție combinată cu metode chimiometrice. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9 din 9

15. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferențierea herba cistanches prin amprentă cu cromatografie lichidă de înaltă performanță-detecție matrice de diode-spectrometrie de masă. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---