Caracterizarea structurală și evaluarea activităților antiinflamatorii și antitirozinaze ale polifenolilor din melastomul normal partea 2

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Compusul 3 a avut aceeași formulă moleculară ca și compusul 2, așa cum s-a determinat prin datele sale HRESIMS. Comparația dintre datele RMN din 3 și 2 (Tabelul 2) a arătat că gruparea metoxil la galoil-C-4 în 2 s-a mutat la galoil-C-3' în 3. Acest lucru a fost confirmat de corelațiile HMBC (Figura 2)protonilor metoxil(8y 3.88) și protonului aromatic (bH7.24)cu galoil-C-3'(6c 149.1) în 3 și deplasările chimice ale grupării metoxil, galoil-C{ {24}}, galoil-C-4 și galoil-C-3' care s-au deplasat de la bc60.8,151.5,141.3 și 146.5 în 2tobc56.7,146.6,140.7 și 149.1 în.3, respectiv pozitiv efectul bumbac la 237 nm și unul negativ la 262 nm în spectrul CD au indicat configurația (S) a grupului HHDP pentru 3 [24]. Configurația fragmentului de zahăr a fost dedusă din constanta de cuplare (=8.5 Hz) a protonului anomeric al fragmentului glucozil. Hidroliza acidă a lui 3 cu HCI 1 M a produs D-glucoză, care a fost confirmată prin analize TLC și GC. Prin urmare, compusul 3 a fost identificat ca 1-O-galoil-6-O-({3-metoxigaloil){-2,{3-O-(S)-hexahidroxidifenoil{{ 66}}D-glucoză.

Formula moleculară a lui 4 a fost dedusă din spectrul său HRESIMS (m/z 783,1032, [MH]-) ca C35H28O21. Greutatea sa moleculară a fost cu 16 unități de masă mai mică decât cea de 3, ceea ce poate fi atribuit absenței unui hidroxil și prezenței unui proton aromatic (6H6.87) la vaniloil-C-5' în 4 (Tabelul 2) . Acest lucru a fost confirmat din prezența unui fragment aromatic 1,2,4-trisubstituit （μ7,60 （dd, J=8.3,1,8 Hz）, 6,87 （d, J=8 .3 Hz） și 7,57 （d, J=1,8 Hz）） și schimbarea deplasării chimice a galoil-C-5' la δc 145,8 in 3 la vaniloil-C-5 „la bc 115,9 în 4. Corelațiile protonilor metoxil (6H 3.90) și protonul aromatic (H 6.87) cu vaniloil-C-3” în spectrul HMBC (Figura 2) au confirmat în continuare protonul aromatic (H 6.87) la vaniloil-C-5'. Atropisomerismul HHDP s-a dovedit a fi o configurație S prin apariția efectelor pozitive și negative ale bumbacului la 239 nm și, respectiv, 263 nm [24]. Constantele de cuplare ale protonului anomeric în 4 au fost de 8,5 Hz, amintind de configurația -anomerică. Hidroliza acidă a arătat că 4 avea aceleași unități de zahăr ca și 3. Astfel, compusul 4 a fost identificat ca 1-O-galoil-6-O-vaniloil{-2,3-O- (S)-hexahidroxidifenoil- -D-glucoză.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

2.2. Teste de activitate antiinflamatoare

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50uM. S-a raportat că flavonolii cunoscuți kaempferol(7)[26[, quercetin (10)[27l și miricetin-3-O- -L-ramnopiranozid(12)28 au activitate antiinflamatoare, dar kaempferol -3-ramnozida (8) [26] și quercetina-3-O- -L-ramnozida (11)[29] nu au activitate antiinflamatoare. Din rezultatele experimentale și datele din literatură, flavonoidele din planta din titlu au o activitate antiinflamatoare mai bună decât elagitaninele, putând fi ingredientul activ corespunzător efectului antiinflamator al acestei plante.

2.3. Teste de activitate inhibitoare a tirozinazei

Toți compușii au fost investigați pentru activitatea potențială inhibitoare a tirozinazei. După cum se arată în Tabelul 3, compușii noi 2-4 au afișat activități moderate de inhibiție a tirozinazei. Noul compus 1 a prezentat o activitate slabă inhibitoare a tirozinazei. Quercetina (10)[30] are o activitate de inhibiție semnificativă a tirozinazei, iar activitatea sa anti-tirozinază este mai bună decât quercetina-3-OwL-ramnozida(11)[26] și kaempferol (7) [26], ceea ce este consecvent. cu datele din literatură. Acest lucru a indicat că grupările 3’-și 4/-hidroxi de pe inelul B și grupările 3-hidroxi de pe inelul C din flavonoli au fost cruciale pentru activitățile lor. Activitatea anti-tirozinazică a kaempferol (7)[26] este mai bună decât a kaempferol-3-ramnozida (8)[26], iar compușii 8 și 12 [31] nu au activitate anti-tirozinazică semnificativă, ceea ce susține în continuare cele de mai sus. relatii structura-activitate.

3. Experimental 3.1.Materiale

Rădăcinile M.normale au fost colectate din orașul Yanshan, orașul Guilin, provincia Guangxi, în septembrie 2018 și autentificate de profesorul Yusong Huang (Institutul de botanică Guangxi). Un exemplar de voucher (20180912) a fost depus în Laboratorul cheie de cercetare și utilizare a fitochimice funcționale din Guangxi, Institutul de botanică Guangxi, China.

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

3.2. Proceduri generale experimentale

Rotațiile optice au fost măsurate cu un ADP440 plus polarimetru （λ 589 nm, lungimea căii 1.0 cm). Spectrele RMN au fost obținute pe un spectrometru Bruker Advance 500 (Bruker Biospin AG, Fällanden, Elveția), iar vârfurile solvenților reziduali au fost folosite ca referințe. Constantele de cuplare și deplasările chimice au fost date în Hz și, respectiv, pe o scară δ（ppm). Datele ESIMS și HIRESIMS au fost înregistrate pe un spectrometru de masă BRUKER HCT și, respectiv, pe un spectrometru LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Japonia). GC a fost efectuată pe un sistem Agilent 7890ON (Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, SUA) cu o coloană de 0,32 mm id x 25 mL-Chirasil-Val. HPLC analitic a fost rulat pe un sistem Shimadzu LC-2030C HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan) folosind o coloană Agilent Eclipse XDB-C18 (5 um) de 4,6id x 250 mm. HPLC semipreparativă a fost efectuată pe un sistem HPLC Shimadzu LC-20AT utilizând o coloană Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) de 20,0id x 250 mm la un debit de 4 ml/min. Cromatografia pe coloană (CC) a fost efectuată utilizând Sephadex LH-20 （25-100 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Suedia), coloană cu silicagel (200-300 plasă, Qingdao Marine Chemical Co. Ltd., Qingdao, China), gel MCI CHP 20P(75-150 um; Mitsubishi Chemical Co., Tokyo, Japonia) și coloane Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, Germania).

3.3. Extracție și separare

Rădăcinile uscate la aer, sub formă de pulbere (10 kg) de M. normale au fost extrase cu 8{{{0}} procente de acetonă apoasă (3 x 7 zile) la temperatura camerei și fiecare extract a fost filtrat. Filtratele au fost uscate sub presiune redusă pentru a da un extract brut (0,6 kg). Extractul a fost suspendat în H2O (1 L) și împărțit succesiv cu eter de petrol (3 × 2 L), EtOAc (3 × 2 L). Extractul de EtOAc (8{{40}} g) a fost împărțit în zece fracții ( Fr.1-10)cu silicagel CC (8 id×2{0 cm) eluând cu un gradient de CH2Cl-MeOH(100:0,95:5,90:10,80:20, 70 :30,50:50,0:100,v/v). Fr.4(32 g) a fost încărcat pe o coloană de gel MCI (6i.d.×20 cm) și eluat cu un gradient de MeOH-H,O（0∶{100-100∶0,v/ø）la permite optsprezece subfracții (Fr4-1-4-18). Separarea subfracției Fr{4-14(3,0 g) a fost realizată printr-o altă coloană de silicagel (3i.d.×20 cm) eluând cu un gradient de CH2Cl{{48 }}MeOH (97:3-80:20, o/v) și Sephadex LH-20 CCeluarea cu CH2Cl{2-MeOH(1:1,v/o) pentru a da 7(11,3 mg ), 8 (10,6 mg), 9 (9,3 mg), 10 (20,6 mg), 11 (7,6 mg) și 12 (6,2 mg). Fr 6 (4,2 g) a fost aplicat pe coloana ODS C18 și eluat cu MeOH-H2O (20:80-80:20) pentru a obține 9 subfracții (Fr 6-1-6-9). Separarea ulterioară a subfracției Fr 6-4(1,2 g) folosind Sephadex LH-20 CC (eluat cu MeOH-H2O,10:90-100:0) a dat compușii 1(9,6 mg),5( 7,2 mg) și 6 (7,3 mg), respectiv. Compușii 2 (tR 130,5 min, 5,2 mg), 3 (tR 146,8 min, 9,6 mg) și 4 (tR 177,2 min, 15,3 mg) au fost obținuți din Fr7 (2,5 g) prin HPLC semipreparativ, eluând cu un gradient de MeOH-H2O( 20:80-40:60, / u, 0-250 min).

3.4.Date spectroscopice

Tanin de whisky C (1):Pudră amorfă maro; [ ]-12,6 grade (c= 0,16, MeOH); UV （MeOH）λmaxnm （log e）∶2{03（2,02）,276（1,19）; CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1 Date 13C RMN manual, vezi Tabelul 1; HRESIMSm/z:[MH]{{24} },1240 (calculat pentru C4sH33027-, 1005,1215). 1-O-({4-metoxigaloil)-6-O-galoil{-2,{3-O-(S)-hexahidroxidifenoil{- -D-glucoză( 2): pulbere amorfă maro pulbere amorfă; 【 】5-5,5 grade （c=0,17, MeOH）; UV（MeOH） 入max nm (log e）~203 (2,52), 275 (2,01); CD （MeOH）λmax（△8）264（-8,0）,238（30,6）,218（1,3）.'H și 13C-RMN date, vezi Tabelul 2; HRESIMS m/z: 799,0983[MH]-(calculat pentru C3sH2022-, 799,099).

{{0}}O-galoil-6-O-({3-metoxigaloil)-2,{3-O-(S)-hexahidroxidifenol-6- D-glucoză(3); Pulbere amorfă maro;【 】7-33.5 grade （c{=0.12, MeOH）; UV（MeOH）入max nm (log e）∶203 (2,40), 273 (1,68); CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（-2.7）.'Hand13CNMR date,vezi Tabelul 2;HRESIMS m.10:0769 [MH]-(calculat pentru C35H2022-, 799,0999). 1-O-galoil-6-O-vaniloil-2,3-O-(S)-hexahidroxidifenoil{- -D-glucoză (4): pulbere amorfă maro; 【 】7-20.6 grade （c{=0.15, MeOH）; UV（MeOH）λmax nm (log e）∶203 (2,42),278（1.86); CD（MeOH）λmax（△e）263（-12.1）, 239 (42.5）, 219（0.9）.'H și date 13CNMR, vezi Tabelul 2; HRESIMS m/z: 783 [MH]-1032. (calculat pentru C35H27O21-, 783,1050).

3.5. Hidroliza acidă a 2-4

Compusul 2 (2 mg) a fost tratat cu HCI 1 M (5 ml) la 80 grade timp de 4 ore, apoi extras cu acetat de etil (3 x 5 ml). Faza apoasă a fost uscată sub un curent de N2 pentru a genera un reziduu neutru care a fost analizat utilizând TLC(Si02) cu EtOAc-piridină-EtOH-H, O(7:1:1:2) ca sistem de solvent. Valoarea R a reziduului neutru a fost aceeași cu cea a D-glucozei autentice, indicând că componenta zahărului din 2 a fost glucoză. Reziduul neutru și 5 mg clorhidrat de ester metilic al L-cisteinei au fost dizolvate succesiv în 3 ml de piridină anhidră și încălzite la 80 de grade timp de 1 oră. După îndepărtarea solventului prin evaporare la presiune redusă, amestecul de reacţie a reacţionat ulterior cu 0,6 ml de N-trimetilsililimidazol la 80 de grade timp de 1 oră. Amestecul de reacție a fost împărțit cu n-hexan și H,O și apoi stratul de n-hexan a fost analizat cu un instrument GC. Temperaturile injectorului și detectorului au fost stabilite la 250 de grade, respectiv 280 de grade. Temperatura inițială a coloanei a fost menținută la 160 de grade timp de 1 min, apoi a crescut la 280C la 5 grade/min și a fost menținută timp de 10 min. D-glucoza autentică și L-glucoza autentică au fost sililate și analizate în același mod, iar timpii lor de retenție au fost de 19,09, respectiv 19,25 min. Rezultatele analizei GC au indicat că componenta de zahăr din 2 a fost D-glucoză (t 19,1 min). Componentele zahărului din 3 și 4 au fost determinate folosind aceeași procedură.

3.6. Activitate antiinflamatoare

3.6.1.NO Producție de celule RAW 264.7 stimulate cu LPS

Celulele RAW 264.7 au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS la 37 de grade într-o atmosferă umidificată de 5% CO2 timp de 24 de ore. Celulele dintr-o placă de 24-godeuri (5 x 104 celule/godeu) au fost tratate cu 200 ng/mL LPS și compușii de testat. După 22 de ore, mediile au fost colectate, iar nivelul de nitriți a fost măsurat folosind sistemul de reactiv Griess (Promega, Madison, WI, SUA).

3.6.2. Viabilitatea celulei

Testul MTT a fost efectuat pentru a măsura citotoxicitatea probelor de testat pe linia celulară RAW264.7. Celulele care se aflau în faza de creștere logaritmică au fost însămânțate într-o placă de 96-godeuri la densitatea de 5 × 10 plus -6 × 10* celule/godeu și incubate la 37 de grade cu 5 procente de CO, timp de 24 h. Apoi, celulele au fost tratate cu 100 μL de mediu de cultură la diferite concentrații de probe de testat timp de 24 de ore. Mediul a fost aruncat și 100 uL de mediu fără FBS care conține MTT (1 mg/mL) au fost adăugate în fiecare godeu. După incubare în incubator timp de 4 ore, supernatantul a fost aruncat și 100 μL de DMSO au fost adăugate în fiecare godeu pentru a dizolva formazanul. Absorbanța a fost măsurată la 570 nm folosind un cititor de microplăci.

3.7. Activitate anti-Ty/rosinaza

Activitățile anti-tirozinază ale izolatelor au fost investigate conform procedurii descrise de Aoki și colab. cu mici modificări [21]. L-DOPA și acidul kojic au fost utilizate ca substrat și, respectiv, martor pozitiv. Soluție de L-DOPA la 5,0 mM, tirozinaza de ciuperci la 100 U/mL, precum și probe la diferite concentrații au fost preparate în tampon fosfat (pH6,8), 20 μL de soluție de probă și 10 μL de soluție de tirozinază de ciuperci au fost amestecate și preincubate la 37 de grade timp de 10 minute, apoi au fost adăugate 40 uL de soluție de L-DOPA și incubate la 37 de grade timp de 5 minute. Sistemul de reacție al experimentului de activitate anti-tirozinază este prezentat în Tabelul 4. Absorbanța a fost măsurată la 475 nm folosind cititorul de microplăci multimod Spark 10M (Tecan Trading AG, Zurich, Elveția). Toate testele au fost repetate de trei ori și de fiecare dată în trei exemplare. Procentul de inhibare a activității tirozinazei a fost calculat folosind următoarea formulă:

unde T reprezintă absorbanța cu proba și tirozinaza; To reprezintă absorbanța cu o probă, dar fără tirozinază; C reprezintă absorbanța cu tirozinaza, dar fără probă; Co reprezintă absorbanța fără tirozinază și probă.

4. Concluzii

Studiul este destinat să exploreze mai multe activități antiinflamatorii și inhibitorii enzimatic ale polifenolilor din rădăcinile M.normale pe baza lucrărilor noastre anterioare [20]. După cum era de așteptat, 12 polifenoli au fost obținuți din planta de plăci pentru prima dată, iar compusul 1-4 a fost elagitanin nou. Izolarea cu succes și identificarea structurii elagitaninei oferă materiale pentru screeningul medicamentelor antiinflamatoare și inhibitorilor de enzime și, de asemenea, contribuie la dezvoltarea și utilizarea M.normale. Elagitaninele 1-4 nu au activități semnificative de inhibiție a tirozinazei și activități antiinflamatorii, ceea ce îl face mai puțin probabil să fie un potențial medicament antiinflamator sau un inhibitor enzimatic. Din fericire, au efecte noi, cum ar fi anti-obezitatea [6,7]. Flavonoidele au activități enzimatice antiinflamatorii și inhibitorii mai bune decât elagitaninele din rădăcinile M. normale și sunt mai susceptibile de a fi inhibitori antiinflamatori și antienzimatici. Studiul relației structură-activitate este util pentru a găsi noi medicamente antiinflamatoare și inhibitori de enzime.

Acest articol este extras din Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules