SLC37A2, o moleculă legată de fosfor crește în celulele musculare netede din aorma calcifiată

Calcificarea vascularăeste o sursă majoră deboala cardiovascularala pacienţii cu boală cronică de rinichi.Hiperfosfatemiaduce la creșterea afluxului de fosfor intracelular, ceea ce duce la o creștere a celulelor asemănătoare osteoblastelor din celulele musculare netede vasculare. PiT-1 tranzitează fosfatul în celulele musculare netede vasculare. Cu toate acestea, mecanismul calcificării vasculare nu este complet înțeles. Acest studiu a investigat molecule candidate legate de fosfor, altele decât PiT-1. Am emis ipoteza că moleculele legate de fosfor aparținânddizolvat-purtătorsuperfamilia (SLC) ar fi implicată în calcificarea vasculară. Ca rezultat al analizei cu microarray ADN, ne-am concentrat pe SLC37A2 și am arătat că expresia ARNm a acestor celule a crescut pe celulele musculare netede aortice calcificate (AoSMC). S-a raportat că SLC37A2 transportă atât schimburile glucoză-6-fosfat/fosfat, cât și fosfat/fosfat. Analiza in vitro a arătat că expresia SLC37A2 nu a fost afectată de inflamație pe AoSMC. Expresia ARNm și a proteinei SLC37A2 a crescut în AoSMC calcificat. In vivo, analiza a arătat că expresia ARNm SLC37A2 în aortaboală cronică de rinichișobolanii a fost corelat cu genele marker osteogene. În plus, SLC37A2 a fost exprimat în zona de calcificare vasculară înșobolani cu boală cronică de rinichi. Ca rezultat, am arătat că SLC37A2 este una dintre moleculele care cresc cucalcificare vascularăin vitro si in vivo.

Cuvinte cheie: SLC37A2,calcificare vasculară, celulele musculare netede aortice,boală cronică de rinichi, hiperfosfatemie

CLICK AICI PENTRU A OBȚINE EXTRACT DE CISTANCHE ORGANIC NATURAL CU 25% ECHINACOSIDE ȘI 9% ACTEOSIDE PENTRU FUNCȚIA RENICALE

Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Ca număr de pacienţi cuboală cronică de rinichi(CKD) crește, numărul de pacienținecesitand dializava crește de asemenea. Cele mai multe decese la pacienţii supuşidializăse datoreazăboli cardiovascularecainfarct, tulburări cerebrovasculare, sau infarct miocardic. (,2) O sursă majoră deboala cardiovascularaeste calcificarea ectopică,() o anomalie cauzată de formarea și depunerea cristalelor de fosfat de calciu în țesuturile moi. (4 6) Diverși factori, cum ar fi inflamația. stresul oxidativ și creșterea nivelurilor plasmatice de calciu (Ca) și fosfor (P) sunt implicate în progresia calcificării vasculare. Dintre acești factori, hiperfosfatemia este cel mai puternic asociată cu calcificarea vasculară. (7.8) Hiperfosfatemia este cauzată de aportul excesiv de P în prezența funcției renale scăzute. Prin urmare, pacienții care fac dializă trebuie să limiteze aportul de P. (79-12) Cu toate acestea, s-a raportat căcalcificare vascularăprogresează deja când se începe dializa; a fost observată și la pacienții cu BRC în stadiu incipient când hiperfosfatemia nu este evidentă. (3) În consecință, este important să se prevină calcificarea vasculară la pacienții cu IRC în stadiu incipient pentru a îmbunătăți prognosticul de viață.

ceea ce duce la un aflux crescut de P în celulele musculare netede vasculare (VSMC). Influxul P este realizat prin PiT-1, un transportor de pe suprafața membranei celulare a VSMC. PiT- este un membru al superfamiliei de purtători de solute (SLC), care include un transportor de fosfat de sodiu codificat de SLC20A1.04 PiT- transportă fosfatul prin membranele celulare dependente de Na și, ulterior, mineralizarea matricei datorită nivelurilor ridicate de p.s) Ca intracelular Nivelurile P cresc, VSMC începe să exprime factori de transcripție osteogenici, cum ar fi factorul de transcripție 2(Runx2)(16) legat de runt (16) Acest efect este urmat de expresia crescută a genelor specifice osteoblastului, cum ar fi osteopontina și osteocalcina. În plus, a redus expresia proteinelor specifice mușchilor netezi. cum ar fi proteina musculară netedă 22-0 (SM{22-0), apare. Ca rezultat, VSMC este transformată în celule asemănătoare osteoblastelor. (1718) Studii clinice recente au arătat că nivelurile sanguine de calciu. particulele proteice (CPP), care reprezintă particule coloidale de fosfat de calciu, cresc odată cu scăderea funcției renale. (19-21) În plus, au fost raportate corelații cu CPP și nivelurile de P din sânge.2o2i) Este posibil ca CpP să declanșeze progresia calcificării vasculare.22-24)

Cu toate acestea, calcificarea vasculară a fost observată la pacienții cu IRC în stadiu incipient, cu niveluri plasmatice normale de P. (13) În plus. ARNm PiT-1 este exprimat omniprezent în toate țesuturile. Astfel, o altă moleculă poate acţiona în primul rând în zona calcifierii vasculare. Există rapoarte căinflamaţiefavorizează calcificarea vasculară. Factorii inflamatori precum interleukina (IL)-1B, IL-6 și factorul de necroză tumorală alfa (TNF-a) au indus diferențierea VSMC în celule asemănătoare osteoblastelor (2s26) TNF-a induce calcificarea vasculară prin calea cAMP, care joacă un rol în diferențierea osteoblastelor.2728) IL-6 reglează diferite căi care conduc la calcificarea vasculară a VSMC2-31) În plus. IllB, IL-6 și TNF-a sunt, de asemenea, factori asociați cu creșterea calcificării vasculare indusă de niveluri ridicate de p.3233) Totuși. datele actuale nu explică pe deplin mecanismul vascular

calcificarea indusă de aceşti factori. Am emis ipoteza că ar putea exista și alte molecule legate de P, cum ar fi cele din superfamilia SLC, implicate în calcificarea vasculară. Ne-am concentrat pe proteinele membranare din superfamilia SLC și am investigat moleculele potențiale candidate legate de P, altele decât PiT-1, pentru implicarea în calcificarea vasculară. În plus, am examinat relația dintre moleculele candidate și calcificarea vasculară în video și in vivo.

Materiale și metode

Cultură de celule. Celulele normale ale mușchilor neted uman (AoSMC) au fost obținute de la Lonza (Basel, Elveția) AoSMC a fost cultivată conform instrucțiunilor producătorului. AoSMC au fost menținute într-un mediu de creștere (mediu bazal de celule musculare netede suplimentat cu 5% ser fetal bovin (FBS), factor de creștere epidermică, insulină, factor de creștere a fibroblastelor-B și gentamicină/amfotericină-B). Mass-media au fost schimbate o dată la două zile. AoSMC au fost crescute într-un incubator umidificat cu 5% CO la 37 de grade și menținute până la confluență și apoi utilizate în experimente.

AoSMC calcificat. Calcificarea AoSMC a fost indusă așa cum s-a descris anterior.435) AOSMC au fost cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco suplimentat cu 15% FBS și penicilină-streptomicină și cultivate cu 2,6 mM P timp de 3, 6, 9, 12 și 14 zile. Concentrația de P a fost ajustată de tamponul PNaH, PO/Na și HPO. pH 7,2). Alte AoSMC nu au fost cultivate cu 2,6 mM P.

micromatrice ADN. S-a utilizat ARN total al probelor de AoSMC cultivate și necultivate cu 2,6 mM P. ARN total 5.0 ug a fost analizat folosind un microarray ADN (Agilent Technologies, Tokyo. Japonia). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray a fost folosit pentru a examina aproximativ 26,000 gene. Raportul a fost calculat prin împărțirea nivelului de expresie al AoSMC cultivat cu 2,6 mM timp de 12 zile la nivelul de expresie al AoSMC necultivat cu 2,6 mM P

micromatrice ADN

S-a utilizat ARN total al probelor de AoSMC cultivate și necultivate cu 2,6 mM P. ARN total 5.0 ug a fost analizat folosind un microarray ADN (Agilent Technologies, Tokyo. Japonia). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray a fost folosit pentru a examina aproximativ 26,000 gene. Raportul a fost calculat prin împărțirea nivelului de expresie pe AoSMC cultivat cu 2,6 mM timp de 12 zile la nivelul de expresie pe AoSMC necultivat cu 2,6 mM P. Exprimarea SLC37A2 în inflamația vasculară. Pentru a induce un răspuns inflamator în AoSMC, celulele au fost cultivate cu mediu de creștere până când au ajuns la confluență și apoi tratate cu 1 ugmL lipopolizaharide (LPS) (LPS din Escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) timp de 24 și 72 fără 2,6 mM P. Alte AoSMC nu au fost cultivate cu analiza în timp real a reacției în lanț a polimerazei (PCR). ARN-ul total a fost extras din AoSMC tratat cu LPS timp de 24 și 72 de ore și din celule netratate cu LPS. PCR cantitativă în timp real pe bază de verde SYBR a fost efectuată utilizând ADNc sintetizat și un set de primeri corespunzător pentru fiecare genă țintă cu un sistem PCR în timp real StepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Secvențele de primer au fost după cum urmează: IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' și 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3" și 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3" uman; Nivelurile de expresie ale gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- și 5-CTTCGGGIGGCAGTGATGGC{{-3.IL{{-6 și SLC37A2) au fost calculate după normalizarea cu GAPLCDH.A2. AoSMC Total au fost extrase din AoSMC necultivate cu 2,6 mM P și celule AoSMC cultivate cu 2,6 mM P timp de 3, 6, 9, 12 și 14 zile. PCR în timp real a fost efectuată utilizând ADNc sintetizat. Secvențele de primer au fost ca Urmează: Runx2 uman, 5-TGAGGCCGCTTCTCCAACCC-3' și 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG{-3. Nivelurile de expresie ARNm Runx2 și SLC37A2 au fost calculate după normalizarea cu APPH.

Analiza Western blot.

Proteina totală a fost colectată din probele AoSMC cultivate în aceleași condiții utilizate pentru analiza PCR în timp real. Aceste probe au fost lizate folosind soluție salină tamponată cu Tris (pH 75) suplimentată cu 5% NP-40 și un cocktail de inhibitor de protează 1%. Probele de concentrație de proteine ​​au fost măsurate utilizând kitul de testare a proteinelor BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). iar concentraţia a fost ajustată prin western blot, 10 ug de proteină au fost separate într-un gel de poliacrilamidă 10% utilizând electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă. Membrana a fost tratată cu anticorp SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) sau anticorp GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) ca anticorpi primari, incubați cu anticorp Rabbit lgG conjugat cu peroxidază de hrean (R&D Systems, Minneapolis, MN) ca anticorp secundar și vizualizat folosind Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Anglia) și analizorul de imagini luminiscente (LAS-1000 plus, FUNIIFILM, Tokyo, Japonia). Banda a fost cuantificată folosind lmagel.

Experimentale

Toate protocoalele de studiu au fost aprobate de Comitetul de etică al Universității din Hyogo, Școala de Științe Umane și Mediu. Masculi în vârstă de douăsprezece săptămâni, șobolani Sprague-Dawley au fost achiziționați de la Japan SLC (Shizuoka, Japonia). Șobolanii au fost menținuți într-un ciclu de 12-lumină, 12-h întuneric (09:00-21:{00) și au permis accesul liber la hrană și apă extrapură.

Dietele experimentale includ o dietă de control P (1,0% P, 0,6Ca, 20% proteine), o dietă cu adenină (0,75% adenină , 1,0% P, 0,6% Ca, 2,5% proteine), o dietă cu conținut scăzut de P (LP) (0,2% P,0 0,6% Ca, 10%proteine) și o dietă bogată în P (HP) (1,0% P, 0,6% Ca, 10% proteine) bazată pe dieta AIN93-G (Orientală Drojdie, Tokyo, Japonia) cu cazeina ca sursă de proteine.3637) O dietă cu conținut scăzut de proteine ​​​​a fost raportată pentru a promova calcificarea vasculară la șobolanii cu insuficiență renală indusă de adenină, astfel încât a fost efectuată restricția proteică.3738) Înainte de grupare, toți șobolanii (n=23) au fost hrăniți cu o dietă MF standard (drojdie orientală) timp de o săptămână pentru a se aclimatiza. La vârsta de 13 săptămâni, șobolanii au fost împărțiți în 2 grupuri: grupul de control (n=5) și grupul CKD indus de adenină (n=18). Grupul de control a primit dieta de control P timp de 6 săptămâni. . Grupul CKD indus de adenină a primit dieta cu adenină timp de aproximativ 3 săptămâni și apoi a fost împărțit în 2 subgrupe: grupul CKD-LP (n=8) sau grupul CKDHP (n=10). Șobolanii din grupul CKD-LP și grupul CKD-HP au primit dieta LP și dieta HP timp de 3 săptămâni, respectiv în perioada experimentală, aportul alimentar a fost înregistrat zilnic. În timpul dietei cu adenină, probele de sânge au fost colectate din vena coadă între orele 10:00 AM și 11:00 AM o dată pe săptămână până în a doua săptămână, iar apoi o dată la 2 zile pentru a monitoriza nivelurile plasmatice. În timpul dietei LP sau al dietei HP, probele de sânge au fost recoltate o dată pe săptămână. Au fost colectate probe de urină și volumul de urină a fost înregistrat o dată pe săptămână. Șobolanii au fost sacrificați cu anestezic folosind izofluran (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japonia) și laparotomii. Au fost recoltate probe de sânge din vena cavă inferioară și din aorta toracoabdominală pentru analiză.

Expresia SLC37A2 pe aortă.

Aproximativ o treime din aorta toracoabdominală colectată a fost utilizată pentru a vizualiza calcificarea și a efectua imunocolorarea. Aorta a fost înglobată în parafină și au fost tăiate secțiuni 4-um. Secțiunile au fost colorate folosind o metodă Von Kossa pentru trusa de calciu (Polysciences. Warrington, PA) conform instrucțiunilor producătorului. analiza de imunocolorare a fost efectuată cu secțiuni în serie. Secțiunile au fost incubate cu anticorp SLC37A2 peste noapte la 4 grade și apoi tratate cu Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japonia) timp de 30 de minute la temperatura camerei. Ulterior, secțiunile au fost tratate cu un kit DABsubstrate (Nichirei).

ARN total a fost extras din restul aortei toracoabdominale congelate. PCR în timp real a fost efectuată utilizând ADNc sintetizat. Secvențele de primer au fost după cum urmează: osteo-pontin de șobolan, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' și 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' și; șobolan SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' și 5'-CTGATGGGCTTTCTTGGACATG{-3. Nivelurile de expresie ARNm osteopontinei și ARNm SLC37A2 au fost calculate după normalizarea cu GAPDH

Analize statistice.

Datele sunt prezentate ca medie + SE. Diferențele dintre grupuri au fost analizate folosind testul t. În experimentele AoSMC calcificate induse de fosfat, diferențele au fost analizate folosind o analiză unidirecțională a varianței, urmată de metoda lui Dunnett. În experimentele cu modelul CKD, diferențele au fost analizate folosind testul K ruskal-Wallis urmat de metoda Steel-Dwass. Coeficienții de corelație (rs) au fost determinați folosind testul de rang al coeficientului de corelație al lui Spearman. Pentru toate testele. valorile p cu două cozi<0.05 were considered statistically significant.