Reflecție despre calitatea microbiologică a apei de hemodializă în Brazilia Ⅲ

Legislația actuală privind apa de dializă în Brazilia

Criteriile utilizate pentruevaluarea dializeiapa a apărut prin conștientizarea autorităților competente cu privire la riscul potențial la care erau expuși pacienții aflați în tratament (Faria, 2011).

CÂT TIMP TREBUIE PENTRU CISTANCHEA?

Rezoluția Consiliului de Administrație Colegial (CDR) nr. 33/2008 prevede reglementarea tehnică pentru planificarea, programarea, elaborarea, evaluarea și aprobarea sistemelor de tratare și distribuție a apei pentru hemodializă în agenția braziliană de reglementare a sănătății (Anvisa, 2008) .

RDC nr. 11/2014 prevede cerințele bunelor practici pentruServicii de dializă, se aplică tuturor serviciilor de dializă, fie ele publice, private, filantropice, civile sau militare, inclusiv celor care desfășoară activități de predare și cercetare. De asemenea, stabilește ca probele pentru analize microbiologice să fie recoltate cel puțin lunar la punctul de întoarcere a buclei de distribuție și într-unul dintre punctele din camera de prelucrare. În plus, stabilește că calitatea microbiologică a apei trebuie verificată ori de câte ori există manifestări pirogene, bacteriemie sau suspiciune de sepsis înpacienţii dializaţi. Acest RDC nr. 11/2014 stabilește standardul de calitate a apei pentru dializă, atributele biologice și microbiologice fiind evidențiate în Tabelul 1 (Anvisa, 2014).

TABEL I - Standard de calitate biologică și microbiologică pentru apa de dializă

Organizația Internațională pentru Standardizare (ISO) prevede în standardul său nr. 13959:2014hemodializaapă și terapii aferente, specificând ca standard de calitate un număr total de microbiologic mai mic de 100 CFU/mL sau mai puțin dacă da, prevăzut în legislația locală. De asemenea, a specificat niveluri de endotoxine sub 0,25UE/mL sau la fel de minore, dacă da, prevăzute de legislația locală (International Organization for Standardization, 2014).

METODE MICROBIOLOGICE CONVENȚIONALE ȘI ALTERNATIVE

Enumerarea bacteriilor heterotrofe

Poate fi considerat ca un semn inițial al testelor microbiologice când la mijlocul anului 1610 și, în 1665, microscoapele au fost inventate de Galileo Galilei și, respectiv, Van Leeuwenhoek. Deși probabil că Leeuwenhoek nu a fost primul care a observat bacterii și protozoare, el a fost primul care a făcut rapoarte cu desene și descrieri ale observațiilor sale. Printre acestea, în 1675, a descris viețuitoare prezente în apă (Dias, 2018; Pelczar, Reid, Chan, 1980).

Cu toate acestea, oamenii de știință germani observaseră creșterea coloniilor în cartofi fierți, ceea ce a caracterizat practica culturii microbiene și dezvoltarea mediilor de cultură. Koch a fost cel care a inițiat cultivarea microorganismelor într-un mediu solid. El a numit agar substanța extrasă din alge care s-ar putea solidifica la temperatura camerei. Richard Petri a dezvoltat o placă de sticlă pentru depunerea mediului de cultură (Jay, 2001; Pelczar, Reid, Chan, 1996).

După 200 de ani de la descoperirea ființelor vii în apă de către Leeuwenhoek, Louis Pasteur, Robert Koch, Theobald Smith și alți câțiva oameni de știință au asociat ființele microscopice cu boli. Joseph Lister, în 1878, a obținut primele culturi pure de bacterii folosind diluții în serie într-un mediu lichid (Pelczar, Reid, Chan, 1980).

La sfârșitul secolului al XIX-lea s-au adoptat tehnici de cultivare pentru a analiza calitatea apei potabile. Pentru analiza E. coli și alți coliformi, bulionul de cultură, prin numărul cel mai probabil (MPN), a devenit metoda principală, precum și mediul de agar Koch sau mediul solid pentru numărarea totală, ambele au trecut prin câteva modificări. În 1950 a fost introdusă utilizarea filtrelor cu membrană pentru enumerarea bacteriilor (Pelczar, Reid, Chan, 1996; Sartory, Watkins, 1999).

MNP este simplu, dar necesită un timp mai lung de analiză (până la 5 zile), în timp ce în filtrarea cu membrană rezultatele prezumtive sunt disponibile după 3-5 zile de incubație (Anvisa, 2019). În ceea ce privește mediul solid, una dintre opțiuni constă în agar pentru numărarea plăcii (PCA), medii sărace în nutrienți și nepotrivite pentru recuperarea bacteriilor care sunt deja stresate în apă. Mediile de cultură mai slabe din punct de vedere nutrițional pot fi, de asemenea, utilizate, de exemplu, deoarece pot recupera un număr mai mare de bacterii, dar nu întreaga populație viabilă (Sartory, Watkins, 1999). Reasoner's 2A Agar (R2A), este un exemplu de mediu de cultură mai slab din punct de vedere nutrițional și este cel mai recomandat pentru analiza microbiologică a apei (USP, 2017).

În prezent, există multe metode microbiologice convenționale, cum ar fi metoda plăcii, filtrarea cu membrană și tuburile multiple prin procesul MNP (Anvisa, 2019). Deși sunt simple, eficiente și economice, au unele limitări: selectivitatea scăzută a mediului de cultură, variabilitatea răspunsului biologic și rezultatele tardive în detectarea microorganismelor compromit timpul de determinare a măsurilor preventive pentru reducerea leziunilor pacienților (Anvisa). , 2019).

În încercarea de a minimiza aceste limitări, au fost dezvoltate metode microbiologice alternative pentru a oferi un nivel mai ridicat de calitate a testelor, o sensibilitate mai mare și rezultate mai rapide, permițând luarea de acțiuni corective din timp (Anvisa, 2019)

Endotoxine bacteriene

Theodor Billroth, în 1865, a folosit termenul de pirogen pentru a se referi la substanțele care provoacă febră (Kikkert, Groot, Aarden, 2008; Medical Staff Conference, 1978). Studiile lui Richard Pfeiffer asupra holerei din 1892, care au fost încurajate de Robert Koch, îl consacră drept părintele endotoxinei pentru descoperirea sa (Rietschel, Cavaillon, 2003).

În 1942, testul pirogen prin metoda in vivo a fost adăugat în Farmacopeea Americană la a douăsprezecea ediție (Mc Closky și colab., 1943). De la includerea sa, acest test a fost utilizat pe scară largă pentru a evalua contaminarea cu pirogeni în medicamentele parenterale (Kikkert, Groot, Aarden, 2008). Cu toate acestea, abia în 1976, acest test a fost inclus în Farmacopeea braziliană (Navega et al., 2015).

Testul se bazează pe măsurarea răspunsului febril al iepurelui după injectarea intravenoasă a soluției de testat, iar interpretarea rezultatelor este utilizată pentru a caracteriza controlul biologic (Anvisa, 2019). Există, totuși, unele limitări, cum ar fi managementul animalelor, variabilitatea biologică și problemele etice. Aceste aspecte i-au încurajat pe cercetători să dezvolte metode alternative pentru testarea in vivo a pirogenilor (Kikkert, Groot, Aarden, 2008). În cercetările lor, Levin și Bang (1964), citați de Kikkert, Groot și Aarden (2008), au observat că endotoxina Escherichia coli a provocat coagularea hemolimfei crabului Limulus polyphemus.

Testul Limulus Amebocyte Lysate (LAL) a fost adăugat în Farmacopeea Americană în 1980, în timp ce a fost inclus în Farmacopeea braziliană abia în 1996 (Farmacopeia, 1996; USP, 1980). Există două tipuri de teste LAL, primul este testul de coagulare semi-cantitativ, care se bazează pe formarea gelului; a doua este cea fotometrică, un test cantitativ, care poate fi împărțit într-o metodă cromogenă care se bazează pe dezvoltarea culorii și metoda turbidimetrică care se bazează pe dezvoltarea turbidității (Anvisa, 2019).

Testele LAL au însă unele limitări precum variabilitatea tehnicii analistului și eroarea inerentă instrumentelor utilizate, compromițând calitatea analizei, în acest context sunt de dorit metode alternative care să elimine aceste limitări (Anvisa, 2019; Charles River, 2017). Lemgruber și colab., 2011)

Metode microbiologice alternative

Metodele microbiologice alternative sunt de dorit atunci când se caută depășirea limitărilor metodelor convenționale. În diferite compendii, metodele alternative sunt clasificate în calitative, cantitative sau de identificare (Anvisa, 2019; PDA, 2013; USP, 2017).

Farmacopeea braziliană evidențiază principalele metode: bazate pe viabilitate, pe creștere și pe componente celulare (Anvisa, 2019). Principalele tipuri de metode microbiologice alternative și tehnologiile respective sunt descrise în Tabelul II.

TABELUL II - Principalele tipuri de metode microbiologice alternative și tehnologiile respective

În ciuda importanței utilizării metodelor alternative rapide pentru a oferi nu numai posibilitatea unor acțiuni corective în timp real, ci și o mai mare siguranță a pacientului, puține studii sunt efectuate pentru a demonstra aplicabilitatea acestora în domeniul analizei apei tratate cu dializă (Anvisa, 2019) . Riepl și colab. (2011) au evaluat aplicabilitatea citometriei în fază solidă, relevată prin microscopia epifluorescență, și au observat o corelație ridicată între metoda convențională și cea alternativă.

Aplicația citometriei în fază solidă în analiza microbiologică a apei de dializă este promițătoare deoarece, pe lângă faptul că este fiabilă, este o metodă rapidă, deoarece timpul de analiză este de aproximativ trei ore, iar utilizarea acesteia este sugerată pentru monitorizarea nu numai a calității apei, ci și a dializei. fluid (Canaud, 2011; Riepl et al., 2011).

Citometria, pe langa faptul ca este o metoda rapida, permite si detectarea microorganismelor viabile necultivabile. Aceste microorganisme sunt responsabile pentru divergențele rezultatelor dintre experimentele de laborator și microbiota apei reale. Sunt incapabili să se împartă și să formeze colonii, chiar dacă au un mecanism metabolic activ și rămân în viață. Multe bacterii, în special gram-negative, au această capacitate. Speciile de Mycobacterium pot fi evidențiate ca VNC potențiale (Anvisa, 2019; Joux, Lebaron, 2000; Díaz și colab., 2010; Sandle, 2015).

Tehnici bazate pe componente celulare precum analiza 16S rDNA PCR este, de asemenea, o tehnică promițătoare, deoarece este independentă de cultură și, prin urmare, este capabilă să detecteze microorganisme viabile necultivabile (Anvisa, 2019; Gomila și colab., 2010; Gomila, Ramirez, Lalucat, 2007; ).