Asamblarea transcriptomului de Novo pe baza de ARN-Seq și descoperirea genei a tulpinii cărnoase de Cistanche Deserticola-Ⅱ

Clasificarea funcțională a tuturor transcrierilor exprimate pe baza ontologiei genetice și a bazelor de date KEGG

Adnotarea Gene Ontology (GO) a fost obținută din fișierul de adnotare și asociere a identităților UniProt. În total, 20.907 transcrieri, reprezentând 32,69% din totalul secvențelor exprimate, au fost atribuite la 1.745 de termeni funcționali. Din totalul termenilor GO funcționali, atribuirile procesului biologic au constituit majoritatea (1.116, 63,95%), urmate de componenta celulară (329, 18,85%) și funcția moleculară (300, 17,20%). Funcțiile atribuite transcriptelor exprimate au acoperit o gamă largă de categorii GO, iar primii 10 termeni GO cu cele mai adnotate transcrieri au fost enumerați în Tabelul 3. Oferim distribuția tuturor transcrierilor exprimate în trei categorii de ontologie genică (funcție moleculară, componentă celulară și proces biologic) în fișierul suplimentar (S3 Dataset). Termenii GO legați de funcțiile de legare și activitatea transferazei au fost reprezentați predominant în categoria funcției moleculare. În ceea ce privește funcțiile de legare, legarea cationilor (4.394 transcrieri) a reprezentat cea mai abundentă, urmată de legarea nucleotide/nucleozide (3.404 transcrieri în medie) și legarea proteinelor (2.422 transcrieri). În timp ce se află în grupul de activitate a transferazei, cei mai mulți sunt cei cu grupări care conțin fosfor de transfer (2.256 transcrieri, 65,77%). Din categoria componentelor celulare, transcrierile au fost localizate mai mult intracelular (10.581 transcrieri în medie), în timp ce în categoria proceselor biologice, transcrierile au fost mai implicate în procesul metabolic al biopolimerului (6.683 transcripte în medie), urmate de reglarea procesului celular (4.841 transcripte). ), expresia genei (4.678 transcrieri) și transportul (3.512 transcrieri).

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU PREVENIREA BOLII ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Pentru a extrage genele implicate în biosinteza ligninei și PhG, 21.358 de secvențe de proteine ​​potențiale neredundante au fost căutate împotriva secvențelor de gene a 13 organisme vegetale din baza de date KEGG și au fost atribuite la 275 de căi KEGG cu cel puțin 5 hit-uri. Primele 10 căi cu cele mai multe secvențe aliniate sunt enumerate în Tabelul 4. Cele mai multe căi au fost implicate în procesele metabolice primare, cum ar fi metabolismul aminoacizilor sau proteinelor (ko01230, ko04141 și ko04120), metabolismul carbohidraților (ko01200 și ko00500) sau nucleotide. metabolismul nucleozidic (ko03018, ko00230 și ko00240). În plus, există 27 de căi secundare legate de metabolism (Figura 2), cum ar fi biosinteza vertebratei terpenoide, biosinteza fenilpropanoidului, biosinteza carotenoidului, biosinteza alcaloidului izochinolin și biosinteza alcaloidului tropan, piperidină și piridină. Aceste rezultate oferă o indicație suplimentară că procesele metabolice active au fost în desfășurare înC. deserticolațesut tulpină. Toate transcrierile exprimate asociate cu căile KEGG au fost listate în fișierul suplimentar (Setul de date S4). Deși există câteva căi modificate semnificativ între C. deserticola și alte plante, cum ar fi orezul (Setul de date S5), scopul nostru principal în acest studiu este de a dezvălui întregul profil transcriptom al tulpinii de C. deserticola și de a imagina căile conexe ale biosintezei PhG. care ar putea fi utilă pentru îndrumarea cultivării.

Gene candidate care codifică enzime implicate în biosinteza ligninei

Lignina este al doilea cel mai abundent polimer terestru natural din regnul vegetal, compunând până la o treime din materialul găsit în pereții celulelor vegetale. Fiind o componentă importantă a pereților celulari, ligninele ajută la transportul apei, oferă suport mecanic și integritate structurală și apără împotriva agenților patogeni și ierbivorelor. Aceste roluri ale ligninei sunt foarte valoroase în susținerea creșterii erective subterane a C. deserticola în deșert. În acest studiu, am prezentat imaginea completă a căilor de biosinteză a ligninei în C. deserticola (Fig 3), în care monomerii de lignină sunt biosintetizați din fenilalanină printr-o serie de reacții enzimatice, inclusiv hidroxilare, metilare, reducere și proces de polimerizare oxidativă. Enzimele legate de biosinteza ligninei au fost detectate pentru trei forme sintetizate în principal în țesutul vascular (p-hidroxil-fenil (H), guaiacil (G) și siringil (S) lignină) și 5-hidroxil-guaiacil lignină care a fost identificată doar în plantele cu deficit de COMT (3-O-metiltransferaza acidului cafeic, EC 2.1.1.68) (cum ar fi knock-down).

Fenilalanina amoniac-lază (PAL, EC 4.3.1.24) este prima enzimă cheie în calea de biosinteză a ligninei (Fig 3) care transformă fenilalanina în acid cinamic prin dezaminare non-oxidativă. Un total de 6297 de citiri PAL au fost secvențiate și 7 transcrieri PAL au fost asamblate în C. deserticola (Tabelul 5). Prin compararea asemănărilor de secvență, am constatat că 4 dintre ele (comp28550_c1_seq1/2/3/5) au avut o asemănare de peste 95% cu secvența cunoscută de ARNm a C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), în timp ce comp28550_c1_seq4 și comp25940_c{0_seq1 au avut 77% și, respectiv, 82% asemănări. Predicția ORF a dezvăluit că 5 transcrieri au potențiale de codificare a proteinelor și sunt purtate cu domeniul liază de aminoacizi aromatici (PF00221.14). Dintre acestea, numai transcriptul comp28550_c1_seq4 ar putea codifica o secvență proteică completă de 718 resturi de aminoacizi. S-a raportat că PAL a fost codificat de o mică familie multigenă la majoritatea speciilor de plante, cum ar fi 4 în Arabidopsis thaliana, 5 în Populus trichocarpa, 3 în Scutellaria baicalensis și 7 Cucumis sativus etc. Analiza noastră filogenetică a sugerat că au existat 4 Genele care codifică PAL în C.

deserticola și le-am numit CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 și, respectiv, CdPAL4 (S2 Fig). 4-cumarat-CoA ligaza (4CL, EC 6.2.1.12) și trans-cinamat 4-monooxigenaza (CYP73A, EC 1.14.13.11) sunt două enzime responsabile de transformarea acidului cinamic în dicumarol-CoA în două inverse comenzi. Ele sunt, de asemenea, în coloana vertebrală, iar valorile lor de expresie FPKM sunt 39,57 și, respectiv, 51,93.

Cele patru tipuri de lignine au fost biosintetizate prin căi diferite care au fost controlate de trei enzime cheie, cinamoil-CoA reductază (CCR, EC 1.2.1.44), shikimat o-hidroxicinamoiltransferaza (HCT, EC 2.3.1.133) și ferulat{{1{ {56}}}}hidroxilază (F5H, EC 1.14.-.-). CCR a fost raportat ca punct de control al căii ligninelor [50, 51] care a catalizat X-CoA (X incluzând dicumarol, cafeoil, feruloil, 5-hidroxil-feruloil și sinapoil) în Y-aldehidă (Y inclusiv p -cougar, cafeoil, coniferil, 5-hidroxil-coniferil și snap), în timp ce HCT a catalizat p-cumaroil-CoA la acid p-cumaroil shikimic/acid p-cumaroil chinic. Cele două enzime, la fel ca un comutator, au reglat biosinteza ligninelor P-hidroxil-fenil sau a celorlalte trei tipuri de lignine. F5H a fost un alt comutator de ramură care a reglementat siringil lignina și 5-hidroxil-guaiacil lignina. Alte enzime importante, inclusiv 3-O-metiltransferaza acidului cafeic (COMT, EC 2.1.1.68), cafeoil-CoA O-metiltransferaza (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) și cinamil-alcool dehidrogenaza (CAD, EC 1.1.1.195) ) au fost de asemenea detectate exprimate. Informații detaliate despre expresie sunt enumerate în Tabelul 6. Aceste gene enzimatice identificate în acest studiu vor oferi o resursă valoroasă pentru studiile genomice funcționale în această plantă medicinală importantă. 10 gene legate de calea de biosinteză a ligninelor din tabelul 6 au fost selectate pentru verificarea RT-qPCR pentru a confirma rezultatele noastre RNAseq (Fig 4), iar corelațiile lor ridicate (coeficientul de corelație Pearson: 0,90343) au indicat acuratețe și reproductibilitate ridicată a analizei transcriptomului nostru. Setul de date S1 listează secvențele de primer utilizate în această analiză.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Gene candidate care codifică enzime implicate în biosinteza PhG

Glicozidele feniletanoide (PhGs) sunt cunoscute a fi ingredientele active primare din C. deserticola cu activități de îmbunătățire a potenței sexuale, eliminarea radicalilor liberi și anti-îmbătrânire. Trei componente chimice ale PhG sunt acidul organic, zaharida și feniletanol agliconul (Fig 3). Acizii organici, inclusiv acidul cafeic, acidul ferulic și acidul cumalic sunt produși ai căii de biosinteză a fenilpropanoidului. Componentele zaharidelor, inclusiv glucoza și ramnoza, sunt produse ale căilor de metabolism al carbohidraților, cum ar fi metabolismul amidonului și zaharozei, metabolismul zahărului amino și al nucleotidelor, metabolismul fructozei și manozei etc. Cu toate acestea, calea de biosinteză a părții feniletanol nu este încă clară. Aici, am propus două căi posibile de biosinteză a feniletanolului pe baza datelor noastre de secvență. Una este calea acidului cafeic sau a acidului ferulic, cunoscută și sub denumirea de calea acidului cinamic, care este similară cu calea vertebrală a biosintezei ligninei. Un altul se bazează pe calea metabolismului fenilalaninei (Fig 3), în care fenilalanina la feniletanol a fost obținută printr-o „cale Enrlich” cunoscută, care a fost găsită pentru prima dată în drojdie în urmă cu un secol și validată în florile de petunia, roșii și trandafir. Au fost detectate patru gene enzimatice care codifică aspartat/tirozin aminotransferaza, histidin-fosfat aminotransferaza și aminooxidaza primară care sunt responsabile pentru conversia fenilalaninei în feniletanol exprimate în tulpina de C. deserticola. Produsul feniletanolului poate fi oxidat în continuare de monooxigenază sau metilat de metiltransferază în derivații săi (feniletanol aglicon) care participă la biosinteza PhG. În rezumat, au fost propuse două căi presupuse de biosinteză ale feniletanol agliconului pentruC. deserticoladar mai am nevoie de mai multe studii în continuare.

Discuții

În ultimii ani, genomica plantelor s-a dezvoltat rapid odată cu aplicarea tehnologiei de secvențiere de ultimă generație, în timp ce puține cercetări s-au concentrat pe genomica plantelor medicinale din deșert. Este urgent necesar să se efectueze cercetări genomice sau transcriptomice pentru a înțelege adaptarea acesteia la mediile de secetă și salinitate și calea de biosinteză a componentelor bioactive majore. Descoperirea transcriptomului de novo pentru unele plante medicale,

precum Panax ginseng, Ginkgo biloba și Glycyrrhiza uralensis au fost exploatate pentru prima dată folosind platforma Roche 454 pentru lungimea sa lungă de citire. Datorită capacității eficiente de asamblare cu citiri scurte, în special citirile avantajoase cu sfârșitul pereche, secvențierea și asamblarea transcriptomului pe bază de Illumina au fost, de asemenea, utilizate pe scară largă pentru organisme model și non-model. În studiul de față, am generat aproximativ 8G de citiri împerecheate de 101 bp și am produs secvențe unigene mai lungi cu lungime medie de 725 bp. Datele de transcriptom specifice tulpinii la scară largă ar putea oferi date de referință utile și pot fi utilizate pentru a extrage metabolismul secundar al componentelor bioactive ale C. deserticola. Există 81,62% din totalul citirilor brute care au trecut filtre de calitate stricte (inclusiv tăierea adaptorului și eliminarea citirilor de calitate scăzută) înainte de asamblare, ceea ce sugerează calitatea înaltă a datelor noastre de secvențiere, iar 82,08% dintre citirile de înaltă calitate au fost utile pentru asamblare. Alte citiri care nu au putut fi utilizate pentru asamblare pot proveni din erori de secvențiere, parametri de asamblare și colab. Aceste citiri de înaltă calitate neutilizate au rămas utile în îmbunătățirea asamblarii de novo, combinate cu citiri mai lungi de pe o altă platformă (cum ar fi Roche 454) în viitor.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Un număr mare de transcrieri asamblate (30.098) au arătat asemănări mari de secvență cu genele cunoscute din bazele de date publice, sugerând că datele noastre de la capătul pereche bazate pe Illumina au acoperit o parte substanțială a transcrierilor de C. deserticola. Transcrierile fără lovituri BLAST se pot datora regiunilor netraduse 3' sau 5', ARN necodificator sau secvenţe noi de gene ale C. deserticola. Transcrierile exprimate au fost adnotate la o gamă largă de categorii GO și căi KEGG (Tabelele 3 și 4), în care multe transcrieri au fost atribuite căilor secundare legate de metabolism. După cum știm, fenilpropanoidul poate funcționa ca un compus antimicrobian inductibil cu mare beneficiu pentru un stil de viață subteran [1] și, de asemenea, poate acționa ca o moleculă semnal în interacțiunile plantă-microb pe lângă utilitatea sa medicinală [68, 69]. Terpenoidul este utilizat pentru biosinteza componentelor bioactive (cum ar fi 6- deoxicatalpol) [70]. Am descoperit că genele implicate în calea de biosinteză a coloanei vertebrale fenilpropanoide și terpenoide au fost foarte abundente în C. deserticola. Mai important, descoperirea unor căi bine reprezentate de biosinteză a ligninei (Fig 3) a indicat procesul metabolic activ al ligninei în tulpina C. deserticola. Toate genele enzimelor cunoscute implicate în biosinteza ligninei (Fig 3) au fost detectate exprimate, iar patru enzime cheie, inclusiv PAL, CCR, HCT și F5H, au avut o abundență mai mică de expresie (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 și, respectiv, 3,83) în comparație cu alte gene enzimatice (Tabelul 6). Dacă modificarea expresiei acestor trei gene ar putea influența sau nu producția de lignină în C. deserticola este demn de studiu suplimentar. PAL este o enzimă cheie în biosinteza ligninei și este, de asemenea, implicată în biosinteza fenilpropanoidului, resveratrolului, flavonoidului și cumarinei [71-74]. Am detectat patru gene PAL distincte în genomul C. deserticola (Fig S2), care a coincis cu faptul că PAL a fost codificat de o familie mică de multigene [39, 43, 45-49] și am demonstrat în continuare că poate juca roluri importante în fluxul metabolic de carbon. .

PhG este ingredientul activ principal din C. deserticola. Genele implicate în biosinteza feniletanolului sunt importante pentru calitatea C. deserticola. Am dedus două căi diferite de biosinteză ale feniletanolului și 17 gene enzimatice implicate în biosinteza PhG în tulpina C. deserticola. Posibilele procese post-acid cafeic/ferulic (Fig 3) au fost deduse, de asemenea, pentru prima dată pe baza unei formule structurale a intermediarilor și proprietăților catalitice ale enzimelor corespunzătoare, în care acidul cafeic/ferulic ar fi mai întâi oxidat în derivat de fenilpiruvat; apoi, gruparea carboxil a fost lipsită de decarboxilaze; în cele din urmă, gruparea aldehidă a fost transformată înapoi în grupă alcool prin dehidrogenază. Aceasta este prima aplicație a tehnologiei de secvențiere a sfârșitului pereche Illumina pentru a investiga întregul transcriptom al C. deserticola și pentru a asambla citirile ARN-seq fără un genom de referință. Acest studiu va oferi resurse utile și secvențe de gene pentru genomica funcțională și cercetarea proteomică pe C. deserticola în viitor.

Concluzii

În acest studiu, am analizat transcriptomul tulpinii C. deserticola pe baza datelor de secvențiere de mare performanță, am identificat gene implicate în căile de biosinteză ale ligninei și, de asemenea, am dedus pentru prima dată potențiala cale de biosinteză a PhGs, ceea ce va accelera cu siguranță înțelegerea. a proceselor fiziologice ambigue și marea valoare medicinală la nivel molecular. Până în prezent, aceasta este prima încercare de a asambla de novo întregul transcriptom al tulpinii C. deserticola și de a detecta calea de biosinteză a componentelor medicinale folosind seturi de date de secvențiere bazate pe Illumina. Studiul nostru poate promova dezvoltarea medicamentelor naturale și selecția soiurilor cu trăsături medicinale.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%