Spermidina atenuează puștii indus de hipoxie intrauterină leziunile mitocondriale miocardice nou-născute la șobolani prin inhibarea stresului oxidativ și prin reglarea controlului calității mitocondriale Partea 2

4.4. Efectele spermidinei asupra activității antioxidante miocardice și a apoptozei la nou-născuții expuși la hipoxie intrauterină

Glicozidul cistanchei poate crește, de asemenea, activitatea SOD în țesuturile inimii și hepatice și poate reduce semnificativ conținutul de lipofuscină și MDA din fiecare țesut, eliminând eficient diferiți radicali reactivi de oxigen (OH-, H₂O₂ etc.) și protejând împotriva daunelor cauzate de ADN. de radicalii OH. Glicozidele feniletanoide Cistanche au o capacitate robustă de captare a radicalilor liberi, o capacitate de reducere mai mare decât vitamina C, îmbunătățește activitatea SOD în suspensia de spermă, reduc conținutul de MDA și au un anumit efect protector asupra funcției membranei spermatozoizilor. Polizaharidele Cistanche pot spori activitatea SOD și GSH-Px în eritrocite și țesuturi pulmonare ale șoarecilor senescenți experimental cauzate de D-galactoză, precum și pot reduce conținutul de MDA și colagen în plămâni și plasmă și pot crește conținutul de elastină, au un bun efect de curățare asupra DPPH, prelungește timpul de hipoxie la șoarecii senescenți, îmbunătățește activitatea SOD în ser și întârzie degenerarea fiziologică a plămânilor la șoarecii senescenți experimental. Cu degenerarea morfologică celulară, experimentele au arătat că Cistanche are o bună capacitate antioxidantă. și are potențialul de a fi un medicament pentru prevenirea și tratarea bolilor de îmbătrânire a pielii. În același timp, echinacozidul din Cistanche are o capacitate semnificativă de a elimina radicalii liberi DPPH și poate elimina speciile reactive de oxigen, poate preveni degradarea colagenului indusă de radicalii liberi și, de asemenea, are un efect bun de reparare asupra daunelor anionice a radicalilor liberi de timină.

Faceți clic pe Cum să utilizați Cistanche Tubulosa

【Pentru mai multe informații:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Am măsurat activitățile enzimelor antioxidante SOD și CAT în miocard prin colorimetrie (Figurile 4A și B). Sa constatat că activitățile SOD și CAT în grupul IUH au fost semnificativ mai mici decât cele din grupul de control (P <0.05); În comparație cu grupul IUH, activitățile SOD și CAT în grupul SPD au crescut semnificativ (P <0.05), iar DFMO a eliminat efectul SPD (P <0. 05). Ulterior, am evaluat apoptoza celulară prin detectarea nucleelor ​​pozitive TUNEL (Figura 4CandD) și expresia proteinei pro-apoptoză BAX și anti-apoptoză BCl-2 (Figurile 4E și F). Am observat că numărul de cardiomiocite TUNELpozitive și raportul de exprimare a proteinei BAX/BCL2 au fost substanțial mai mari în grupul IUH decât cei din grupul de control (P < 0,05). În contrast, raportul dintre celulele pozitive TUNEL și raportul de exprimare a proteinei BAX/BCL2 au fost mai mici în miocardul șobolanilor tratați cu SPD decât în ​​grupul IUH (P < 0,05). DFMO a eliminat efectul SPD (P < 0,05). Pentru a rezuma, SPD administrat in utero poate inversa scăderea activităților enzimelor antioxidante și creșterea apoptozei celulare în inimile descendenților induse de IUH.

4.5. Efectele spermidinei asupra producției de specii reactive de oxigen, potențialului membranei mitocondriale și mitofagiei în cardiomiocite expuse la hipoxie

Disfuncția mitocondrială se manifestă în principal ca o creștere a producției de ROS, o scădere a sintezei ATP și acumularea de mitocondrii disfuncționale. Potențialul membranei mitocondriale (∆Ψm) este gradientul electrochimic de protoni (H plus gradientul de concentrație și diferența de potențial transmembranar) de-a lungul membranei interioare mitocondriale, care se formează în timpul transferului de electroni al lanțului respirator oxidativ mitocondrial, în care un număr mic de ROS sunt produs. În consecință, nivelul ROS și modificările ∆Ψm sunt principalii indicatori ai funcției mitocondriale. Producția excesivă de ROS are ca rezultat acumularea de mitocondrii disfuncționale; mitocondriile lezate sunt îndepărtate în principal prin mitofagie. Pentru a investiga dacă SPD exogen ar putea afecta integritatea funcției mitocondriale în cardiomiocite în condiții de hipoxie, am examinat mai întâi nivelurile ROS folosind o sondă de fluorescență DHE (Figura 5A). Am observat că producția de ROS a crescut după ce cardiomiocitele au fost expuse la hipoxie timp de 24 de ore (P < 0.05) și că SPD a inhibat producția de ROS indusă de hipoxie (P < 0 .05); cu toate acestea, DFMO a eliminat scăderea producției de ROS mediată de SPD atunci când DFMO au fost furnizate cardiomiocitelor tratate cu SPD (P <{13}}.05) (Figura 5C). Mai mult, ∆Ψm a fost detectat folosind o sondă fluorescentă TMRE (Figura 5B). Cu cât intensitatea fluorescenței roșii este mai puternică, cu atât potențialul mitocondrial este mai mare (P < 0.05). Am observat că intensitatea fluorescenței roșii a fost semnificativ mai mică în grupul IUH decât în ​​grupul de control (P < 0.05). În comparație cu grupul IUH, intensitatea fluorescenței roșii a fost mai mare în tratamentul SPD (P <0,05), iar DFMO a abolit încă o dată efectele SPD (P <0,05) (Figura 5D). Apoi am estimat colocalizarea mitocondriilor (etichetate cu verde MitoTracker) cu lizozomii (etichetate cu roșu Lyso-Tracker), ceea ce ne-a permis să măsurăm degradarea autofagică a mitocondriilor (Figura 5E). După cum se indică în Figura 5F, în comparație cu controlul, hipoxia a scăzut colocalizarea Mito-Tracker Green și Lyso-Tracker Red în cardiomiocite (P < 0,05). Cu toate acestea, în comparație cu grupul cu hipoxie, procentul de mitocondrii și lizozomi colocalizați a fost mai mare în grupul de tratament cu SPD (P <0,05), iar DFMO a abolit efectul SPD (P <0,05). Aceste rezultate sugerează că hipoxia crește producția de ROS și scade ∆Ψm și mitofagia; SPD poate atenua deteriorarea mitocondrială indusă de hipoxie prin stimularea mitofagiei și inhibarea stresului oxidativ.

4.6. Efectele SPD asupra sistemului MQC miocardic la nou-născuții expuși la IUH

Controlul calității mitocondriale (MQC), inclusiv procesele de autofagie mitocondrială, biosinteză mitocondrială și fuziune și fisiune mitocondrială, este esențial pentru menținerea morfologiei, cantității și funcției normale a mitocondriilor și pentru asigurarea funcției normale și a metabolismului celulelor. Mitofagia reglează MQC și mediază degradarea autofagică extinsă a mitocondriilor ca răspuns la alterarea căii și fiziologice. Am evaluat mai întâi mitofagia observând formarea mitofagozomului cu TEM (Figura 6A - C). Conform rezultatelor, unele structuri anormale sau mitocondrii de fragmentare au fost incluse într-o membrană autofagică cu membrană dublă, care erau mitofagozomi, și au indicat că mitofagia a fost activă în grupul de control. Cu toate acestea, numărul de mitofagozomi a scăzut foarte mult în miocardul grupului IUH. Interesant este că miocardul grupului SDP a prezentat fenotipuri mitofagie aproape identice cu cel al grupului de control, în timp ce DFMO a abolit efectele induse de SPD. Mitocondriile sunt organite foarte dinamice, care suferă evenimente constante de fisiune și fuziune asociate cu funcția lor. Apoi am examinat fragmentarea mitocondrială folosind TEM (Figura 6A). Am descoperit că numărul de mitocondrii mici și fragmentare a crescut semnificativ cu IUH, în comparație cu controlul (P <{4}}.05), indicând faptul că fisiunea mitocondrială a fost în mare măsură crescută. Această modificare a fost restrânsă de tratamentul SPD, iar DFMO a abolit, de asemenea, rolul SPD încă o dată (Figura 6D). Mai mult, au fost detectate DRP1 și MFN2 (proteine ​​de reglare a dinamicii mitocondriale) (Figura 6E - G). MFN2 a scăzut semnificativ, în timp ce DRP1 a crescut și a fost observat în grupul IUH comparativ cu grupul de control (P <0.05). În timp ce DRP1 a fost reglat în jos și MFN2 a fost suprareglat cu tratamentul SPD exogen (P <0.05), DFMO a eliminat efectele induse de SPD. Biosinteza mitocondrială se coordonează cu mitofagia pentru a elimina mitocondriile deteriorate sau în exces, pentru a genera noi mitocondrii și pentru a menține homeostazia MQC în condiții de stres. În cele din urmă, am evaluat expresia proteinelor legate de biosinteza mitocondrială, inclusiv SIRT-1, PGC-1, NRF-2 și TFAM, prin analiza imunoblot (Figura 6H - L). Comparativ cu grupul de control, expresia SIRT-1, PGC{-1, NRF-2 și TFAM a scăzut semnificativ în miocardul grupului IHU (P < 0,05). În comparație cu grupul IUH, expresiile proteice ale SIRT-1, PGC-1, NRF{-2 și TFAM în grupul SPD au crescut semnificativ (P < 0,05). DFMO a eliminat efectul SPD (P < 0,05). Pentru a rezuma, aceste rezultate indică faptul că IUH duce la disfuncția MQC la nivelul miocardic al puilor de o zi și că tratamentul SPD inhibă semnificativ dezechilibrul sistemului MQC la descendenții neonatali expuși la IUH.

5. Discuție

Bolile de inimă reprezintă o provocare majoră pentru sănătate la nivel mondial. S-a demonstrat că hipoxia fetală cronică poate declanșa o origine fetală a disfuncției cardiace și poate programa un risc crescut de boli cardiace la descendenții adulți. Inima are o rată metabolică ridicată, iar dependența sa de funcția mitocondrială pentru producerea de energie este critică pentru funcția cardiacă normală. Cu toate acestea, efectul IUH asupra funcției mitocondriale cardiace și mecanismul său aferent și focalizarea strategiei de prevenire a cardio-protecției asupra mitocondriilor la descendenții nou-născuți sunt încă necunoscute. În studiul de față, am descoperit că șobolanii de primăvară de o zi expuși la IUH prezintă anomalii semnificative în creștere și dezvoltare, maturarea cardiomiocitelor, în special în structura și funcția mitocondrială miocardică, și SPD exogen suplimentar in utero poate ameliora acest IUH indus. modificarea prin inhibarea stresului oxidativ miocardic și reducerea apoptozei. Important, am observat că tratamentul prenatal SPD poate inversa în mod semnificativ anomaliile mitofagiei și biogenezei și fragmentarea mitocondrială în miocardul puilor de șobolani nou-născuți indusă de IUH. Din câte cunoștințele noastre, această cercetare a fost primul raport privind efectul protector al SPD asupra leziunilor cardiace ale puilor nou-născuți induse de IUH prin reglarea mecanismului MQC și apoi îmbunătățirea funcției mitocondriale.

Dovezi suficiente sugerează că restricția de creștere intrauterină interferează cu traiectoria de dezvoltare a sistemelor fetale, care poate afecta funcția inimii mai târziu în viață (5, 7, 37). În studiul nostru, IUH a provocat întârziere de creștere și leziuni cardiace la șobolanii nou-născuți, deoarece șobolanii nou-născuți de o zi expuși la IUH au prezentat o scădere semnificativă a BW și HW și o creștere a raportului HW/BW. Mai mult, aranjarea fibrelor miocardice a fost dezordonată, miofilamentele au fost rupte, s-a observat infiltrarea celulelor inflamatorii printre miofilamente și depunerea miocardică de colagen a crescut. Aceste constatări sunt în concordanță cu constatările raportate de Ducsay și colab. (2) și Thompson și colab. (7). În mai multe modele animale, inimile fetale expuse la hipoxie cronică prezintă o maturare și proliferare redusă a cardiomiocitelor și o dotare scăzută de cardiomiocite (38, 39). În mod similar, cercetarea noastră a mai arătat că proporția de cardiomiocite binucleate a crescut și expresia Ki67 a scăzut în grupul IUH. Momentul în care cardiomiocitele devin bi/multinucleate coincide cu momentul în care mamiferele își pierd potențialul de regenerare (40). Maturarea inimii fetale este importantă pentru sănătatea inimii puilor. În consecință, IUH face ca cardiomiocitele să se retragă din ciclul celular înainte de timp, iar tulburarea de maturare a cardiomiocitelor duce la plasticitatea afectată a creșterii inimii postnatale.

Inutil să rețineți că mitocondriile sunt principalele organele celulare implicate în producerea ROS; mitocondriile disfuncționale nu sunt produse numai ca răspuns la scăderea producției de ATP, ci și la creșterea stresului oxidativ și a apoptozei (41). În acest studiu, IUH a scăzut semnificativ activitatea enzimelor antioxidante SOD și CAT, a scăzut funcția respiratorie mitocondrială și nivelurile de ATP, a crescut expresia BAX/BCL2 și a afectat structura mitocondrială în miocardul puilor de șobolani nou-născuți de o zi. Aceste constatări sunt susținute de alți cercetători (11), care au documentat că expunerea mamei la hipoxie cronică în timpul sarcinii ar putea scădea activitatea complexului IV mitocondrial și ar putea induce apoptoza în inimile șobolanilor fetali pe termen scurt. Am susținut că compromisul mitocondrial ar putea susține stresul oxidativ și insuficiența energetică în timpul dezvoltării fetale, culminând cu leziuni cardiace perinatale. Acesta poate fi principalul motiv pentru creșterea riscului cardiovascular la descendenții sarcinilor complicate de hipoxie fetală cronică. În consecință, este implementabil să se ia mitocondriile ca țintă a intervenției terapeutice pentru a proteja funcția cardiacă la descendenți. Aljunaidy și colab. au raportat că tratamentul matern cu antioxidant mitocondrial MitoQ a prevenit stresul oxidativ placentar, a salvat creșterea fetală și a îmbunătățit funcția cardiacă la descendenții expuși la IUH (42).

Spermidina este o poliamină cu o varietate de funcții biologice. După cum am menționat, SPD poate inhiba acumularea de ROS indusă de H2O2- și poate preveni scăderea potențialului membranei mitocondriale (MMP) și a nivelurilor de ATP în cardiomiocitele și celulele H9C2 ale șobolanilor neonatali de cultură. Mai mult, SPD poate promova biogeneza mitocondrială și poate îmbunătăți funcția mitocondrială în inima îmbătrânită (43). Poliaminele spermină și spermidină pot afecta proteomul mitocondrial dinamic, prevenind astfel modificările legate de vârstă în funcțiile cardiace și îmbătrânirea cardiacă (36). Alte studii au demonstrat, de asemenea, că suplimentarea SPD întârzie îmbătrânirea cardiacă prin îmbunătățirea mitofagiei și promovarea respirației mitocondriale la șoareci (44). ODC este o enzimă cheie a sintezei poliaminelor și se raportează că eliminarea in vivo a ODC sau aplicarea DFMO, un inhibitor ireversibil al ODC are ca rezultat perturbarea dezvoltării conceptului și întârzierea creșterii fetale din cauza disponibilității insuficiente a poliaminelor (45, 46). Studiul nostru de față indică faptul că tratamentul cu 5 mg/kg/zi de SPD la șobolanii expuși la IUH previne întârzierea creșterii și alterarea structurii morfologice cardiace și a maturării la puii nou-născuților. Mai mult, creșterea stresului oxidativ cardiac indus de IUH, creșterea apoptozei și declinul respirator mitocondrial la descendenții neonatali au fost, de asemenea, prevenite prin SPD, în timp ce DFMO administrat mamei a abolit protecția mediată de SPD pentru inima neonatală. Este bine documentat faptul că poliaminele se implică în angiogeneza și embriogeneza placentară, precum și în creșterea și dezvoltarea embrionare și fetale (47). Zhu şi colab. au raportat că nivelurile de poliamine au fost mai scăzute în plasma venei ombilicale de la fetușii porcine cu restricție de creștere intrauterină (IUGR), iar SPD suplimentară pentru mamă poate preveni IUGR (48). Spermidina este un compus cu o siguranță rezonabilă și o toxicitate mai scăzută (49). Numărul tot mai mare de studii preclinice și clinice au indicat că SPD dietetic are efecte asupra sănătății, cum ar fi antiîmbătrânire, protecție cardiovasculară, neuromodulație și funcții antiinflamatorii, cum ar fi injecția intraperitoneală de SPD (50 mg/kg) la șoareci protejează împotriva indusă de colagen. artrita prin inhibarea polarizării macrofagelor M1 în țesutul sinovial (50). Suplimentarea cu 10 mg/kg/zi de SPD a inversat deteriorarea cardiacă legată de vârstă la șobolani (36). Mai important, mama a fost o intervenție cu 5 mg/kg/zi de SPD în timpul sarcinii târzii pentru a îmbunătăți declinul cognitiv și neuronal indus de IU (51) și deteriorarea stresului oxidativ cardiac la descendenții de șobolani (32). În consecință, am folosit aceeași doză de SPD (5 mg/kg/zi) pentru șobolanul gestant expus la IUH ca în studiul nostru anterior. Am bănuit că suplimentarea SPD maternă în timpul sarcinii hipoxice ar putea crește nivelurile SPD în circulația fetală, ceea ce ar fi putut fi legat de protecția împotriva stresului oxidativ care are ca rezultat placenta, care va proteja mitocondriile din inima în curs de dezvoltare de programarea de către IUH, acțiunea SPD poate fi obținut prin mecanismul său puternic antioxidant, anti-apoptoză și de promovare a proliferării.

Mecanismele de control al calității mitocondriale sunt esențiale pentru menținerea morfologiei normale, a numărului și a funcției mitocondriilor și pentru asigurarea funcției și metabolismului normal al celulelor (16). Dovezi recente au arătat că mecanismele MQC joacă un rol decisiv în maturizarea mitocondrială miocardică perinatală și dezvoltarea inimii (14). Gong și colab. a raportat pentru prima dată că mitocondriile imature asemănătoare fetale sunt degradate direct de mitofagia mediată de Parkin în timpul perioadei postnatale timpurii (19). Între timp, biogeneza mitocondrială crește dramatic (52), iar factorii de fuziune și fisiune mitocondrială sunt reglați în creștere transcripțional în inimă după naștere (20, 21). Cu toate acestea, se știe mult mai puțin despre efectul IUH asupra MCQ în miocardul descendenților neonatali. În acest studiu, am observat mai întâi că numărul de mitofagozomi a scăzut semnificativ în miocardul grupului IUH, ceea ce indică faptul că IUH a afectat mitofagia miocardică a puilor de șobolani nou-născuți. Apoi, am observat o scădere semnificativă a expresiei PGC-1 (un regulator cheie al biogenezei mitocondriale) și expresia moleculelor sale de semnalizare în amonte și în aval, inclusiv SIRT-1, TFAM și NRF{{10} } în miocardul grupului IUH. Mai mult, am constatat că expunerea la IUH a făcut mitocondrii mai mici sau fragmentate, iar expresia DRP1 a crescut; cu toate acestea, expresia MFN2 a scăzut în miocardul puilor de șobolan nou-născuți, sugerând că fisiunea mitocondrială a fost reglată în sens pozitiv și fuziunea a fost reglată în jos. Aceste constatări au reflectat relația cauză-efect dintre dezechilibrul mecanismului MQC și deteriorarea miocardului indusă de IUH la descendenții nou-născuți. Aceste procese complexe de MQC funcționează împreună pentru a elimina mitocondriile disfuncționale într-un mod specific și țintit și pentru a coordona biogeneza noilor organite, care este esențială pentru homeostazia cardiovasculară. Multe semnale intracelulare și extracelulare pot regla evenimentele MQC, inclusiv stresul oxidativ, colapsul potențial al membranei, apoptoza și altele. Aici, dezechilibrul MQC mitocondrial poate fi atribuit stresului oxidativ sporit și apoptozei crescute în inima puilor de șobolani expuși la IUH. În consecință, este esențial să se mențină un mecanism MQC adecvat pentru a asigura o rețea mitocondrială sănătoasă în inima puilor nou-născuți expuși la IUH.

Având în vedere că nivelurile SPD placentare sunt puternic asociate cu restricția de creștere fetală (53), SPD poate regla MQC într-un model animal diferit. De exemplu, SPD este un inductor puternic și specific al autofagiei pentru extinderea duratei de viață, care poate proteja procesul de îmbătrânire a mai multor țesuturi, inclusiv inima, creierul și mușchiul scheletic (44, 54, 55). Spermidina poate atenua îmbătrânirea cardiacă prin îmbunătățirea biogenezei mitocondriale (43). În acest studiu, am aplicat SPD șoarecilor mame și am constatat că SPD ar putea normaliza dezechilibrul MQC miocardului la descendenții expuși la IUH. Cu toate acestea, tratamentul matern cu inhibitor de ODC DFMO a abolit efectele SPD, indicând faptul că intervenția SPD ar putea preveni MQC anormală în miocardul puilor de șobolani de o zi expuși la IUH. Pentru a rezuma, funcționarea excelentă a MQC în miocardul puilor nou-născuți ar putea face bine structura, funcția și maturizarea mitocondriale, realizând astfel transformarea de la capacitatea de glicoliză intrauterină la aprovizionarea cu energie de oxidare postnatală a acizilor grași și să îndeplinească încărcarea cardiacă în creștere după naștere. . Mai mult, experimentul nostru pe cardiomiocite sugerează că SPD poate inhiba creșterea producției de ROS indusă de hipoxie, scăderea ∆Ψm și degradarea autofagică afectată a mitocondriilor. Am dedus că efectele benefice ale SPD ar putea fi atribuite nivelurilor crescute de SPD în placenta și circulație prin aplicarea SPD maternă, protejând astfel descendenții mitocondriali miocardici de programarea dezvoltării de către IUH.

5.1. Concluzie

Prezentul studiu evidențiază că terapia SPD in utero poate proteja miocardul unei zile - inima urmașilor de efectele adverse ale hipoxiei prenatale. Aceste modificări postnatale cauzate de SPD pot fi realizate prin antioxidare și anti-apoptoză și prin reglarea căilor MQC, scăzând astfel dezvoltarea mitocondrială programată în inima expusă la IUH. Există unele limitări ale acestui studiu. Nu am efectuat experimente farmacocinetice pe SPD și, prin urmare, nu putem determina nivelurile exacte de SPD în circulația fetală atunci când mamei i s-a administrat SPD. În studiile noastre viitoare, vom investiga în continuare concentrația sanguină eficientă a SPD folosind placenta fătului. Prezentele descoperiri oferă un nou cadru pentru studiile viitoare pentru a defini rolurile SPD în prevenirea mitocondriilor miocardice ale descendenților neonatali IUH.

【Pentru mai multe informații:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】