Celule stem pentru medicina regenerativa si anti-imbatranire partea 1

Vă rugăm să contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informații

Abstract:Pentru a investiga metodele de îmbunătățire a prelucrării deșeurilor porcine, pielea porcinelor a fost hidrolizată folosind diferite proteaze disponibile în comerț (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelaină, Protamex și Papain) în mai multe condiții optime. În urma hidrolizei enzimatice, hidrolizatele de colagen (CH) au fost fracționate cu greutate moleculară (3 kDa) prin ultrafiltrare cu membrană. CHS au fost analizate pentru proprietățile fizice (pH, recuperarea proteinelor, conținutul de grup amino liber, distribuția greutății moleculare și compoziția aminoacizilor), precum și pentru proprietăți funcționale (activități antioxidante și activități anti-îmbătrânire). Printre CH-uri, CH-urile hidrolizate de Alcalase (CH-Alcalase) au prezentat cel mai mare grad de hidroliză în comparație cu alte CHH-uri. Atât "CH-Alcalase", cât și "CH-Alcalase"<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

Cuvinte cheie:hidroliză; proteaze comerciale; hidrolizat de colagen; antioxidant; anti-imbatranire

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

1. Introducere

Odată cu creșterea speranței de viață, procedurile anti-îmbătrânire a pielii primesc multă atenție. Colagenul, utilizat în produsele de îngrijire a pielii ca ingredient cosmeceutical pentru anti-îmbătrânire, este utilizat pe scară largă pe piața cosmetică. Colagenul este o proteină moleculară mare, fibroasă de origine animală, care se găsește din abundență în țesutul conjunctiv, piele, tendoane, cartilaje, ligamente, dinți, unghii și părul oamenilor și animalelor. Efectivele de animale rămân principala sursă de colagen industrial[1]. Anual, cantități mari de subproduse animaliere sunt aruncate în întreaga lume, ca deșeuri, de către industria alimentară și de prelucrare a cărnii. Cu toate acestea, acestea pot fi utilizate ca resurse proteice importante pentru materialele alimentare noi sau transformate în produse cu valoare adăugată prin hidroliză, care este aplicată pe scară largă pentru a îmbunătăți și a îmbunătăți proprietățile funcționale și nutriționale ale proteinelor [2,3]. Colagenul este, de asemenea, din ce în ce mai mult considerat o sursă de peptide bioactive, care s-au dovedit a promite ca compuși benefici pentru utilizarea în aplicații nutriționale sau farmaceutice.cistanche beneficii,Prin urmare, hidroliza colagenului poate juca un rol important în îmbunătățirea biodisponibilității și a adecvării sale pentru utilizare în diferite procese comerciale.

Activitățile fiziologice ale peptidelor bioactive, care conțin de obicei 2-20 de reziduuri de aminoacizi (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">cistanche colesterolGradul de hidroliză afectează în mod direct greutatea moleculară și compoziția aminoacizilor hidrolizaților [8]. Prin urmare, procesul de hidroliză poate fi necesar pentru producerea de peptide bioactive noi.

Cistanche poate anti-imbatranire

Hidroliza proteinelor, care duce la scindarea legăturilor peptidice, poate fi efectuată prin procese enzimatice sau chimice [9]. Procesele chimice, inclusiv hidroliza alcalină sau acidă care utilizează extracții cu solvenți, sunt dăunătoare nu numai mediului, ci și oamenilor care consumă produsele rezultate [4,10]. Procesele chimice, care sunt dificil de controlat, produc produse care conțin aminoacizi modificați [9]. În schimb, hidroliza enzimatică poate fi efectuată în condiții ușoare, evitându-se astfel mediile extreme care sunt necesare tratamentelor chimice. În plus, procesele nu produc reacții adverse și nici nu scad valoarea nutritivă a sursei de proteine [8]. Mai multe proteaze, inclusiv Alcalase, pepsină, Protamex, tripsină, și neutrază, sunt frecvent utilizate pentru a hidroliza proteine, rezultând în diferite tipuri de hidrolizate de proteine și peptide cu o varietate de activități bio-funcționale. Un studiu a raportat producerea de hidrolizate de colagen cu activitate antioxidantă din gelatina pielii porcine folosind hidroliza enzimatică prin pepsină și pancreatină [11].cistanche deserticola efecte secundareSubprodusele de somon au fost hidrolizate pentru a produce hidrolizate peptice folosind diverse proteaze, unde peptidele finale au prezentat proprietăți antioxidante și antiinflamatorii excelente [12].

Obiectivul cercetării a fost:(a)identificarea celor mai activi hidrolizate de colagen produse prin hidroliză enzimatică folosind diferite proteaze disponibile în comerț (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelaină și Papaină);(b) pentru a confirma efectul de fracționare al hidrolizatelor de colagen obținute din hidroliza enzimatică și (c) pentru a determina activitățile lor antioxidante și anti-îmbătrânire in vitro.

2. Rezultate și discuții

2.1.Efectul hidrolizei enzimatice asupra hidrolizatelor de colagen

2.1.1.pH

Proprietățile funcționale ale proteinelor pot fi îmbunătățite prin hidroliză prin anumite proteaze. În acest studiu, șase proteaze diferite (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex și Papain) au fost folosite pentru a hidroliza colagenul din pielea porcinelor pentru a obține hidrolizate active de colagen cu greutăți moleculare mici.cistanche doza redditModificarea pH-ului hidrolizatelor de colagen (CH) este prezentată în figura 1. pH-ul suspensiei de colagen (5% amestec de piele porcină)a fost inițial6.39-6.55 (la 0h). CH-Alcalase și CH-Flavorzyme au atins pH-ul optim (pH 8.0) la 12 ore de incubație. CH- Protamex, CH-Bromelaină și CH-Papain au atins pH-ul optim (pH7,0) la 6 ore de incubație, în timp ce CH-Flavorzyme a continuat să scadă de la pH6,39 la pH5,69 pentru incubarea de 24 de ore (figura 1). pH-ul unui hidrolizat proteic este un factor important care reglează reacțiile enzimatice de hidroliză[13]. Prin urmare, generarea de hidrolizate de colagen în condiții de pH diferit se poate datora modificărilor dependente de pH în conformația enzimatică, care pot avea un impact asupra bioactivării și proprietăților fizico-chimice ale acestora.

2.1.2. Electroforeză gel dodecil sulfat-poliacrilamidă de sodiu (SDS-PAGE)

Sunt prezentate profiluri de electroforeză cu gel dodecil sulfat-poliacrilamidă de sodiu (SDS-PAGE) ale CH tratate cu diverse proteaze timp de 24 de ore (Figura 2). Profilul peptidic al suspensiei de colagen (la 0 h)a arătat o bandă vizibilă în intervalul de greutate moleculară mică până la mare. Rezultatele au indicat hidroliza rapidă în CH-Alcalase, CH-Neutrase, CH-Bronneline și CH-Protamex, deoarece nu au existat benzi după incubarea de 3 ore. Intervalul de greutate moleculară mare al benzilor de CH-Alcalase, CH-Neutrase și CH-Protamex au scăzut într-o manieră de incubare dependentă de timp. Cu toate acestea, CH-Bromeline nu a variat în funcție de timpul de incubație, deoarece are bere complet hidrolizată după doar 1 oră de incubație. Interesant este că CH-urile au dispărut complet atunci când proba a reacționat cu Alcalase sau Neutrase timp de 6 ore, indicând faptul că colagenul a acționat ca un substrat adecvat pentru unele dintre celelalte enzime testate.cistanche extract beneficii,Cu toate acestea, benzile de CH-Flavorzyme și CH-Papain au apărut în intervalul de greutate moleculară mică până la mare după 24 de ore. Proteinele pot fi hidrolizate parțial în peptide sau aminoacizi prin hidroliză enzimatică, în funcție de tipul de protează, timpul de incubație și raportul protează-substrat (cantitatea de proteine)[14]. Procesul de hidroliză enzimatică este determinat în principal de faptul dacă tipul de protează implicat este o endopeptidază sau o exopeptidază [15,16]. Deoarece Alcalase, Neutraza, și Protamex sunt endopeptidaze, procesele lor de hidroliză poate fi de așteptat să rupă legăturile peptidice de aminoacizi non-terminale aleator, facilitând astfel hidroliza în continuare a proteinelor. Pe de altă parte, Flavorzyme este atât un endo- cât și exopeptidază, care rupe non- sau N-terminalul lanțurilor peptidice. În acest studiu, proteina de colagen conținea site-uri de legare, care erau mai susceptibile la activitatea exopeptidazei decât la activitatea endopeptidazei de Flavorzyme. Astfel, datorită activității exopeptidazei, hidroliza proteinelor de colagen de către Flavorzyme a implicat ruperea pas cu pas a legăturilor peptidice din N-terminalul aminoacizilor, care au decelerat hidroliza proteinelor.

2.1.3. Recuperarea proteinelor și conținutul grupului amino liber

Se prezintă recuperarea proteică a CH-urilor obținute prin diferite proteaze comerciale (Figura 3A). Controlul (suspensia de colagen) a avut un conținut de recuperare a proteinelor de 1,19 mg/ml. Recuperarea proteinelor este un parametru al eficienței hidrolizei enzimatice. Conținutul scăzut de recuperare a proteinelor din CH indică o defalcare crescută a proteinelor. În plus, recuperarea proteinelor se corelează bine cu solubilitatea proteinelor. Activitatea hidrolitică mai mare poate fi cauzată de o creștere a lanțurilor laterale hidrofobe expuse, ceea ce duce la creșterea interacțiunilor hidrofobe dintre proteine și/sau peptide. Aceste lanțuri laterale hidrofobe pot duce la scăderea solubilității proteinelor, ducând astfel la creșterea recuperării proteinelor hidrolizatelor. În studiul nostru, conținutul de recuperare a proteinelor a fost bine corelat cu modificările modelelor SDS-PAGE. Cele mai scăzute și cele mai ridicate niveluri de conținut de recuperare a proteinelor au fost înregistrate pentru alcalază și, respectiv, aromazyme hidroliză. Pentru eficiența hidrolizei legată de timpul de incubație, CH-Alcalase, CH-Bromelaina și CH-Protamex au scăzut drastic în decurs de o oră de la incubare în comparație cu controlul. Scăderea conținutului de recuperare a proteinelor care rezultă din hidroliza proteinelor a arătat o relație inversă cu conținutul de grup amino. În plus, majoritatea CHH-urilor, cu excepția CH-Neutrazei, au prezentat un conținut scăzut de proteine între 3 h și 12 h. După 24hincubation, conținutul lor de proteine a crescut din nou în CH-Alcalase, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-Bromeline, CH-Protamex și CH-Papain după cum urmează:0,83 mg/ml,1,29 mg/ml, 0,75 mg/ml, 0,97 mg/ml, 0,77 mg/ml și, respectiv, 1,11 mg/ml. Unele rapoarte indică faptul că timpul optim de hidroliză depinde de mai mulți factori, cum ar fi speciile selectate, materia primă, enzima utilizată, rata materiei prime/enzimei, concentrația enzimei și gradul de hidroliză urmărit etc. [16]. Unele rapoarte indică faptul că hidroliza enzimatică extinsă (peste 24 h) poate duce la o reducere a activității de protează; astfel, hidroliza enzimatică trebuie efectuată în decurs de 24 de ore de hidroliză enzimatică [17,18].

S-a estimat conținutul de ch din grupul amino liber, care este un indicator al eficienței hidrolizei enzimatice (Figura 3B). Rezultatul așteptat al descompunerii proteinelor este că proteinele pot fi hidrolizate în produse peptidice mai scurte. Conținutul de grup amino liber al controlului a fost inițial de 0,14 mg/ml. Conținutul de grup amino liber al tuturor CH-urilor a crescut dramatic odată cu creșterea timpului de incubație. După incubarea a 24 de ore, conținutul de grup amino liber în ordine descrescătoare a fost: CH-Alcalase (1,00 mg/ml)>CH-Protamex(0,70 mg/ml)> CH-Neutrază(0,68 mg/ml)>CH-bromelină (0,67 mg/ml)>CH-Aromazime (0,53 mg/ml)>CH-papaină(0,40 mg/ml). Diferențele frecvente în ceea ce privește conținutul total de proteine sau de aminoacizi liberi din probele hidrolizate enzimatic pot fi legate de specificitatea enzimelor. Depinde de proprietățile unei enzime în timpul procesului de hidroliză enzimatică [16,17]. De exemplu, protează alcalină (cum ar fi Alcalase)prezintă activități hidrolitice mai mari în comparație cu proteazele acide sau neutre.

2.2. Efect de ultrafiltrare asupra proprietăților hidrolizate de colagen

Un proces de ultrafiltrare poate fi o metodă utilă, avantajoasă din punct de vedere industrial pentru producerea fracțiilor peptidice mici, cu o dimensiune moleculară dorită și o bioactivitate ridicată, în funcție de compoziția hidrolizatului de pornire și de activitatea studiată [19]. Solubilitatea, conținutul de grup amino liber și randamentul CH după liofilizare sunt prezentate (tabelul 1). Solubilitatea și conținutul de grup amino liber al martorului au fost de 11,95% și, respectiv, 0,79%. După hidroliza enzimatică și ultrafiltrarea cu întreruperea greutății moleculare de 3 kDa, cea mai mare solubilitate (21,17%), și conținutul grupului de aminoacizi liberi (14,17%) au fost observate în CH-Alcalase<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Greutatea moleculară medie a hidrolizatelor proteice este un factor important care determină proprietățile lor biologice [19]. În general, o fracție medie cu MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa reprezintă gelatină, iar o fracție medie cu MW> 300 kDa reprezintă colagenul [20,21]. Distribuția relativă a greutății moleculare a martorului (proba de pretratare), CH-Alcalase și CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">

Se prezintă compoziția aminoacizilor în CH (tabelul 2). CHS de proteaze diferite au avut compoziții diferite de aminoacizi și proprietăți antioxidante [23]. Compoziția de aminoacizi de colagen a fost bogat în glicină (Gly), prolină (Pro), și acid glutamic (Glu). Conținutul de aminoacizi din CHH(CH-Alcalase și CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">

Acest articol este extras din Molecule 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecule24061104 www.mdpi.com/journal/molecules