pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princiero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Lies De Groef ³, Harold Taeter⁴, Tomas Norton⁴, Pieter Baatsen ⁵, Sara Cairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte ⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²și Elena Levtchenko^1,*

^{Partea I: Manifestări renale și extrarenale la modelul de pește zebră adulți de cistinoză}

¹Laboratorul de Nefrologie Pediatrică, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgia; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Departamentul de Patologie, Centrul Medical al Universității Leiden, 2300 RC Leiden, Țările de Jos; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ Grupul de Cercetare pentru Dezvoltarea și Regenerarea Circuitelor Neurale, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgia; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Grupul M3-BIORES, Divizia de inginerie a sănătății animale și umane, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgia; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵Neurobiologie moleculară, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Belgia; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Departamentul de Medicină Pediatrică, Laboratorul Unității de Biochimie Metabolice, Spitalul de Copii Bambino Gesù, IRCCS, 00146 Roma, Italia; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷Laboratory for Molecular Biodiscovery, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgia; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Departamentul de Nefrologie Pediatrică, Centrul Medical al Universității Radboud, 6525 GA Nijmegen, Țările de Jos

^*Corespondență: elena.levtchenko@uzleuven.be; Tel.: plus 32-16-34-38-22

^† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Abstract:Cistinozăeste o boală rară, incurabilă, autosomal recesivă, cauzată de mutații ale genei CTNS. Această genă codifică cistinoza transportor de cistină lizozomală, ceea ce duce la acumularea de cistină lizozomală în toate celulele corpului, rinichii fiind primele organe afectate. Tratamentul actual cu cisteamină scade acumularea de cistina, dar nu inversează disfuncția tubulară proximală, leziunea glomerulară sau pierderearenalfuncţie. În studiul nostru anterior, am dezvoltat un model de pește-zebra de cistinoză printr-o mutație aiurea a genei CTNS și am arătat că larvele de pește-zebra recapituleazărinichifenotip descris la om. În studiul actual, am caracterizat adultulcistinozămodel de pește-zebră și a evaluat efectele pe termen lung ale bolii asuprarinichiși extrarenale organe prin studii biochimice, histologice, de fertilitate și de activitate locomotorie. Am constatat că adultulcistinozăPeștele zebră prezintă acumulare de cistina în diferite organe, morfologie alterată a rinichilor, pigmentare afectată a pielii, fertilitate scăzută, activitate locomotorie alterată și anomalii oculare. În general, datele noastre indică faptul că adultulcistinozăModelul de pește zebra reproduce mai multe fenotipuri umane de cistinoză și poate fi util pentru studierea fiziopatologiei și a efectelor pe termen lung ale terapiilor noi.

Cuvinte cheie:rinichiboala;cistinoză; model de pește zebra;renalși extrarenale manifestare; caracteristicile fenotipice ale adultului

1. Introducere

Cistinozăeste o tulburare de stocare autosomal recesivă cauzată de mutații ale genei CTNS care codifică cistinoza co-transportatoare de protoni a cistinei lizozomale, transportând cistina din lumenul lizozomal în citosol. Mai multe organe sunt implicate în boală, cum ar fi mușchii, testiculele, ochii și creierul și, printre toate,rinichisunt primele și cele mai grav afectate organe [1]. Varianta clinica cea mai frecventa si severa este nefropatica infantilacistinoză, în care prima manifestare clinică esterenalSindromul Fanconi, caracterizat printr-o celulă epitelială tubulară proximală afectată

(PTE) reabsorbție care are ca rezultat pierderea urinară de aminoacizi, glucoză, proteine ​​cu greutate moleculară mică până la intermediară și alți metaboliți. Afectarea PTEC este urmată de disfuncție glomerulară progresivă și, atunci când este lăsată netratată, duce la stadiul final.rinichiboala [1]. Abordarea terapeutică actuală constă în cisteamină, care este un amino tiol care epuizează cistina, care rupe puntea disulfură a cisteinei, rezultând formarea aminoacidului cisteină și a unei disulfuri mixte cisteamină-cisteină. Această ultimă moleculă poate ieși din somi prin transportorul de aminoacizi PQLC2[2]. Cu toate acestea, tratamentul cu cisteamină, deși scade acumularea de cistină lizozomală, nu face decât să întârzie progresia bolii [3–5]. Prin urmare, înțelegerea în continuare a patogenezeicistinozăși dezvoltarea de noi opțiuni rapeutice sunt încă pe agenda cercetării. Au fost dezvoltate mai multe modele animale pentru a recapitula fenotipul de cistinoză [6,7]. Unul dintre cele mai utilizate modele este șoarecele Ctns−/− C57BL/6, care dezvoltă acumulare de cistină și tubulopatie proximală ușoară. Cu toate acestea, nu prezintă leziuni glomerulare, iar fenotipul a fost găsit dependent de fondul genetic [8].

Până în prezent, modelele de pește-zebră au devenit un instrument atractiv pentru investigarea bolilor umane datorită mai multor avantaje, cum ar fi dezvoltarea rapidă, fecunditatea ridicată, costurile de întreținere mai mici și disponibilitatea tehnologiilor de editare genetică ușor de aplicat [9]. Într-un studiu anterior, am prezentat un model de larve de pește zebra congenic cu o mutație nonsens homozigotă în exonul 8 al genei ctns-/-, rezultând o pierdere funcțională a cistinozei [10], ducând la acumularea de cistină în întregul corp, creșterea deformarea larvelor, dezvoltarea întârziată șirinichideteriora. Cu toate acestea, consecințele bolii pe termen lung la peștii zebra adulți nu au fost studiate până acum. În studiul actual, ne-am propus să caracterizămrenalși manifestări extrarenale la modelul peștilor zebră adult alcistinoză.

Faceți clic pe OrganicCistanche pentru boli renale

2. Rezultate

2.1. Cistina se acumulează în Ctns-/- Zebrafish

Cistinozăeste considerată o tulburare multisistemică care are ca rezultat acumularea de cistină în toate celulele corpului. În lucrarea noastră anterioară, am constatat că peștii zebră de cistinoză (ctns-/-) prezintă acumulare de cistină începând din stadiul de dezvoltare larvară și în mai multe organe până la vârsta de 8 luni [9]. Pentru a evalua dacă modelul nostru menține acumularea de cistina în etapele ulterioare ale bolii, am măsurat nivelurile de cistina în întregul corp,rinichi, testicul, ochi, mușchi și creier la 18-pești-zebra de lună ctns-/- în comparație cu pești-zebra masculi de tip sălbatic de vârstă. Am găsit o creștere de 54- ori a conținutului de cistină în întregul corp (Figura 1A) și o creștere de 146- ori în rinichi (Figura 1B) a peștilor zebra ctns-/- comparativ cu peștii zebra de tip sălbatic. Mai mult, am observat o acumulare extinsă de cistină în testicul, ochi, mușchi și creier (Figura 1C-F) la ctns-/- peștii zebră.

2.2. Manifestare renală

2.2.1. Ctns−/− Zebrafish Prezintă daune PTEC

De cândrinichieste organul cel mai grav afectat, am examinat caracteristicile histologice ale rinichilor utilizând colorarea cu Hematoxilină și Eozină (H&E) și Periodic Acid-Shiff (PAS). Am observat prezența umflăturilor tulburi, a picăturilor eozinofile asemănătoare hialinei și a vacuolelor citoplasmatice în PTEC-ul ctns-/- zebrafish (Figura 2B, D), dar nu și în peștele zebra de tip sălbatic (Figura 2A, C). De remarcat, nu a fost găsită nicio afectare a tubului distal. Cristalele de cistină au fost observate anterior în PTEC ca vacuole citoplasmatice cu forme dreptunghiulare sau polimorfe [11]. Prin urmare, am investigat dacă aceste structuri au fost prezente și în tubii de pește-zebră. Am găsit numeroase vacuole citoplasmatice în PTEC-ul ctns-/- zebrafish prin colorare cu albastru de toluidină (Figura 3B, D, indicată cu asteriscuri). În plus, am găsit spațiu vacuolar cu forme dreptunghiulare sau polimorfe (Figura 3B, D, indicat cu vârfuri de săgeată). Am confirmat această descoperire prin microscopie electronică cu transmisie (TEM) (Figura 3F). Aceste structuri nu au fost prezente în PTEC-ul peștilor zebra de tip sălbatic (Figura 3A, C, E). Interesant, pe lângă prezența vacuolelor în formă polimorfă, am observat o pierdere parțială a marginii periei în ultrastructura PTEC (Figura 3F).

Figura 1. Conținutul de cistină în omogenate de pește-zebră de tip sălbatic și ctns-/-. (A–F) Conținutul de cistină în întregul corp (A),rinichi(B), testicul (C), ochi (D), mușchi (E) și creier (F) la pești zebra masculi de tip sălbatic și ctns-/- 18- în vârstă de o lună. Concentrația de cistina este exprimată în nmol/mg proteină. Fiecare punct reprezintă un pește-zebră, pentru un total de n=3 de tip sălbatic și n=3 cenți-/- 18-masculi de pește-zebră de lună; test t nepereche cu corecția lui Welch, cu două cozi: * p < 0,05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Figura 2.Rinichihistologie la pești-zebra de tip sălbatic și ctns-/-. (A, B) Imagini reprezentative alerenaltubuli de tip sălbatic (A) și ctns−/− (B) 18-zebra de o lună. Detalii ale tubilor proximali cu picături eozinofile asemănătoare hialinei (puncte de săgeți negre) și vacuole citoplasmatice (*). Colorarea H&E. Barele de scară reprezintă 50 µm. (C, D) Imagini reprezentative ale colorării PAS a tubilor renali de tip sălbatic (C) și ctns-/- (D) 18-zebra de pește de o lună. Detalii ale tubilor proximali cu picături asemănătoare hialinei (puncte de săgeți negre) și vacuole citoplasmatice (*). colorarea PAS. Barele de scară reprezintă 50 µm. PT: tubul proximal; DT: tubul distal.

Figura 3.Rinichicristale de cistină în PTEC-uri de tip sălbatic și ctns-/- zebrafish. (A, B) Imagini reprezentative colorate cu albastru de toluidinărenaltubuli proximali în peștele-zebră de tip sălbatic (A) și ctns-/- (B) 18-lună. Barele de scară reprezintă 50 µm. (C,D) Figurile 3C, D arată o mărire mai mare a Figurilor 3A,B. Detalii tubuli renali proximali cu vacuole citoplasmatice ((D); *), spații vacuolare dreptunghiulare și polimorfe ((D); vârfuri de săgeți negre). (E, F) Imagini TEM reprezentative ale tubului proximal renal al peștilor zebra de tip sălbatic (E) și ctns-/- 18-zebra (F). (F) Pierderea parțială a marginilor tubulilor proximali (PB) și acumularea de vacuole dreptunghiulare și polimorfe (*) au fost observate în tubul proximal renal al peștelui zebra ctns-/-. Vederea cu mărire mare a dreptunghiului din colțul din dreapta jos arată vacuolele polimorfe și o vacuola mare cu segmente drepte de margine a membranei (o linie dreaptă). Barele de scară reprezintă 5 µm.

2.2.2. Ctns−/− Zebrafish arată hipertrofie glomerulară

Deoarece leziunile glomerulare urmează de obicei leziunilor PTEC, am evaluat histologia glomerulară a peștilor-/- zebra și am observat că peștii-/- malezebra au arătat o mărire semnificativă a capsulei Bowman (Figura 4B, E) și a smocului glomerular (Figura 4B, F'B), dar nu (Figura 4B, F'B). , G) în comparație cu peștele zebră masculin de tip sălbatic (Figura 4A, E-G). Același lucru a fost confirmat pentru glomerulartul peștilor femele zeze care poartă mutația ctns-/- (Figura 4F) și o tendință similară a fost observată la măsurătorile spațiului lui Bowman și ale capsulei lui Bowman (Figura 4E, G). Nu s-a observat proliferarea celulelor mezangiale sau glomeruloscleroza. Pe imaginile TEM, nu am observat modificări ale membranei bazale glomerulare, ștergerea procesului piciorului podocitelor sau celule endoteliale fenestrate anormal în glomerulii peștilor zebra ctns-/- (Figura 4D) în comparație cu peștele-zebra de tip sălbatic (Figura 4C).

Figura 4. Morfologie glomerulară în peștele-zebra de tip sălbatic și în ctns−/−. (A, B) Imagini reprezentative ale glomerulului de tip sălbatic (A) și ctns-/- (B) 18-zebra peștelui în vârstă de lună. colorarea PAS. Barele de scară reprezintă 50 µm. (C,D) Imagini TEM reprezentative ale glomerulului de pește-zebră de tip sălbatic (ctns-/- (D). Barele de scară reprezintă 1 µm. (E-G) Cuantificarea suprafețelor capsulei Bowman (E), smoc glomerular (F) și spațiul lui Bowman (G) de tip sălbatic și zebrafish la ambele sexe.

2.2.3. Ctns−/− Zebrafish afișează apoptoză crescută la nivelul PTEC

În continuare, am investigat dacăcistinozăa declanșat moartea celulară în modelul nostru de pește zebra [10,12]. Am efectuat imunocolorarea cu caspază scindată-3 înrenalțesuturi de pește-zebra de tip sălbatic și ctns-/- și am observat o creștere semnificativă a nivelurilor de proteină caspază clivată în PTEC de pește-zebra ctns-/- (Figura 5B, D, G) în comparație cu peștele-zebra de tip sălbatic (Figura 5A, C, G) la ambele sexe. Expresia caspazei scindate -3 a fost prezentă în principal în celulele care prezintă vacuolele citoplasmatice polimorfe (Figura 5B, D). Nu a fost prezentă nicio expresie a caspazei scindate-3 în glomeruli, atât la peștii de tip sălbatic, cât și la ctns-/- zebrafish (Figura 5E, F).

Figura 5. Creșterea apoptozei în PTEC-uri cu vacuole în ctns-/- zebrafish. (A, B) Imagini reprezentative ale imunocolorării cu caspază scindată-3 a tubilor de tip sălbatic (A) și ctns - pești zebra bătrâni. Barele de scară reprezintă 50 µm. (C,D) Panourile inferioare arată o mărire mai mare a zonelor din casete din panourile superioare. Detalii despre PTEC-uri cu vacuole citoplasmatice (*). Barele de scară reprezintă 50 µm. (E, F) Imagini reprezentative ale imunocolorării cu caspază scindată-3 a glomerulului de tip sălbatic (E) și ctns-/- (F) 18- pește-zebra de o lună. Barele de scară reprezintă 50 µm. (G) Cuantificarea zonei pozitive de colorare a caspazei tubulare-3 la peștele sălbatic și zebra de ambele sexe. Fiecare punct reprezintă un pește-zebră, pentru un total de n=3 pește-zebra de tip sălbatic și ctns−/− 18-pește-zebră vechi de lună. ANOVA bidirecțional cu testul Fisher diferența cea mai mică semnificativă (PLSD): ** p < 0,01;="" ***="" p=""><>

2.3. Manifestări extrarenale

2.3.1. Ctns−/− Zebrafish arată un model caracteristic de piele hipopigmentată cu pete

Cistinozăpacienții prezintă frecvent îmbătrânire prematură a pielii, hipopigmentare și păr blond [1,13]. În mod interesant, am observat un model hipopigmentat pete al pielii ctns-/- pești-zebra, în timp ce peștii de tip sălbatic au prezentat modelul tipic cu dungi negre. Fenotipul este prezent la ambele sexe pe parcursul întregii vieți (Figura 6A, B). Pentru a investiga diferența de pigmentare, am efectuat colorarea PAS pe pielea peștelui zebra și am constatat că ctns-/- peștii zebra prezintă distribuția alterată a stratului de melanină în epidermă, ceea ce a cauzat modelul de pete de lumină (Figura 6C, D).

Figura 6. Model de piele hipopigmentată în pește-zebra ctns-/-. (A, B) Imagini reprezentative ale peștilor zebra de tip sălbatic (A) și ctns-/- (B) 18-vechi de lună. Barele de scară reprezintă 0,5 cm. Vârfurile de săgeți negre indică diferitele modele de piele în dungi. (C,D) Imagini colorate cu PAS ale epidermei de tip sălbatic (C) și ctns-/- (D) 18-zebra de o lună. Vârfurile de săgeți negre evidențiază stratul de melanină. Întreruperea stratului de melanină este prezentă în ctns-/- (D) în timp ce este absentă la peștele-zebra de tip sălbatic (C). Barele de scară reprezintă 50 µ

2.3.2. Ctns−/− Zebrafish prezintă chisturi spermatogene îmbogățite în spermatozoizi

Cistinozăeste cunoscut că afectează funcțiile testiculare, ducând la azoospermie și infertilitate la pacienții de sex masculin [14–16]. Originea azoospermiei este încă neclară, deși spermatogeneza s-a dovedit a fi intactă la nivel testicular. Spre deosebire de pacienții de sex masculin, femeile cu cistinoză sunt fertile [17]. În modelul nostru de pește-zebra, atât femelele, cât și bărbații ctns-/--zebrafish sunt fertile. Pentru a investiga dacă mutația ctns−/− afectează anatomia testiculului, am efectuat colorarea PAS și am găsit o acumulare crescută de spermatozoizi în chisturile spermatogenice la ctns−/− peștele-zebra

Figura 7. Chisturi spermatogenice îmbogățite în spermatozoizi la ctns−/− pește-zebra. (A, B) Imagini reprezentative colorate cu H&E ale testiculelor de tip sălbatic (A) și ctns-/- (B) 18- pești-zebra de o lună. Colorația albastru închis și rotunjit reprezintă spermatozoizii acumulați în chisturile spermatogene (indicate cu asteriscuri). Barele de scară reprezintă 200 µm.

2.3.3. Ctns−/− Femelele Zebrafish arată o scădere a producției de ouă

Pentru a investiga funcționalitatea sistemului reproducător, am măsurat producția de ouă și procentul de ouă fertilizate atât la peștele-zebră de tip sălbatic, cât și la ctns-/-. Am descoperit că femelele ctns-/- prezintă o producție scăzută de ouă (Figura 8A) și un procent scăzut de ouă fertilizate (Figura 8B) în comparație cu femelele de tip sălbatic.

Figura 8. Producția de ouă și procentul de ouă fertilizate la peștele-zebră de tip sălbatic și ctns-/-. (A) Producția de ouă a fost măsurată ca număr total de ouă în tipul sălbatic și ctns-/- zebrafish 18-zebrafish vechi de lună. Rata de producție de ouă este de 1,941 ridicată la peștele-zebra de tip sălbatic în comparație cu ctns-/- pești-zebra de 18 luni (raportul ratei=1.941); 95% CI (limită inferioară=1,165, limita superioară=3,234); Analiza regresiei Poisson; p=0.011. (B) Procentul de ouă fertilizate a fost măsurat pe numărul total de ouă. Șansele de ouă fertilizate sunt de 3,504 mari la peștele-zebra de tip sălbatic în comparație cu ctns-/- 18-luni de pește-zebra (raportul de șanse=3,504); 95% CI (limită inferioară=2,005, limita superioară=6,124); Analiza regresiei logistice; p < 0,001;="" n/a:="" nu="" se="">

2.3.4. Ctns−/− Zebrafish afișează o activitate locomotorie scăzută

Deoarece pierderea musculară și slăbiciunea au fost diagnosticate încistinozăpacienți, în general din a doua decadă de viață [1,18], am evaluat activitatea locomotorie în modelul nostru de pește zebra. Am descoperit că peștele-zebră ctns-/- de la ambele sexe au prezentat o activitate locomotorie scăzută în comparație cu peștele-zebra de tip sălbatic, sugerând o funcție musculară afectată (Figura 9). Cu toate acestea, analiza histologică a țesutului muscular scheletic nu a evidențiat anomalii aparente la ctns-/- peștele-zebra.