Recablarea metabolismului glucozei și lipidelor indusă de receptorul cuplat cu proteina G 17 Silenciarea permite tranziția progenitorilor oligodendrocitelor la celulele mielinizante Ⅱ

3. Rezultate

3.1. Tăcere GPR17 în diferențierea OPC-urilor a modificat în mod semnificativ expresia genelor implicate în metabolismul lipidelor și glucozei

Pentru a evidenția procesele biologice afectate în mod semnificativ de expresia GPR17 în timpul diferențierii OL, am interferat cu expresia acesteia prin transfectarea OPC-urilor de șobolan cu siRNA-uri SMART-pool specifice pentru GPR17 de șobolan. După ce am validat eliminarea cu succes a GPR17 prin qRT-PCR (Figura S1), am efectuat o analiză cu microarray a 30.584 de transcrieri de șobolan în OPC-urile GPR17-silentate versus control și am analizat genele exprimate diferențial (DEG) cu diferite instrumente bioinformatice. În primul rând, 640 DEG-urile au fost studiate de Meta-Core, pentru a efectua o analiză de îmbogățire a căilor și pentru a identifica procesele care se preconizează că vor fi afectate în mod semnificativ. Această analiză a sugerat modificarea semnalizării mTOR, care s-a dovedit deja a fi legată de funcția GPR17 [37] și a altor procese cunoscute a fi relevante pentru maturarea OPC, cum ar fi "remodelarea citoscheletului" și„reglarea metabolismului lipidic" (Tabelul 1).

la care se adauga

Faceți clic aici pentru a cunoaște Cistanche pentru creșterea oaselor

Tabelul 1. Software-ul MetaCore a fost utilizat pentru a efectua o analiză de îmbogățire a căilor asupra DEG-urilor după tăcere GPR17. Tabelul arată cele mai semnificative căi rezultate din analiză, numărul de gene asociate și genele comune incluse în setul de date

Apoi, instrumentul de analiză a căii Ingenuity (IPA) a fost folosit pentru a efectua o potrivire de analiză, care identifică automat seturi de date IPA curate cu asemănări și diferențe semnificative în comparație cu un set de date de interogare. Această analiză întărește legătura prezisă dintre expresia GPR17 și metabolismul lipidelor, arătând că modificările de expresie a 38 de gene din setul nostru de date (Tabelul S1) sunt asociate cu sinteza alterată a acizilor grași (Figura 1). Printre acestea, tăcere GPR17 a indus reglarea în sus a LXR (receptorul X hepatic alfa, NR1H3 în Figura 2 și Tabelul S1, un receptor nuclear care răspunde la oxisteroli) și SREBP1 (proteina de legare a elementului de reglare a sterolului 1, SREBF1 în Figura 1 și Tabelul S1), două jucători cheie în sinteza acizilor grași și a colesterolului. În setul nostru de date, am observat, de asemenea, că mai multe gene modificate, inclusiv PDH (piruvat dehidrogenază), Ldha (lactat dehidrogenază alfa) și Pdk1 (piruvat dehidrogenază kinaza 1), sunt legate de metabolismul glucozei și ciclul Krebs, sugerând implicarea potențială a receptorul GPR17 în reglarea acestor procese metabolice. În conformitate cu aceasta, o analiză de îmbogățire bazată pe ontologie genetică (suita ToppGene) asupra DEG-urilor a relevat alterarea „procesului metabolic al acidului monocarboxilic” (GO:{{20}}032787, p- valoare: 0,02), dincolo de alte procese legate de dezvoltarea SNC și metabolismul celular, cum ar fi „reglarea dezvoltării sistemului nervos” (GO:0051960, valoare p: 0,033) și „procese metabolice sfingolipide” (GO:0006665, valoare p : 0,043) (Figura 2; lista completă în Tabelul S2).

La nivel global, aceste modificări sugerează că tăcere GPR17 poate acționa ca un declanșator pentru adresa celulelor la mielinizare, prin reglarea mai multor gene implicate în reglarea transcripțională a homeostaziei lipidelor și glucozei, precum și în utilizarea colesterolului și lipidelor pentru producția de mielină.

Figura 1. Instrumentul de analiză a căii ingeniozității (IPA, Qiagen) a fost utilizat pentru a analiza setul de date și pentru a explora bolile și procesele biologice care se preconizează că vor crește sau descrește pe baza modelului de gene exprimate diferențial din setul de date. Din această analiză, am extrapolat schema din figură care include genele legate de sinteza lipidelor exprimate diferențial în setul nostru de date (valoarea p=9.67 × 10−4). Numele complete ale acestor gene, împreună cu schimbarea relativă a pliului (raportul log2) sunt raportate în Tabelul S1. În roșu, gene reglate în sus; în gene verzi, reglate în jos

Figura 2. Suita Toppgene a fost utilizată pentru analiza de îmbogățire bazată pe GO pe DEG. Imaginea prezintă unele dintre procesele biologice semnificative legate de sistemul nervos central și metabolismul celular potențial alterat de tăcere GPR17. Barele albastre indică genele totale asociate fiecărui termen; barele roșii indică genele în comun cu setul nostru de date pentru fiecare termen. Lista completă a proceselor biologice rezultate din această analiză și valorile p relative sunt raportate în Tabelul S2.

3.2. Analiza metabolomică în timpul diferențierii OPC in vitro

Pentru a evalua corelația dintre expresia GPR17 și activarea unor căi metabolice specifice, am efectuat o analiză metabolomică a OPC-urilor cultivate în timpul maturizării lor fiziologice. OPC-urile au fost menținute într-un mediu de diferențiere și apoi lizate la patru momente de timp diferite (după 0, 1, 3 și 5 zile de diferențiere, DID), care corespund diferitelor stadii de maturare a OL. În paralel, pentru a evalua că în toate experimentele maturarea a avut loc la momentul așteptat, OPC-urile au fost cultivate și colorate pentru GPR17 și MBP. Rezultatele au arătat că numărul de celule care exprimă GPR17-a atins maximul la 3 DID și apoi a revenit la nivelurile bazale la 5 DID, în timp ce numărul de celule pozitive pentru MBP a crescut progresiv în timpul maturării (Figura 3a), în mod constant cu rezultate anterioare [37]. Evaluarea metabolomică OPC a fost efectuată prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă în tandem (LC-MS/MS) așa cum s-a descris anterior [38], concentrându-se pe metaboliții energetici implicați în glicoliză, calea pentozei fosfat, ciclul Krebs, oxidarea acizilor grași, cofactorii acestora. NADH, NAD plus, NADPH, NADP plus, ATP, ADP, AMP, aminoacizi și unii dintre derivații acestora. Profilurile metabolomice ale punctelor de patru timp analizate sunt raportate în Figura 3b. În ziua 0, nivelurile mai multor metaboliți aparținând și/sau legați de ciclul Krebs (de exemplu, succinat, malat, alfa-cetoglutarat, glutamat, aspartat, alanină și prolină) au fost mai mari, așa cum era de așteptat de la celulele care vin dintr-o stare foarte proliferativă (Figura 3c). În stadiile intermediare (de la DID 1 la 3), OPC-urile au arătat o reglare pozitivă marcată a moleculelor implicate în sinteza acizilor grași și a colesterolului. În consecință, am observat niveluri crescute de acetil-CoA (Figura 3c), care reprezintă precursorul colesterolului și acizilor grași și al malonil-CoA, un intermediar specific al sintezei acizilor grași. La DID 5, am observat niveluri crescute ale mai multor acil-carnitine și aminoacizi în paralel cu o creștere semnificativă a glucozei intracelulare libere (Figura 3c). Am observat, de asemenea, niveluri scăzute de AMP și ADP din ziua 0 la DID 5 și o creștere tranzitorie a ATP între DID 1 și DID 3. Aceste date indică faptul că, din ziua 0 până la DID 3, corespunzătoare fereastra temporală în care GPR17 atinge expresia maximă, OPC-urile au folosit în principal glucoză și aminoacizi pentru a susține biosinteza colesterolului și a acizilor grași. La DID 5, după cum evidențiază nivelurile crescute de acil-carnitină, OPC-urile se bazează probabil pe utilizarea acizilor grași. Împreună, aceste date indică faptul că, în timpul diferențierii fiziologice, OPC-urile își recablează progresiv metabolismul energetic pentru a deveni OL mielinizante mature.

3.3. Analiza metabolomică după tăcere GPR17 în timpul maturării OPC in vitro

Pentru a dezvălui contribuția receptorului GPR17 la determinarea modificărilor metabolice energetice care au loc în timpul diferențierii celulelor, am efectuat metabolomice pe OPC-uri GPR17- reduse la tăcere, în comparație cu OPC-urile de control care primesc un ARN amestecat. Am examinat mai întâi impactul tăcerii GPR17 asupra maturării OPC prin colorarea prin imunofluorescență pentru GPR17 și MBP. După cum era de așteptat, după tăcere receptorului, am găsit o reducere a colorării GPR17, clar vizibilă la 3 DID. Am observat, de asemenea, o creștere semnificativă a numărului de OL mature pozitive pentru MBP atât la 3 DID (nu este prezentat) cât și la 5 DID (Figura S2). În paralel, analiza qPCR detaliată a fost efectuată la cinci momente (0, 1, 2, 3 și 5 zile în diferențiere, DID), dezvăluind, în OPC-urile de control, o creștere puternică a expresiei GPR17 după 1 DID, care atinge niveluri semnificative începând cu 2 DID, o creștere progresivă a expresiei MBP până la 5 DID și o scădere semnificativă a markerului precoce NG2 (Figura 4a). În schimb, după tăcere GPR17 (Figura 4b), ARNm GPR17 a atins niveluri mai scăzute la DID1 și apoi a rămas stabil scăzut, expresia MBP a crescut și mai mult și NG2 a scăzut în continuare. O comparație directă a expresiei NG2 și MBP în OPC-urile GPR17-silentate versus control la fiecare moment este prezentată în Figura 4c. Luate împreună, aceste rezultate sugerează că, în aceste condiții experimentale, tăcere GPR17 în OPC-uri a accelerat procesul lor de diferențiere. Apoi, metabolomica OPC a fost efectuată prin LC-MS/MS la cele cinci momente de timp selectate. Comparația datelor metabolomice obținute de la GPR17-OPC-uri reduse la tăcere și control la fiecare moment ne-a permis să identificăm metaboliții care sunt afectați în mod semnificativ de tăcere GPR17

Figura 3. (a) Graficul arată modificări ale procentului de celule GPR17 plus și MBP plus în timpul diferențierii. n=3 per grup; ANOVA unidirecțional cu testul lui Tukey. * p < 0.05, ** p < 0.01) (b) Harta termică arată abundența metaboliților în fiecare probă unică oprită la 0, 1 , 3 sau 5 DID. Abundența metaboliților analizați este reprezentată de o scară cromatică care variază de la albastru închis (abundență foarte scăzută) până la maro închis (abundență foarte mare). n=4–5 per grup. (c) Metaboliți cu o abundență semnificativ diferită între condiții (0, 1, 3 și 5 zile în diferențiere, DID; ANOVA unidirecțională cu testul Fisher LSD).

La DID 1 (Figura 5a), nu am găsit modificări semnificative. La DID 2 (Figura 5b), am găsit o creștere semnificativă a anumitor metaboliți ai ciclului Krebs (malat, fumarat citrat), o creștere modestă a carnitinei libere (CO), acetil-carnitinei (C2), propionil-carnitinei (C3: 0), butiril-carnitină (C4:0), valeril-carnitină (C5:{0), hexadecanoil-carnitină (C16:{0și o reducere semnificativă a glucozei , lactat, creatină și ornitină. Reducerea uleiactatului și creatinei și creșterea propionil-carnitinei (C3) au fost observate și la DID3 (Figura 5c). La DID 5 (Figura 5d), am găsit totuși o creștere a carnitinei libere ( CO), acetilcarnitină (C2), propionil-carnitină (C3:0), butiril-carnitină (C4:{{30}}), valeril-carnitină (C5:0 )tetradecanoil-carnitină (C14:0), hexadecanoil-carnitină (C16:{0), octadecanoil-carnitină C18:0), octadecenoil-carnitină (C18:1), similar celor observate inițial în mai multe celule diferențiate (vezi Figura 3), o creștere a dihidroxiacetonei-3-fosfat/gliceraldehidă{3-fosfat (DHAP/GAP), fumarat și citrat și o scădere a acetil-CoA, Met-SOcreatina, taurină și carnozină.

Figura 4. Efectul silenciării GPR17 asupra maturării OPC. Nivelurile de expresie ale GPR17 (verde), NG2blue) și MBP (roșu) au fost evaluate prin PCR în timp real în timpul diferențierii în condiții de control (celule transfectate cu ARN amestecat și după tăcere GPR17 (b) și normalizate față de expresie la T{{{ 6}} (setat la 0). n=6 pentru fiecare punct de timp. ANOVA unidirecțională cu testele de comparații multiple ale lui Tukey (a): ** p < {{1{0} }.001 față de DID 0-2-3-5, @ p < 0.{05 față de DID 3-5; ## p < 0.01 față de ziua 0; SSS p < {{3{0}}.001 față de DID{ {21}}; (b): *** p < 0.001 vs. DID 0-2-3-5, @@@ p < 0 .001 față de ziua 0, # p < 0,05, ### p < 0,001 față de ziua 0.S p < 0,05, SS p < 0,01, SSS p < 0,001 V. DID 5. (C) Expresia NG2 și MBP în GPR17-a oprit OPCsvs. OPC-uri de control (setate la 0) la fiecare punct de timp. Modificarea plierii (FC) a fost raportată ca LOG,(FC). Un test t eșantion, * p < 0,05, * p < 0,01, *** p < 0,001 față de DID relativ în OPC-urile de control.

Figura 5. Modificări metabolomice induse de tăcere GPR17 în OPC. (a–d) Abundența fiecărui metabolit după tăcere GPR17 a fost normalizată la cea din proba de control relativă. Modificările de pliere rezultate au fost utilizate pentru a genera un grafic vulcan pentru fiecare punct de timp (1, 2, 3, 5 zile în diferențiere). Punctele de peste linia orizontală punctată reprezintă metaboliții care au prezentat o schimbare semnificativă statistic (LSD-ul lui Fisher corectat prin FDR; p.adj < 0.1). În verde, metaboliții cu expresie mai mică, în roșu, cei cu expresie mai mare, după tăcere GPR17. n=7–9 pentru fiecare grup. DID: zile în diferențiere.

3.4. GPR17 modulează eliberarea de lactat în timpul maturării OPC

Pe baza rezultatelor metabolomice descrise mai sus, s-a constatat că tăcere GPR17 reduce nivelurile intracelulare de lactat. Pentru a evalua dacă această reducere reflectă o scădere generală a metabolismului lactatului sau o eliberare crescută a acestui metabolit, am măsurat nivelurile acestuia în lizatele celulare și în mediile corespunzătoare în diferite momente de timp. După cum se arată în Figura 6, în condiții de control, lactatul intracelular a atins cea mai mare abundență la DID 2 (Figura 6a) (când expresia receptorului GPR17 este, de asemenea, maximă) și apoi s-a redus când celulele au devenit mature. În schimb, după tăcere GPR17, creșterea lactatului intracelular a fost abolită, iar nivelurile sale au scăzut în continuare spre diferențiere. Într-adevăr, o comparație a nivelurilor de lactat din OPC-urile GPR17-a redus la tăcere față de OPC-urile de control la fiecare moment de timp a evidențiat o reducere a nivelurilor sale la DID 2 și 3 (Figura 6b). Lactatul extracelular a urmat o cinetică diferită, arătând o reducere semnificativă în comparație cu DID 1 la DID 2-3-5 în condiții de control, în timp ce în OPC-urile GPR17-silentate a rămas stabil mai mare și apoi a scăzut semnificativ la DID 5 (Figura 6c) ). Cu toate acestea, atunci când se compară nivelurile de lactat la diferite momente de timp dintre cele două condiții experimentale, tăcere GPR17 a împiedicat reducerea fiziologică,creșterea prezenței lactatuluiîn mediu la DID 2 și 3 (Figura 6d),sugerând o eliberare crescută.

Figura 6. Silenciarea GPR17 în OPC modifică metabolismul lactatului. (a) Abundența de lactat în timpul maturării OPC în condiții de control (linia verde) și după tăcere GPR17 (linia portocalie). n=7–9 per grup. ANOVA unidirecțional cu testul de comparații multiple al lui Tukey. * p < 0.05, ** p < 0.01 față de DID2 CTL; §§ p < 0.01, §§§ p < {{3{0}}.001 față de DID1 siGPR17 (b ) Nivelurile de lactat după tăcere GPR17 au fost normalizate față de probele de control (setate la 1) la fiecare punct de timp (n=7-9). ** p < 0,01; un test t eșantion. Mediile condiționate de la GPR17-OPC-urile de control și de control au fost colectate din aceeași cultură utilizată pentru analiza metabolomică. Nivelurile de lactat din medii au fost evaluate prin LC-MS/MS. ( c ) Abundența de lactat în spațiul extracelular în timpul maturării OPC în condiții de control (linia verde) și după tăcere GPR17 (linia portocalie). ANOVA unidirecțional cu testul de comparații multiple al lui Tukey. ** p < 0,01, *** p < 0,001 faţă de DID1 CTL; § p < 0,05 față de DID5 siGPR17. ( d ) Nivelurile extracelulare de lactat după tăcere GPR17 au fost normalizate față de probele de control (setate la 1) la fiecare moment de timp. * p < 0,05; ** p < 0,01; un test t eșantion. Efectul inhibării MCT1 în OPC-urile de control (e,g) și GPR17-silenți (f,h) a fost evaluat prin analiza expresiei MBP, în probele tratate cu inhibitor față de controalele relative (tratate cu vehicul) , la 3 si 5 zile de diferentiere. n=6 per grup.

Unul dintre mecanismele prin careOPC-urile pot elibera lactateste prin transportorul monocarboxilat MCT1. Mai mult, studii recente au raportat că OPC-urile însele pot dobândi lactat extracelular prin receptorii MCT, promovând ciclul și diferențierea lor celulară [39]. Astfel, ne-am întrebat dacă eliberarea crescută de lactat indusă de tăcere GPR17 ar putea fi mediată de MCT1 și dacă aceasta poate fi parțial responsabilă pentru efectul observat asupra maturării OPC în aceleași condiții (Figura 4). În acest scop, am tratat OPC-urile cu AR-C155858, un inhibitor selectiv al MCT1, în timpul diferențierii normale și după tăcere GPR17. După cum era de așteptat, eliberarea de lactat a fost inhibată cu succes în ambele condiții (Figura S3). Efectul inhibării MCT1 asupra maturării OPC în diferite condiții experimentale a fost evaluat prin analiza nivelurilor de expresie ale MBP. O reducere modestă a expresiei genice a MBP, care este aproape de semnificația statistică (p=0.07), a fost găsită numai în probele transfectate cu ARNsi specific pentru GPR17 (Figura 6e–h); cu toate acestea, nu a apărut nicio variație semnificativă în probele transfectate cu ARN de control (siNEG). Aceste rezultate sugerează că creșterea lactatului extracelular mediată de reglarea în jos a GPR17 favorizează maturarea OPC-urilor; cu toate acestea, gradul mic de reducere a MBP indică faptul că acest metabolit nu este singurul factor implicat în proces.

3.5. Analiza lipidomică după tăcere GPR17 în timpul maturării OPC

Rezultatele analizei transcriptomice după tăcere GPR17 au evidențiat, de asemenea, o potențială legătură între funcția sa și căile sintetice ale lipidelor și colesterolului, care sunt principalele componente ale mielinei. Pentru a investiga în continuare rolul GPR17 în metabolismul lipidelor, am aplicat LC-MS/MS la analiza lipidomică a OPC-urilor GPR17-silentate după 2, 3 și 5 zile de diferențiere, comparativ cu ziua 0. Lista lipidelor analizate, modificările relative ale orificiilor și valorile p sunt raportate în Tabelul S4. Cele mai abundente două clase de lipide din grupurile experimentale au fost acizii grași și familia diacil-fosfatidilcolină (PCaa). În timpul diferențierii OPC-urilor de control, nu am găsit modificări semnificative în abundența oricărei clase de lipide. În schimb, GPR17-OPC-urile reduse la tăcere au arătat o tendință către o abundență modificată de acizi grași liberi, ceramide, acil-alchil-fosfatidilcolină (PCae) și fosfatidilinozitol (PI) în comparație cu OPC-urile de control, în special la DID 3 și 5, dar numai diacil-fosfatidiletanolamina (PEaa) și sfingomielina (SM) au prezentat o schimbare semnificativă statistic (Figura 7).

Figura 7. Modificări ale abundenței claselor lipidice induse de tăcere GPR17 în timpul diferențierii OPC. Abundența fiecărei clase de lipide în condiții de control în diferite momente este raportată (a) Cinetica fiecărei clase de lipide după tăcere GPR17 a fost analizată: (b) acizi grași, (C) ceramide (d) LysoPC (lisofosfatidil-coline), (e) LysoPE (lizofosfatidiletanolamine), (f) PCaa (diacil-fosfatidil-coline), (g) PCae (acil-alchil-fosfatidil-coline), (h) PEaa (di-acilfosfatidil-etanolamine), (i) PEae (acil-alchil-fosfatidil-etanolamine), (i) PI (fosfatidilinozitoli), (k) PS (fosfatidil-serine), (D SM (sfingomieline). n=5 pentru fiecare grup. Cinetică: bidirecțională ANOVA urmat de testul de comparație multiplă al lui Tukey. siGPR17: ANOVA bidirecțional urmat de testul de comparație multiplă al lui Sidak. * p.adi < 0.05, ** p.adi < 0,01.

Comparația datelor lipidomice obținute de la GPR17-selected și controale la fiecare moment ne-a permis să identificăm lipidele care au fost semnificativ afectate de GPR17. După 2 DID, nu s-au găsit modificări semnificative (datele nu sunt prezentate). După 3 DID, diacilfosfatidilcolina (PCaa) C40:4 a fost mai puțin abundentă și diacil-fosfatidiletanolaminăPEaa) C34:3 a fost mai abundentă în OPC-urile cu tăcere GPR17- (Figura 8a). După 5 zile de diferențiere, tăcere GPR17 a dus la mai multe modificări în abundența lipidelor: reducerea mai multor diacil-PC și diacil-PE și o creștere concomitentă a mai multor plasmogeni (acil alchil-PC) împreună cu sfingomielina (SM) C18:1 și SM (OH) C16:1 (Figura 8b). Aceste date indică faptul că reglarea în jos a GPR17 modifică profilul lipidic al componentei principale a mielinei ca PC și PE.

Figura 8.Modificări lipidomice induse de tăcere GPR17 în OPC. (a, b) Abundența fiecărei lipide după tăcere GPR17 a fost normalizată la cea din proba de control relativă. Modificările de pliere rezultate au fost utilizate pentru a genera un grafic vulcan pentru fiecare punct de timp (3, 5 zile în diferențiere). Punctele de peste linia orizontală punctată reprezintă metaboliții care au prezentat o schimbare semnificativă statistic (LSD-ul lui Fisher corectat prin FDR; p.adj < 0.1). În verde, lipidele cu expresie mai mică, în roșu, cele cu expresie mai mare, după tăcere GPR17. n=5 per grup.

Cere mai mult:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

MAGAZIN:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop