Cercetare despre cel mai bun mod de a lua extract de Cistanche-Cistanche, Supliment pentru sănătate, Alimente pentru Cistanche

Autor:LI Yang, QIN Yadi, BUBIAJIAER Hayilati, YAO Jun, YUAN Jie, YOU Lin

（1. Școala de Farmacie, Universitatea Medicală Xinjiang, Urumqi 830011;2. Xinjiang Second Medical College, Klamayi 834000;3. Hotan Dichen Pharmaceuticas & Biotech Co., Ltd., Hotan 848000）

Abstract:

Obiectiv: Stabilirea unei metode pentru identificarea și determinarea a patru glicozide de feniletanol (echinacozidă, tubulozidă A, actozidă, izoacteozidă) în bucăți de cistanche, extractele sale și alimentele sănătoase aferente prin TLC și QAMS.

Metodă:

（1）TLC: Patru fenil etanol glicozide au fost identificate prin TLC cu film de poliamidă ca fază staționară și cloroform-metanol-acid acetic-apă (1,5∶2∶1∶7) ca solvent de dezvoltare. Pata a fost detectată sub lumină ultravioletă la 365 nm.

(2) Folosind echinacozidul ca referință internă, factorii de corecție relativi pentru tubulozidă A, acetonidă și izoacteozidă au fost utilizați pentru a calcula conținutul fiecărei componente. Rezultatele calculului metodei QAMS au fost comparate cu valorile metodei standard externe.

Rezultat: Petele TLC ale 4 glicozide de feniletanol (echinacozidă, tubulozidă A, actozidă și izoacteozidă) în bucăți de decoct de cistanche, extracte și alimente funcționale au fost toate clare, cu o bună separare, o valoare Rf specifică puternică și moderată. Reproductibilitatea factorilor de corecție relativă a tubulozidei A, aacteozidei și a izoacteozidei a fost bună și nicio diferență evidentă între cele două metode.

Concluzie: Metoda stabilită în acest studiu este simplă, precisă și reproductibilă. Poate oferi o referință pentru controlul calității componentelor eficiente ale bucăților de decoct cistanche, extractelor și alimentelor funcționale.

Cuvinte cheie:cistanche; bucăți de decoct; produse înrudite;glicozide de alcool fenetil;TLC; QAMS

Cistanche deserticola YC Ma. este o plantă parazită perenă din familia Orobanchaceae. Este folosit ca medicament cu tulpini uscate cărnoase cu frunze solzoase. Cistanche a fost publicată pentru prima dată în „Shenlong Materia Medica” și a fost listată ca clasa de top. Are gust dulce, cald în natură, sărat și aparține meridianelor rinichilor și intestinului gros. Are efecte de umezire a intestinelor și laxative, revigorând yang-ul rinichilor și beneficiind de esență și sânge. Este produs în principal în Xinjiang, Ningxia, Mongolia Interioară, Qinghai, Gansu și alte regiuni aride din nord-vestul Chinei. Principalele componente chimice ale Cistanche sunt glicozide feniletanoide, iridoide, lignani, alcaloizi, monoterpene, zaharuri, uleiuri volatile și oligoelemente anorganice. Printre acestea, glicozidele feniletanoide (Phys) sunt una dintre principalele componente farmacologice, care au activități farmacologice precum antioxidant, neuroprotecție, antiviral, îmbunătățirea imunității, antioboseală și îmbunătățirea memoriei și îmbunătățirea imunității.

Beneficiile extractului de Cistanche:

Cistanche Extract este făcut din tablete uscate de Cistanche inactivate cu enzime, care sunt extrase și separate. A fost exportat în Japonia, Coreea de Sud, Malaezia și alte piețe de peste mări și este utilizat pe scară largă în produse de îngrijire a sănătății, cosmetice și industriile farmaceutice. Produsul de îngrijire a sănătății procesat dinExtract de Cistancheca materie primă are funcţiile duale de îngrijire a sănătăţii deameliorarea oboselii fiziceșiîmbunătățirea imunității. În prezent, există o lipsă de standarde de control corespunzătoare pentru evaluarea calității ingredientelor active ale extractului de Cistanche și a produselor de îngrijire a sănătății și este dificil să se asigure calitatea și siguranța prelucrării și a vânzărilor pe piață. Echinaceea și verbascozidul sunt componentele indexului pentru identificarea și determinarea conținutului la articolul deCistanche Tubulosaîn ediția din 2020 a Farmacopeei Chineze. În plus,Cistanche Tubulosamai conține și alte glicozide feniletanoide, cum ar fi tuberozina A, salidrozidă, izoverbazin, cistancheoside C, cistancheoside D, aurirozidă, 2′-acetilverbasin etc.Diferite grade de efecte antioxidante și neuroprotectoare.Este dificil să se evalueze cuprinzător și precis calitatea acestuia utilizând doar echinacozidul și verbascozidul ca indicatori de detectare. În literatura de specialitate s-a raportat că conținutul de ducttaloside A și isaveraside în Cistanche și Cistanche a fost, de asemenea, mai mare, ajungând la {{0}},29 la sută, 0,21 la sută, 0 0,06 la sută și, respectiv, 0,10 la sută.

Faceți clic aici pentru a afla mai multe beneficii cistanche

În această lucrare, au fost stabilite identificarea TLC a 4 glicozide feniletanoide (echinacozidă, tuberozidă A, verbascozidă, isorrascozidă) în bucăți de decoct de Cistanche Tubulosa și produse aferente (extracte, produse de sănătate) și cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC). Metoda de determinare a conținutului metodei de evaluare (HPLC-QAMS) oferă o referință pentru îmbunătățirea în continuare a metodei de evaluare a calității Cistanche Tubulosa.

1 Material și metode de alegere a celui mai bun mod de a lua Cistanche

1.1 Instrumente și reactivi

Cromatograf lichid de înaltă performanță Shimadzu LC-20AT; Cromatograf lichid de înaltă performanță Shimadzu LC-20AB; Cromatograf lichid de înaltă performanță Agilent1260; Balanță analitică (AB135-S, Compania Mettler Toledo1o); KQ-500DE curățător cu ultrasunete

(KQ-500DE, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); Instrument de localizare semi-automat (CAMAG, Elveția).

(1) Bucăți de decoct de Cistanche disponibile comercial (S1, S2: Cistanche deserticola, origine în Alxa, Xinjiang; S3, S4: CistancheTunulosa, origine Xinjiang): achiziționate de laWecistanche Co. Ltd.; Extracția cu alcool a tabletelor uscate cu enzime, S6: extracția cu apă a tabletelor uscate inactivate cu enzime, S7: tabletele uscate inactivate cu enzime, extracția cu alcool cu ​​rășină) și produsele de sănătate (S8) sunt furnizate de Xinjiang Hetian Dichen Biotechnology Co., Ltd.

(2) Substanță de referință echinacea (număr lot: S-003-01904003, puritate: mai mare sau egală cu 98 la sută), tuberozina A (număr lot: G-066-11812016, puritate: mai mare sau egală cu 98 la sută ), verbascozidă (număr lot: mai mare sau egal cu 98 la sută ) M-011-02103019, puritate: mai mare sau egală cu 98 la sută ), isaveraside (număr lot: Y-073-11803024, puritate: mai mare decât sau egal cu 98 la sută ): Beijing Yingleike Technology Development Co., Ltd.

(3) Metanolul, acetonitrilul și acidul formic au fost pure cromatografic; cloroformul și acidul acetic glacial au fost puri din punct de vedere analitic; apa era apă ultrapură;

1.2 Metoda experimentală

1.2.1 Identificare prin cromatografie în strat subțire

1.2.1.1 Prepararea soluției de testare Luați pulberea de testat (0.5g bucăți de decoct Cistanche, 0.2g extract de Cistanche, 0.5g produs de sănătate), adăugați 20mL de 50% metanol, tratați-l cu ultrasunete timp de 15 minute și filtrați.

Filtratul a fost concentrat la 2 ml, trecut printr-o membrană microporoasă 0,45 μm și utilizat ca soluție de testare.

1.2.1.2 Prepararea soluției de substanță de referință Se cântăresc cu precizie 10 mg de substanță de referință echinacozidă, vasozidă A, verbascozidă și izorrascozidă, se adaugă 50% metanol pentru a se dizolva și se diluează la un volum de 10 ml.

flacon, ca soluție stoc standard unică de referință. Măsurați cu precizie aproximativ 2 ml din soluția stoc unic standard a fiecărei substanțe de referință, adăugați 50 procente de metanol în același balon cotat de 10 ml și treceți printr-o membrană microporoasă de 0,45 μm ca soluție mixtă de referință.

1.2.1.3 Prepararea soluției de probă negativă Se cântărește alte materiale medicinale, altele decât Cistanche, conform prescripției produsului de sănătate, și se operează după aceeași metodă pentru prepararea soluției de testare pentru a prepara soluția de probă negativă.

1.2.2 Determinarea conținutului prin metoda de evaluare a unui test-multiplu

1.2.2.1 Condiții cromatografice Coloana: INERTSIL ODS-3 (250mm×4,6mm, 5μm); fază mobilă: acetonitril (A)-0,1% soluție de acid formic (B), gradient de eluție (0 ~ 12min, 17% ~ 20% A; 12~30min, 20% ~22% A 30~35min, 22% ~17% A); Lungime de undă de detectare: 330 nm; Debit: 1,0 ml · min-1; Temperatura coloanei: 30 de grade; Volumul de injectare: 10μL.

1.2.2.2 Prepararea soluției de substanță de referință Luați aproximativ 10 mg de substanță de referință echinacozidă, tuberozină A, verbascozidă și izorrascozidă fiecare, cântăriți-le cu precizie și puneți-le în baloane cotate de 10 ml, respectiv, folosind 50 la sută.

Se dizolvă metanolul și se aduce la semn, se agită bine pentru a obține soluția stoc unică standard de substanță de referință cu concentrații de 1.008, 1.011, 1.012 și, respectiv, 1.012 mg·mL-1. Măsurați cu precizie o cantitate adecvată din soluția stoc unic standard a fiecărei substanțe de referință, puneți-o în același balon cotat de 10 ml, adăugați 50% metanol la semn, agitați bine și pregătiți un amestec cu o concentrație de 201,60, 50,55, 101,20. , 50,60ug·mL-1 Soluția de referință a fost trecută printr-o membrană microporoasă de 0,45μm.

1.2.2.3 Prepararea soluției de testare

① Soluție de testare bucăți de decoct Cistanche: se cântăresc aproximativ 1,0g de pulbere bucăți decoct Cistanche (trecut printr-o sită nr. 4), se cântărește cu precizie, se adaugă cu precizie 25 ml de 50 procente de metanol, se agită bine , cântăriți și ultrasonic (putere 250w, frecvență 35kHz) 40 min, lăsați-l să se răcească, cântăriți din nou, completați greutatea redusă cu 50 la sută metanol, agitați bine, filtrați prin hârtie de filtru și luați filtratul să treacă printr-o membrană microporoasă de 0,45 μm .

②Soluția de extract de Cistanche pentru testare: luați pulberea de extract de Cistanche (S5: fulgi uscati inactivați cu enzime extrase cu alcool, S6: fulgi uscati inactivați cu enzime extrase cu apă, S7: fulgi uscati inactivați cu enzime extrase cu alcool, cu rășină) aproximativ 0,2 g. Se cântărește și se prepară cu precizie soluția de testare a extractului de Cistanche conform metodei de la „①”. ③Soluție de testare a produselor de îngrijire a sănătății: Luați 10 produse de îngrijire a sănătății, cântăriți-le cu precizie, măcinați-le fin, calculați greutatea medie a tabletei, cântăriți cu precizie 1 tabletă (aproximativ 0,5 g) și pregătiți produsele de îngrijire a sănătății conform metoda de sub „①”. Soluție de testare.

2 Rezultate și Analize ale alegerii celui mai bun Cistanche

1.1 Instrumente și reactivi

2.1 Identificare prin cromatografie în strat subțire

Conform testului de cromatografie în strat subțire (Regula generală 0502), trageți 2 μL de substanță de referință soluție standard unică, soluție mixtă de substanță de referință, soluție de testare și, respectiv, soluție de probă negativă și direcționați-le pe aceeași soluție de poliacrilamidă.

Pe placa de film de amină, utilizați cloroform-metanol-acid acetic glaciar-apă (1,5:2:1:7) ca agent de dezvoltare, dezvoltați, scoateți, uscați și inspectați sub lumină ultravioletă (365 nm). Rezultate Substanța de testat a arătat pete fluorescente de aceeași culoare în poziția corespunzătoare pe cromatograma substanței de referință și nu a existat nicio interferență atunci când este negativă, așa cum se arată în Figura 1.

Figura 1 Cromatograme TLC ale bucăților de cistanche, extract, produse de sănătate

Notă: De la stânga la dreapta sunt echinacozide, tuberozide A, verbascozide, isaverazide, substanțe de referință amestecate, bucăți de decoct de Cistanche (S1 ~ S4), extract de Cistanche (S5 ~ S7), produse de îngrijire a sănătății (S8), mostre negative de sănătate produse (S8)

2.2 Determinarea conținutului prin metoda de evaluare a unui test-multiplu

2.2.1 Test de specificitate

Se iau 10 μL din fiecare dintre soluția de referință amestecată și soluția de testat și se injectează și se analizează în conformitate cu condițiile cromatografice de la punctul 1.2.2.1. Rezoluția dintre vârful țintă și componentele adiacente din soluția de referință și soluția de testare este mai mare de 1,5, iar specificitatea este bună. , iar cromatograma este prezentată în Figura 2.

2.2.2 Investigarea relației liniare

Desenați cu precizie 0.5, 1, 2,5, 5 și 10 ml din soluția mixtă de referință sub „1.2.1.2”, puneți-le în baloane cotate de 10 ml, completați până la semn cu 50% metanol și se agită bine pentru a obţine o serie de amestecuri de concentrare.

Se combină soluția de referință, se pipetează cu precizie 10 μL și se injectează probe în conformitate cu condițiile cromatografice de la „1.2.2.1” pentru a măsura aria vârfului. pentru

Stați vertical, desenați o curbă de regresie și calculați o regresie liniară. Rezultatele au arătat că r au fost toți mai mari decât 0.9993, iar cele patru fenetil glicozide au arătat o relație liniară bună cu aria vârfului în intervalul liniar corespunzător, așa cum se arată în tabelul 1.

Figura 2 Spectrul HPLC al substanței de referință și al substanței eșantionului

1. echinacozid;2. Tubulozid A;3. Acteozid;4. Isoacteozidă

Notă:

A. Cromatograma substanței de referință mixte;

B. Cromatograma pieselor Cistanche Docation;

C. Cromatograma extractului de Cistanche;

D. Cromatograma suplimentului de sănătate

Tabelul 1 Rezultatele relației liniare a 4 componente

2.2.3 Test de precizie

Pipetați cu precizie 1{{10}} μL din soluția mixtă de referință la „1.2.1.2”, injectați și măsurați de 6 ori continuu conform condițiilor cromatografice la „1.2.2.1”, înregistrați aria vârfului și calculați RSD-ul său. Rezultate RSD-urile zonelor de vârf ale echinacozidei, tuberozinei A, verbascozidei și izoverascozidei au fost 0,79%, 1,24%, 0,59% și, respectiv, 0,42% (n=6), indicând faptul că precizia instrumentului a fost buna.

2.2.4 Test de repetabilitate

Luați 6 copii din același lot de pulberi de testare (S3, S6, S8), cântăriți-le cu precizie, pregătiți soluția de testare conform „1.2.1.3”, măsurați conform condițiilor cromatografice de la „1.2.2.1” și înregistrați Peak s-a calculat conținutul celor 4 componente și RSD-urile acestora. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2, indicând faptul că metoda are o reproductibilitate bună.

Tabelul 2 Teste repetitive

2.2.5 Test de stabilitate

Se extrage cu precizie 10 μL din soluția de testat (S3, S6, S8), se măsoară conform condițiilor cromatografice de la „1.2.2.1” și se injectează probe la 0, 2, 4, 6, 8, 12 și, respectiv, 24 de ore pentru măsurare. Rezultate RSD-urile (n=7) ale zonelor de vârf ale echinacozidei, analozidei A, verascozidei și isaverazidei din eșantion (S3) au fost de 1,28 la sută, 1,82 la sută, 1,52 la sută și, respectiv, 1,56 la sută. RSD-urile (n=7) ale zonelor de vârf ale celor patru componente din eșantion (S8) au fost de 1,38 la sută, 1,57 la sută, 1,73 la sută și, respectiv, 2,49 la sută, iar DSR-urile (n=7) dintre zonele de vârf ale celor patru componente din probă (S8) au fost 1,63 la sută, 0,92 la sută, 1,85 la sută și 2,24 la sută, ceea ce indică faptul că soluția de testat este stabilă în 24 de ore.

2.2.6 Test de recuperare

Se cântăresc 9 pulberi din produsul testat (S3, S6, S8) cu conținut cunoscut, se cântăresc cu precizie și se prepară soluția de testare conform metodei de la „1.2.2.3”. Se adaugă proporțional o anumită cantitate din soluția de referință a celor patru componente, se injectează și se măsoară conform condițiilor cromatografice de la „1.2.2.1”, se înregistrează aria vârfului, se calculează rata de recuperare și RSD-ul acesteia, iar rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3. .

Tabelul 3 Rezultatele ratelor de recuperare a probei（n=3）

2.2.7 Calculul factorului de corecție relativă

Factorul de corecție relativă se calculează prin metoda de corecție în mai multe puncte, conform formulei fi/s=fi/fs=(Wi×AS)/(WS×Ai), unde fi/s este factorul de corecție relativ dintre componenta de testat și referința internă, Ai, AS sunt zonele de vârf ale componentei care trebuie măsurate și, respectiv, referința internă, iar Wi și WS sunt cantitățile componentei de măsurat și respectiv referința internă.

Folosind echinacozidul ca referință internă, luați 1, 2, 5, 10, 15, 20 și 30 μL din soluția mixtă de referință pentru a se transforma în volumul de injectare și injectați și măsurați în conformitate cu condițiile cromatografice de la „1.2.2.1”. . Măsurați factorul de corecție relativă (fi/s) al ductozidei A (B), verbascozidei (C), isaverasidei (D) și echinacozidei de referință internă (A) și luați valoarea medie ca corecție relativă pentru cuantificare RSD-ul relativ a fost investigat factorul de corecție calculat la 7 puncte. Rezultatele au arătat că RSD-ul factorului de corecție relativ al celor trei componente testate și echinacozidul de referință intern au fost toate mai mici de 3 procente, așa cum se arată în Tabelul 4.

Tabelul 4 Factori de corecție relativi （fi/s） ai 3 componente și referință internă pentru echinacozidă

Notă: A: Echinacea, B: Tuberozidă A, C: Verbasin, D: Isaveraside

2.2.8 Reproductibilitatea factorilor de corecție relativi

Au fost investigate trei cromatografe lichide de înaltă performanță, Shimadzu LC-20AT, Shimadzu LC-20AB, Agilent1260 și INERTSILODS-3 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), XBridgeC18.

Efectele a trei coloane cromatografice (250mm×4.6mm, 5μm) și Agilent C18 (250mm×4.6mm, 5μm) asupra factorului de corecție relativă și calculând RSD, rezultatele sunt toate mai mici de 3 la sută, indicând faptul că relativul stabilit factor de corecție în diferite lichide de înaltă eficiență. Cromatografia de fază și diferite coloane cromatografice au fost reproductibile, rezultatele sunt prezentate în Tabelul 5

Tabelul 5 Factori de corecție relativi（fi/s）din 3 componente și echinacozidă prin diferite instrumente și diferite coloane HPLC

Notă: A: Echinacea, B: Tuberozidă A, C: Verbasin, D: Isaveraside

2.2.9 Poziționarea vârfurilor cromatografice ale componentelor de măsurat

În funcție de timpul de retenție obținut la „2.2.8”, se calculează valoarea relativă de retenție a componentei de testat și echinacozidul de referință intern (ri/s= tRi/tRs, unde tRi și tRs sunt timpul de retenție). ) și RSD-ul său. Rezultate RSD-urile valorilor relative de retenție ale componentelor de testat au fost toate mai mici de 5 procente, indicând faptul că valorile relative de retenție au fost stabile și ar putea fi utilizate pentru localizarea vârfurilor cromatografice ale componentelor de testat. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 6.

2.2.10 Compararea rezultatelor măsurătorilor între o metodă de testare și o metodă de evaluare multiplă și metoda standard externă

Cântăriți cu precizie fiecare lot de probe, pregătiți soluția de testare conform punctului „1.2.1.3”, extrageți cu precizie 10 μL din soluția de referință mixtă și soluția de testare și injectați probele în conformitate cu condițiile cromatografice din „1.2.2.1”. , înregistrați zonele de vârf ale celor patru componente și utilizați metoda standard externă și metoda stabilită pentru o măsurătoare-multiple-evaluare (Wi=fi/s×Ws×Ai/As) pentru a calcula conținutul respectiv patru componente. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 7. Software-ul SPSS 26.0 a fost utilizat pentru a analiza rezultatele celor două metode prin testul t, P > 0,05, indicând că nu a existat o diferență semnificativă între conținutul măsurat de standardul extern metoda și conținutul calculat prin metoda testului unic, evaluării multiple, indicând faptul că metoda cu măsurare și evaluare multiplă poate fi utilizată pentru bucăți de decoct Cistanche deserticola, cercetarea controlului calității ingredientelor active din extracte și produse de sănătate.

Tabelul 6 Valorile relative de retenție（ri/s）din 3 componente și echinacozidă prin diferite instrumente și diferite coloane HPLC

Notă: A: Echinacea, B: Tuberozidă A, C: Verbasin, D: Isaveraside

3 Concluzia alegeriicel mai bun mod de a lua Cistanche

Pentru a îmbunătăți eficiența identificării și diversitatea metodelor de identificare, acest test a adăugat două componente, ductozida A și isaveraside, pe baza testului de identificare la articolul Cistanche deserticola din ediția 2020 a Farmacopeei Chineze. S-au folosit condiţiile de dezvoltare ale Farmacopeei: metanol. - Acid acetic glacial - apă=2:1:7, s-a constatat că gradul de separare al echinacozidului și al tuberozidei A nu a putut îndeplini cerințele și a fost efectuat testul de screening al fazei staționare și respectiv al agentului de dezvoltare.

Folosind placă de film de poliamidă, placă cu strat subțire de silicagel G, placă cu strat subțire de gel de silice H ca fază staționară, acetonă-metanol-acid acetic glaciar-apă=1:2:1:7, metanol-acid acetic glaciar -apă=4:1:5. Acetat de etil:etanol=6:4, n-butanol-etanol-apă=4:1:5, triclormetan-metanol-acid acetic glaciar-apă =1.5:2:1:7 Rezultate Folosind placa de film de poliamidă ca fază staționară, cloroform-metanol-acid acetic glaciar-apă=1.5∶2∶1∶7, petele au fost clare , separarea a fost bună, valoarea Rf a fost moderată, iar repetabilitatea a fost bună. Caracterizarea rapidă și precisă a ingredientelor. Metoda de evaluare a unei singure măsurători este o metodă de control al calității sincronă cu mai mulți indici, care este utilizată în principal pentru determinarea componentelor structurale similare într-o singură medicină tradițională chineză. Cele patru componente măsurate în acest experiment au structuri similare și lungimi de undă de absorbție maximă similare (glicozide de Echinacea la 330 nm, tuberozide A331 nm, verbascozide 330 nm, isorrascozide 327 nm), astfel încât această metodă poate fi utilizată. Folosind echinacozidul ca referință internă, factorul de calibrare stabilit are o reproductibilitate bună în diferite sisteme cromatografice și coloane cromatografice și nu există nicio diferență semnificativă între rezultatele de conținut ale metodei cu o măsurătoare-multiple-evaluare și metoda standard extern, indicând faptul că metoda este fezabilă și precisă și poate fi utilizată în substanța de referință. Dacă este dificil de obținut sau costisitor, se poate obține mai mulți indicatori de Cistanche deserticola

Ingredientele sunt determinate simultan.

Tabelul 7 Conținutul fiecărei componente（la sută,n=3）

În concluzie, stabilirea unei metode de identificare a patru glicozide feniletanoide în Cistanche prinTLCiar determinarea conținutului într-un singur test cu evaluări multiple este precisă, fiabilă, simplă, rapidă și foarte fezabilă. Are semnificație științifică practică și valoare de aplicare.