Stabilizarea simultană a citoscheletului de actină în mai multe celule specifice nefronului protejează rinichiul de diverse leziuni

Boli cronice de rinichișileziuni renale acutesunt mecanicboli de rinichi distincte. În timp ce bolile cronice de rinichi sunt asociate culezarea podocitelor, leziuni renale acuteafectează celulele epiteliale tubulare renale. În ciuda acestor diferențe,o trăsătură cardinalădin ambeleboli renale acute și croniceeste citoscheletul de actină dereglat. Noi am arătat căactivarea farmacologică a GTPazei dinamineiameliorează leziunea podocitelor înmodele murine de boli renale cronicedepromovarea polimerizării actinei. Aici stabilim rolul dinaminei în modularea rigidității și polaritățiicelulele epiteliale tubulare renaleprin reticularea filamentelor de actină în rețele ramificate. Activarea capacității de reticulare a dinaminei de către un agonist de moleculă mică stabilizează cortexul de actomiozină al membranei apicale împotriva leziunilor, care la rândul lorpăstrează funcția renalăîn diferite modele murine de leziune renală acută. În special, un agonist dinamină atenuează simultan podocitul șileziune tubularăîn modelul genetic murin al sindromului Alport. Studiul nostru oferă dovezi pentru fezabilitate și evidențiazăbeneficiile noilor terapii holistice de protecție a nefronilor.

CLICK AICI PENTRU A CUNOAȘTI O FORMULAȚIE PE IERBE DE CISTANCHE BUNĂ LA LEZIUNEA RENALE ACUTĂ

Theprincipalele cauze ale leziunilor renale acute(AKI) suntischemie, hipoxie, saunefrotoxicitate1. Deși poate fi inversată, AKI reprezintă o problemă semnificativă de asistență medicală, cu mortalitate ridicată și fără tratament definitiv. Indiferent de etiologia sa, AKI lezează în primul rând celulele epiteliale polarizate ale tubilor renali ale căror microvilozități apicale formează marginea periei tubulare care participă la coordonarea transportului esențial de electroliți și apă2. O caracteristică morfologică timpurie a AKI este pierderea marginii periei și a polarității celulare din cauza defalcării cortexului de actomiozină la nivelul membranei apicale1.

Stabilirea și menținerea polarității celulare implică cascade de semnalizare, trafic de membrană și dinamică citoscheletică, toate fiind foarte coordonate3. Organizarea membranei apicale este determinată în mare măsură de arhitectura rețelelor de actomiozină4, care stabilește rigiditatea cortexului, facilitând astfel gruparea proteinelor de polaritate. În timp ce motoarele miozinei II sunt considerate generatorul primar al rigidității corticale5,6, arhitectura cortexului de actomiozină este stabilită de o multitudine de proteine ​​care leagă actina (ABP)7.

În plus față de ABP-urile cunoscute, marginea perie a tubilor renali este foarte îmbogățită în dinamină8, o GTPază cunoscută cel mai bine pentru rolul său în endocitoză9. Dinamina are o tendință intrinsecă de a se asambla în mai multe stări de oligomerizare, cum ar fi dimeri, tetrameri, inele și spirale9. Am identificat pentru prima dată interacțiuni directe dinamină-actină10 și am arătat că oligomerizarea dinaminei reglează polimerizarea actinei în podocite11,12, celule specializate esențiale pentru selectivitatea filtrului renal. Folosind modele murine de CKD, am arătat că activarea polimerizării actinei dependente de dinamină inversează leziunea podocitelor prin restabilirea structurii și funcției lor unice12.

Aici arătăm că încelulele epiteliale tubulare renale, dinamina leagă actina filamentoasă (F-actina) în rețele ramificate. Capacitatea de reticulare a dinamicii este definită de starea sa de oligomerizare și lungimea actinei F. Activarea farmacologică a oligomerizării dinaminei contracarează AKI prin stabilizarea rețelelor de actină și astfel integritatea celulelor, care protejează parțial celulele epiteliale renale de leziunile induse de stresul oxidativ. Studiul nostru identifică cortexul de actomiozină al membranei apicale a celulei tubulare renale ca o țintă medicamentabilă în AKI prin dinamină ca proxy

Rezultate Oligomerizarea cu dinamică stabilește rigiditatea și morfologia membranei apicale.

Pentru a examina rolul interacțiunilor dinamină-actină în celulele epiteliale tubulare renale polarizate, am folosit Bis-T-23, un activator alosteric al oligomerizării dinaminei dependente de actină într-un sistem reconstituit13, în celule11,13 și în întregul organism12. Fenotipurile celulare au fost evaluate în celulele Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) urmând starea actinei F și modelul de colorare al unei proteine ​​de joncțiune strânsă zonula occludens-1 (ZO-1), care este considerat un biomarker al polarității celulare. Citocalasina D (CytoD) și latrunculina A (LatA), inhibitori cunoscuți ai polimerizării actinei, au scăzut nivelurile de F-actină și au indus colorarea discontinuă ZO-1 (Fig. 1a suplimentară). În schimb, Bis-T-23 a indus o creștere ușoară a nivelurilor de F-actină fără niciun efect asupra colorării ZO-1. Adăugarea Bis-T-23 înainte, dar nu după LatA, a păstrat parțial nivelurile de F-actină și polaritatea celulei. Nici vehiculul DMSO, nici inhibitorul de dinamină dynole14 nu au prezentat niciun efect (Figura suplimentară 1a).

Microscopia electronică cu scanare (SEM) ne-a permis să vizualizăm modificările induse de medicamente ale morfologiei celulei concentrându-se pe membrana apicală (Fig. 1a). Înălțimea medie a celulei MDCK a fost de 11 ± 2 µm, iar lungimea medie a microvilozităților a fost de 0,63 ± 0,2 µm (Tabelul 1), care se află în intervalul observat în rinichi15. LatA a scăzut înălțimea celulei și lungimea microvilozităților și a mutat microvilozitățile distribuite uniform în grupuri, în timp ce Bis-T-23 a indus efectele opuse (Tabelul 1, Fig. 1a). Când a fost adăugat înainte de LatA, Bis-T-23 a păstrat parțial înălțimea celulei și lungimea microvililor. Deoarece microvilozitățile prezintă un control rafinat al lungimii definit de actina corticală la baza lor16, aceste date oferă dovezi că Bis-T-23 a modificat cortexul de actomiozină la nivelul membranei apicale.

Pentru a determina efectul exact pe care l-a avut Bis-T-23 asupra actinei corticale, am vizualizat cortexul de actomiozină din lamellipodia utilizând microscopia electronică cu replica de platină (PR-EM). LatA a scăzut densitatea rețelelor de actină, iar acest efect a fost parțial abrogat prin adăugarea de Bis-T -23 înainte de LatA (Fig. 1b). Deoarece LatA accelerează depolimerizarea filamentului de actină prin sechestrarea monomerilor de actină, am examinat în continuare dacă conservarea observată a cortexului de actomiozină de către Bis-T-23 sa datorat efectului său pozitiv asupra polimerizării actinei. Spre deosebire de stimularea puternică a polimerizării actinei observată în extractele de celule podocite10,11, Bis-T-23 a crescut doar marginal polimerizarea actinei în extractul de celule MDCK (Fig. 1b suplimentară). În mod similar, imunodepleția dinaminei endogene -2 (Dyn2) din extract sau inhibarea activității sale GTPazei de către dinod a dus la o deteriorare marginală a polimerizării actinei (Figura suplimentară 1c). În timp ce LatA și CytoD au afectat semnificativ polimerizarea actinei, adăugarea de Bis-T -23 înainte de LatA sau CytoD nu a reușit să depășească efectele lor inhibitoare (Figura suplimentară 1d, e). Jasplakinolida, un medicament care induce polimerizarea actinei prin stimularea nucleării filamentului de actină17, nu a crescut semnificativ nivelul general de polimerizare (Figura suplimentară 1d), sugerând că lizatul de celule MDCK prezintă un nivel aproape maxim de actină polimerizată. Împreună, aceste date au indicat că efectele Bis-T-23 asupra morfologiei membranei apicale în celulele MDCK au fost determinate de un alt mecanism decât polimerizarea actinei.

Având în vedere cunoștințele comune despre localizarea îmbogățită a Dyn2 și F-actinei la marginea perie a celulelor epiteliale renale8 și rolul dinaminei în endocitoză, am investigat în continuare dacă Bis-T-23 afectează actina indirect prin modificări ale endocitozei. După cum era de așteptat, atât Dyn2, cât și F-actina s-au co-localizat la cortexul de actomiozină de sub membrana apicală, în microvilozități și la gropile acoperite cu clatrină (CCP), definite prin forma și dimensiunea lor distinctă (Figura 1f suplimentară). Am examinat dinamica CCP-urilor utilizând microscopie cu fluorescență cu reflexie internă totală (TIRF)18,19. Bis-T-23, chiar și la cea mai mare concentrație, nu a avut niciun efect asupra distribuției duratelor de viață ale CCP, în timp ce dinolul a scăzut numărul de CCP productive (Figura suplimentară 1g). Această lipsă de corelație între nivelul de endocitoză și modificările morfologiei celulare afirmă că Bis-T- 23 vizează actina corticală fără a influența rolul dinaminei în endocitoză.

Deoarece polaritatea celulelor renale este menținută de arhitectura și contracția susținută a rețelelor de actomiozină, care stabilește rigiditatea celulei la nivelul membranei apicale20, am măsurat apoi rigiditatea celulei folosind microscopia cu forță atomică (AFM). Sistemul Nanowizard IV și software-ul de analiză JPK au fost utilizate pentru a determina modificările în modulul Young21 în diferite setări experimentale (Figura suplimentară 2a). Tratamentul cu LatA a dus la o scădere semnificativă a rigidității de contact celulă-celulă și a rigidității celulelor apicale în celulele MDCK (Fig. 1c-e). În schimb, Bis-T-23 a crescut semnificativ rigiditatea celulei în comparație cu vehiculul DMSO (Fig. 1c–e), în concordanță cu efectele sale pozitive asupra înălțimii celulei, numărului de microvilozități și densității rețelelor de actină (Tabelul 1 și Fig. 1b)22. Adăugarea de Bis-T-23 înainte de LatA a redus puternic efectul negativ al LatA asupra rigidității celulelor (Fig. 1c–e), în conformitate cu efectul pozitiv al Bis-T{-23 asupra rețelelor de actină și morfologia celulelor apicale (Tabelul 1, Fig. 1b).

Fig. 1 Oligomerizarea dinaminei definește rigiditatea celulei prin influențarea arhitecturii actinei în celulele epiteliale renale. a Imagini SEM reprezentative ale celulelor MDCK tratate cu DMSO (0,1%) sau Bis-T-23 (30 µM, 0,1% DMSO) pentru 1 0 min înainte de adăugarea DMSO (0,1%) sau LatA (0,2 µM, 0,1% DMSO) pentru 2{{23} } min. Imaginile mărite ale inserțiilor (regiuni cu casete portocalii) arată aranjamentul, distribuția și densitatea microvilozităților la nivelul membranei apicale. b Imagini PR-EM reprezentative ale celulelor MDCK tratate așa cum este explicat în (a). Imaginile arată modificări în organizarea cortexului de actomiozină în celulele MDCK în condițiile indicate. c Imagini reprezentative ale hărților cu modulul Young ale celulelor MDCK tratate așa cum este explicat în (a). d, e Grafice cu bare reprezentând modulul Young care ilustrează rigiditatea celulei măsurată la joncțiunea celulă-celulă (d) sau la nivelul membranei apicale (e). Fiecare simbol reprezintă rigiditatea medie a unei singure celule. Rezultatele prezentate în d, e au fost generate din cel puțin 10 celule din cel puțin trei plăci de cultură. Bare de eroare, medie ± SD (*P mai mică sau egală cu 0,05, **P mai mică sau egală cu 0,01, ***P mai mică sau egală cu 0,001, ****P mai mică sau egală cu 0,0001, nepereche testul t cu două cozi). ns, nu este semnificativ.

De asemenea, am determinat rigiditatea celulei folosind sistemul BioScope II ca o abordare experimentală alternativă pentru AFM. În acest caz, curbele de indentare a forței au fost obținute după modelul lui Discher și colegii de muncă calculat cu software-ul Matlab23. Tendințe similare în ceea ce privește rigiditatea celulelor au fost înregistrate pentru interacțiunea dintre LatA și Bis-T -23 (Fig. 2b, 2c suplimentare). În plus, dynode nu a prezentat niciun efect asupra rigidității celulelor, în timp ce CytoD a scăzut semnificativ rigiditatea celulei (Fig. 2d, e suplimentară), în conformitate cu fenotipurile lor de actină (Fig. 1a suplimentară). Împreună, aceste date stabilesc corelația dintre starea cortexului de actomiozină, rigiditatea celulei, morfologia membranei apicale și polaritatea celulei. Aceste descoperiri demonstrează, de asemenea, în mod convingător rolul oligomerizării dinaminei în definirea parametrilor mecanici ai polarității celulelor epiteliale prin efectul său asupra cortexului de actomiozină.

Dinamina leagă filamentele de actină în rețele ramificate care stau la baza polarității celulare. Pentru a elucida mecanismul molecular prin care oligomerizarea dinaminei influențează arhitectura cortexului de actomiozină, am examinat în continuare efectul dinaminei asupra filamentelor de actină într-un sistem reconstituit. Pe baza ipotezei actuale, lungimea filamentelor de actină definește modul lor de reticulare6. Deoarece lungimea medie a filamentelor de actină corticale într-o rețea de la marginea anterioară este între 100 și 150 nm24, am examinat efectele dinaminei asupra organizării filamentelor mai scurte generate prin acoperirea F-actină cu gelsolină (Gsn-actin) (Fig. 2a). Adăugarea lui Dyn2 a dus la formarea de rețele mari, ramificate (Fig. 2b, c). Pe baza dimensiunilor și formelor Dyn2 recombinant (Fig. 2d), rețelele au fost formate predominant din dimeri Dyn2 (Dyn2DIMER) și tetrameri (Dyn2TETRA) care au interacționat cu mai multe filamente de actină (Fig. 2e): Dyn2DIMER legat la două filamente, Dyn2TETRA a legat până la patru filamente, iar Dyn2RING a legat până la șase filamente. Mărirea scăzută a imaginilor a arătat că rețelele dependente de dinamină formează un model de forme mai mici și mai mari asemănătoare inelului (Fig. 2c).

Pentru a corela observațiile din sistemul reconstituit cu rolul dinaminei în celule, am determinat apoi localizarea Dyn2 endogen pe rețelele de actină corticale folosind un anticorp monoclonal anti-Dyn2 urmat de un anticorp secundar conjugat cu aur (Figura 3a-c suplimentară). După cum se vede în sistemul reconstituit, dinamina este asociată cu un număr distinct de F-actină în cadrul rețelelor ramificate (Fig. 2f). Împreună, aceste date identifică o activitate nouă a dinaminei, adică reticulare F-actina în rețele ramificate.

Pentru a corela capacitatea de reticulare a dinaminei și efectul protector al Bis-T-23 asupra cortexului de actomiozină și morfologia membranei apicale, am examinat apoi efectele Bis-T-23 asupra mediate de dinamină. reţele în sisteme reconstituite (Fig. 3a). Pe baza diagramelor de contur, care oferă reprezentări topografice ale densităților de filament variabile, Bis T-23 a crescut densitatea globală a rețelei (Fig. 3a), ceea ce ar putea fi explicat prin creșterea numărului de F-actină legată de dinamină datorită creşterea oligomerizării sale. În plus, dinamina a reticulat mai puternic filamentele mai scurte decât F-actina lungă (Fig. 3a-c), sugerând că capacitatea dinaminei de a forma rețele ramificate este definită de starea sa de oligomerizare și de lungimea filamentelor de actină. Capacitatea de a lega filamentele de actină în rețele a fost împărtășită de două izoforme de dinamină, Dyn2 exprimată omniprezent și dinamina specifică neuronului-1 (Dyn1) (Fig. 3b, c).

Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Magazin:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop