Citotoxicitatea selectivă a substanței vegetale acteozide împotriva celulelor tumorale și perspectivele sale mecanice
Mar 14, 2022
Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Christina Cheimonidi și colab
ABSTRACT
Produsele naturale se caracterizează printr-o diversitate structurală extremă și, prin urmare, oferă o sursă unică pentru identificarea agenților antitumorali noi. Aici, raportăm că substanța din planteacteozidfiind izolat prin metode fitochimice avansate din frunzele de Lippia citriodora a arătat o citotoxicitate sporită împotriva celulelor tumorale metastatice; a acționat în sinergie cu diverși agenți citotoxici și a sensibilizat celulele canceroase chimiorezistente.Acteozidnu a fost toxic în contexte celulare fiziologice, în timp ce a crescut încărcarea oxidativă, a afectat activitatea modulelor proteostatice și a suprimat metaloproteinazele matriceale din liniile celulare tumorale. Administrarea intraperitoneală sau orală (prin apă de băut) de actozidă într-un model de șoarece cu melanom a reglat răspunsurile antioxidante în tumori; totuși, numai administrarea intraperitoneală a suprimat creșterea tumorii și a indus răspunsuri imune anti-tumorale reactive. Analizele de identificare/cuantificare prin spectrometrie de masă au arătat că livrarea intraperitoneală aacteozida dus la o concentrație semnificativ mai mare, comparativ cu administrarea orală, a compusului în plasma și tumorile șoarecilor tratați, sugerând că efectul său antitumoral in vivo depinde de calea de administrare și de concentrația atinsă în tumoră. În cele din urmă, studiile de modelare moleculară și testele activității enzimatice au arătat căacteozidinhibă protein kinaza C. În mod concludent, acteozidul este promițător ca o schelă chimică pentru dezvoltarea de noi agenți anti-tumorali.
Cuvinte cheie:Acteozid, Cancer, Compus natural, Stres oxidativ, Proteostază, Imunomodulare
1. Introducere
Carcinogeneza este caracterizată prin dereglarea mai multor căi de semnalizare celulară și este asociată cu creșterea stresului celular oxidativ, replicativ, metabolic, genotoxic și proteotoxic [1]. Pentru a se adapta și a depăși aceste fenotipuri de stres, celulele maligne reglează în sens pozitiv (în afară de oncogene) mai multe căi non-oncogene care urmăresc fie suprimarea, fie (cel puțin) atenuarea stresului în curs. Printre diferitele căi non-oncogene găsite a fi frecvent reglate în timpul tumorigenezei se numără modulele rețelei de proteostază (PN) împreună cu răspunsurile antioxidante celulare [2,3].
Componentele cheie ale PN sunt cele două mașini principale de degradare, și anume calea Autofagie-Lizozom (ALP) și Calea Ubiquitin-Proteazom (UPP), împreună cu rețeaua de chaperone moleculare celulare. ALP este implicat în principal în degradarea agregatelor de proteine și a organelelor deteriorate [4], în timp ce UPP degradează proteinele normale cu viață scurtă și proteinele nereparabile pliate sau desfăcute [5-8]. Proteazomul 26Seucariotic este constituit din particulele reglatoare 19S (RP) și particulele 20 Score (CP); acesta din urmă este format din patru inele heptamerice stivuite (două de tip înconjurând două de tip) care formează o structură asemănătoare butoiului. Activitățile peptidazei asemănătoare chimotripsinei (CT-L), asemănătoare tripsinei (TL) și asemănătoare caspazei (CL) sunt localizate la 5, 2 și, respectiv, 1 subunități proteazomale [6]. Eficacitatea clinică demonstrată a inhibitorilor de proteazom Bortezomib (Velcade®; denumit și PS-341) și Carfifilzomib împotriva diferitelor afecțiuni hematologice maligne [9] a oferit „dovada de concept” a țintirii UPP ca strategie promițătoare pentru tratamentul cancerului. Rețeaua complexă de căi de apărare antioxidantă celulară care este frecvent reglată în creștere în timpul carcinogenezei [3,10] include enzime antioxidante, precum și mai mulți factori de transcripție care mobilizează răspunsurile genomice citoprotective; acestea includ cutia cu furcă O (Foxo) și factorul eritroid 2-factor asociat (Nrf-2). Nrf-2 este esențial în protecția celulelor împotriva daunelor oxidative și/sau xenobiotice, deoarece stimulează expresia genelor antioxidante și de fază II [11-13].
Noi și alții am propus recent că țintirea acestor dependențe tumorale (adică modulele proteostatice și/sau căile de răspuns antioxidant) sau creșterea nivelurilor celulare de ROS în contextul unui genotip transformat oferă o potențială fereastră terapeutică pentru uciderea selectivă a celulelor tumorale [3] ,14]; în sprijin, a fost raportată uciderea selectivă a celulelor canceroase de către o moleculă mică care a reglat în creștere nivelurile celulare de ROS [2]. Este de așteptat ca abordările combinatorii, inclusiv activarea răspunsurilor imune anti-tumorale reactive [15], probabil să maximizeze fereastra terapeutică oferită prin inhibarea răspunsurilor PN și antioxidante și/sau prin creșterea nivelurilor celulare de ROS.
Produsele naturale (extracte sau compuși puri) (NP) din diverse surse (plante, organisme marine, microorganisme etc.) sunt analizate pentru capacitatea lor de a acționa ca agenți antitumorali datorită diversității lor extreme structurale și complexității chimice, precum și pentru că acţionează pleiotropic modulând mai multe căi de semnalizare celulară [16]. Se pare că NP activează răspunsuri antiinflamatorii, antitumorale și/sau antimetastatice [16,17] și, de asemenea, eludează rezistența la mai multe medicamente [18,19]. Printre aceștia, compușii fenolici (inclusiv glicozide feniletanoide) au atras un interes semnificativ datorită rolului lor raportat în prevenirea și/sau tratamentul diferitelor boli umane.
Acteozida, numită și utilizare sau verbascozidă [20], este o glicozidă feniletanoidă izolată din multe dicotiledonate. Se pare că actozidul exercită unele activități biologice interesante, inclusiv proprietăți antioxidante, antiinflamatorii și de reglare a apoptozei celulare [21,22]. Cu toate acestea, activitatea sa potențială antitumorală nu a fost abordată. Raportăm aici că actozidul a arătat o citotoxicitate crescută împotriva celulelor canceroase de mamifere, fără efecte toxice aparente în contexte celulare fiziologice. În plus, actozidul a suprimat creșterea tumorii melanomului în modelul de șoarece Vivo, prin (printre altele) activarea răspunsurilor imune anti-tumorale reactive.
2. Materiale și metode
2.1. Material vegetal și extracție
frunze uscate de Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 kg) au fost achiziționate de pe piața locală din Atena, Grecia. Frunzele au fost pulverizate și extrase prin agitare mecanică timp de 12 ore cu metanol (2 × 20 L). Extractul metanolic a fost evaporat la sec şi spălat cu un amestec de CH2CI2/MeOH 98/2 (15 L). Reziduul insolubil a fost separat și uscat, producând o pulbere verde-galben (450 g).
2.2. Purificarea actozidei și analiza UPLC-HRMS
O porţiune (10 g) din reziduul menţionat mai sus a fost supusă cromatografiei în contracurent utilizând un aparat de cromatografie rapidă cu partiţie centrifugă (FCPC) (Kromaton, Franţa); un amestec de EtOAc/EtOH/H20 în raport 5/0,5/4,5 a fost utilizat ca sistem de solvent bifazic. Fracțiile colectate au fost supuse cromatografiei în strat subțire; apoi cromatogramele au fost observate sub o lampă UV (254 și 365 nm) și vizualizate prin pulverizare cu metanol sulfat de vanilină urmată de încălzire timp de două minute. Un total de 2,1 g de actozidă (puritate mai mare sau egală cu 90 la sută) au fost izolate prin procedeul menționat mai sus. Identificarea actozidei a fost efectuată prin spectre de rezonanță magnetică nucleară (RMN) și spectrometrie de masă (MS), în timp ce puritatea sa a fost stabilită prin analiza UPLC-MS și RMN; pentru detalii vezi Suppl. Materiale și metode.
2.3. Linii telefonice
Fibroblastele embrionare pulmonare umane (celule IMR90) împreună cu liniile celulare de șoarece B16.F1, B16.F10, YAC-1 și WEHI-164 au fost obținute din American Tissue Culture Collection (ATCC). Liniile de celule de osteosarcom uman U2 OS și Sa OS au fost donate cu amabilitate de Prof. V. Gorgoulis (Școala de Medicină, Universitatea Națională și Kapodistriană din Atena, Grecia), în timp ce celulele de osteosarcom KH OS și liniile de celule de osteosarcom chimiorezistent [23] au fost o donație a Dr. E. Gonos (Fundația Națională de Cercetare Elenă, Grecia). Liniile de celule canceroase de șoarece C5N și A5 aparțin unui model de carcinogeneză a pielii de șoarece în mai multe etape [24,25] și au fost donate de Prof. A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, Universitatea California, SUA). Condițiile de cultură ale liniilor celulare utilizate sunt raportate în Suppl. Materiale și metode.
beneficiul decistanche acteoside
2.4. Model de șoarece melanom masculin
Șoarecii C57BL/6 (25–30 g greutate, vârsta de 6–8 săptămâni) au fost obținuți de la Institutul Elen Pasteur și găzduiți la temperatură controlată (22 grade) și fotoperioadă (12 ore lumină: 12 ore întuneric). ) cu acces gratuit la apă și hrană. Șoarecii au fost inoculați subcutanat cu 105 celule de melanom B16.F1 (în 100 μL PBS) și au fost repartizați aleatoriu în 3 grupuri (n=5/grup). Când tumorile au devenit palpabile (ziua 11) șoarecii au primit acteozidă pe două căi; fie intraperitoneal (IP) (1 mg/șoarece diluat în 200 μL PBS; în total 6 doze administrate la două zile) sau pe cale orală prin apă de băut (OR) (2,5 mg/șoarece; în total 13 doze timp de 13 zile consecutive). Șoarecilor martor li s-a administrat PBS. Creșterea tumorii a fost înregistrată la fiecare 2 zile prin măsurarea axelor majore și minore ale tumorilor formate cu un șubler digital. Măsurătorile au fost transformate în volumul tumorii utilizând formula: volumul tumorii (cm3)=axa majoră × axa minoră2 × 0,5. În ziua 28, animalele au fost eutanasiate prin luxație cervicală, iar splinele au fost îndepărtate aseptic. Experimentul a fost repetat de trei ori cu rezultate similare.
Splenocitele au fost izolate din spline omogenizate individual și testate imediat pentru citotoxicitatea lor față de țintele celulelor B16.F1, YAC-1 și WEHI-164. Citotoxicitatea a fost evaluată pe baza detectării expunerii la CD107 pe suprafața celulei, ca rezultat al degranulării celulelor efectoare. Splenocitele (105 celule/godeu) au fost co-cultivate cu ținte în microplăci cu fundul 96-godeu U la un raport efector-țintă (E:T) de 100:1, la 37 de grade în 5% CO2. În fiecare godeu s-au adăugat anticorpi monoclonali anti-CD107a și anti-CD107b conjugați cu FITC (25 μL/mL) și monensin (6 μL/mL; toate de la BD Biosciences). Celulele au fost recoltate 6 ore mai târziu și analizate folosind un citometru de flux FACSCanto II. În paralel, tumorile au fost excizate și procesate pentru teste în aval, așa cum este descris în Suppl. Materiale și metode.
cistanche acteoside
