Caracterizarea structurală a polizaharidei Cistanche Deserticola și a efectului său protector asupra HK cu celule HK induse de glucoză -2

Abstract:

 

Obiectiv: Studierea structurii Cistanche Deserticola Polysacharide (CDP) și efectul de protecție și mecanismul celulelor epiteliale tubulare proximale umane (HK {{0}}). Metode: Compoziția chimică, greutatea moleculară, compoziția monosacharidelor și structura posibilă a CDP -urilor au fost detectate prin metoda fenolului acidului sulfuric, metoda hidroxil bifenil, metoda albastru strălucitor Coomassie, metoda cromatografiei ionice, cromatografia de permeare a gelului de înaltă performanță și cromatografia infraroșu. Efectul de protecție al CDP -urilor asupra accidentării HK -2 și mecanismului său au fost evaluate prin stabilirea unui model de daune al celulelor HK -2 induse de glucoză ridicată.Resulte: Greutatea moleculară medie a CDPS a fost de 8 0 31,4198.344 KDA, care a fost compus în principal și al glucozei, galactozei, rhamnose, care a fost compus în principal și al glucozei, galactozei, rhamnose, care a fost compus în principal și al glucozei, galactoze, rhamnose, care a fost compus în principal și al glucozei, galactose, rhamnose, care a fost main Arabinoza și poate exista o legătură -glicosidică. Poate reduce deteriorarea oxidativă a celulelor HK -2 induse de glucoză ridicată și deteriorarea potențialului de membrană mitocondrială a celulelor HK -2 induse de glucoză ridicată. Expresia relativă a proteinei receptorului 4 (TLR4) Toll și raportul dintre factorul p -nuclear (NF) -κB p65 / -actină și p -IκB / -actină în celulele HK -2 au fost semnificativ scăzute după intervenția cu diferite concentrații de CDP (P <0,05, p <0,01). Concluzie: CDP -urile pot reduce ridicatCelula epitelială tubulară renală indusă de glucozăLeziunea prin inhibarea TLR4 / NF-κB pentru a promova proliferarea celulară și a inhiba stresul oxidativ și apoptoza.

 

Cuvinte cheie: Cistanche Deserticola Polizaharidă; Celule epiteliale tubulare renale umane; Stres oxidativ; Calea TLR4/NF-κB

 

 

 

Cistanche pentru nefropatie pentru diabet (DN)

 

Nefropatie pentru diabet (DN)este principala cauză a bolii renale în stadiu final și amenință serios viața și sănătatea pacienților [1]. Lezarea tubulară renală joacă un rol cheie în apariția și dezvoltarea DN. Anomaliile hemodinamice, stresul oxidativ, răspunsul inflamator și anomaliile metabolice cauzate de un mediu cu zahăr ridicat pot induce apoptoza și necroza celulelor epiteliale tubulare renale, ceea ce duce la deteriorarea tubulară renală [2,3]. TLR4 la rinichi este membru al familiei TLRS, iar transducția semnalului aferent joacă un rol important în apariția și dezvoltarea DN [4]. În condiții ridicate de glucoză, expresia ridicată a TLR4 la rinichi poate activa calea NF-κB, agravând deteriorarea oxidativă celulară și provocând HK -2 apoptoză celulară [5, 6].
Cistanches Herba este tulpina cărnoasă uscată cu frunze de fosfor din Cistanche Deserticola Ycma și (sau) Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, o plantă tradițională medicinală și comestibilă. Are un gust dulce, sărat,

Se încălzește și intră înMeridieni de rinichi și intestinuri mari. Are efectele tonificării yang -ului rinichi, îmbunătățirea esenței și sângelui și umeziind intestinele și ameliorarea constipației. [7] Polizaharidele sunt unul dintre principalele ingrediente active ale Cistanche Deserticola. Conținutul de polizaharide din extractul de apă din Cistanche Deserticola este relativ ridicat, literatura raportând că conținutul este de 29,598 până la 39.609 mg/g [8]. Este compus în principal din glucoză, galactoză, ramnoză, arabinoză, fructoză, etc. Este compus din monosacharide și are multe efecte farmacologice, inclusiv reglarea activității imunitare, anti-îmbătrânire, îmbunătățirea învățării și memoria, protejarea nervilor, rezistența la leziuni hepatice, anti-virus și anti-tumorii [9]. În ultimii ani, un număr mare de studii au arătat că polizaharidele din medicina tradițională chineză poate îmbunătăți nefropatia diabetică. Caracteristicile multi-țintă, multi-căi și efectele semnificative ale polizaharidelor pe bază de plante chinezești arată un potențial mare în interventarea nefropatiei diabetice [10]. În studiul lui Wang și colab. [11], polizaharidele Banyan au arătat efecte semnificative în îmbunătățirea metabolismului glucozei și lipidelor, reducerea răspunsurilor inflamatorii și reglarea microbiotei intestinale a șoarecilor diabetici de tip 2 prin axa intestinului-ficat. Studiile anterioare realizate de echipa de cercetare au arătat că extractul de apă din Cistanche Deserticola poate crește rata de supraviețuire a celulelor HK -2 într-un mediu cu conținut ridicat de zahăr și cu conținut ridicat de grăsimi, reglează apoptoza celulară, stresul oxidativ și nivelurile de inflamație și are un efect terapeutic potențial asupra nefropatiei diabetice [12]. Rezultatele experimentale animale au arătat că CDP -urile pot îmbunătăți eficient nefropatia diabetică la șoareci, iar rezultatele patologice au arătat că fibroza tubulară renală a fost îmbunătățită semnificativ [13]. Cu toate acestea, există puține studii privind rolul polizaharidelor Cistanche Deserticola în protejarea modelului de celule HK HK HK -2. Având în vedere activitatea farmacologică potențială și mecanismul polizaharidelor, acest studiu își propune să detecteze compoziția chimică, structura moleculară și structura moleculară a CDP -urilor prin utilizarea metodei fenolului acidului sulfuric, a metodei hidroxibifenil, metoda de coomasie strălucitoare, cromatografie ionică, cromatografie de gel de performanță de performanță de înaltă performanță și cromatografie infrarosă. Au fost analizate masa, compoziția monosacharidelor și structura posibilă și a fost stabilit un model de deteriorare a celulelor HK -2 induse de glucoză ridicată pentru a evalua efectul protector al CDP -urilor asupra deteriorării HK -2 și a mecanismului său de acțiune. Oferiți o bază teoretică și dovezi experimentale pentru aplicarea potențială a CDP -urilor în tratamentul DN.

1 materiale și metode
1.1 Materiale și instrumente

CDPS (Conținut PolySacharide> 8 0%, număr de lot: 2306019, compania shaanxi xintianyu); dapagliflozin (DAPA, număr de lot: BMS -512148, AstraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); Celule epiteliale tubulare renale umane HK -2 (Numărul lotului: 20231014, Actt Company, SUA); Mediul de cultură MEM, serul bovin fetal (număr de lot: 20231014, 20231014, Gibco Company, SUA); Buffer PBS (număr de lot: 20230906, Hyclone Company, SUA); 0,25% soluție de digestie de tripsină care conține EDTA (număr de lot: 20240411, Anhui BioSharp Company); CCK -8 Kit de detectare a viabilității celulare (număr de lot: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); superoxid dismutaza (SOD), malondialdehidă (MDA), glutation peroxidază
Peroxidază, GSH-PX) Kit de detectare (nr. Lot.: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Youxuan Biotechnology Co., Ltd.); HOECHST33258 KIT APOPTOSIE COMINETĂ (nr. Lot.: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 colorare
Kit de detectare a potențialului membranei mitocondriale (lot nr.: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Diclorofluoresceina diacetatului (DCF-DA) Specia de oxigen reactiv (ROS) reactiv de detectare
Kit (lotul nr.: 20231225, Beijing Solebow Technology Co., Ltd.); Anticorp monoclonal TLR4, factor nuclear fosforilat κB p65 (fosfo-NF-κB p65, P-NF-κB p65) anticorp monoclonal (lotul nr.: 10032512, 00128965, Wuhan Sanying Biotechnology Co., Ltd.).

Cromatograf ion ICS5000, cititor de microplați Mul-Tigo (Thermo Fisher, SUA); PowerPac HC+Mini Protein Electroforeză Instrument (Biorad, SUA); Microscop inversat TS2 (Nikon, Japonia); Lc -10 Un cromatograf lichid de înaltă performanță, ri -20 un detector diferențial (Shimadzu Technology Co., Ltd., Japonia); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) coloana de gel tandem (BRT Company, Marea Britanie); CPA225D Electronic Balance, Eppendorf5424 Centrifuge (Sartorius, Germania).

 

1.2 Metode experimentale
1.2.1 Determinarea zahărului total, acidului uronic și a conținutului de proteine ​​din CDP

Metoda a fost urmată conform referinței [14]. Conținutul total de zahăr al CDP-urilor a fost determinat prin metoda acidului fenol-sulfuric; Conținutul de acid uronic al CDP-urilor a fost determinat prin metoda colorimetrică M-hidroxibifenil; iar conținutul de proteine ​​al CDP -urilor a fost determinat prin metoda albastru strălucitor Coomassie.

 

1.2.2 Determinarea masei moleculare

Distribuția în greutate moleculară a polizaharidelor a fost detectată de coloanele tandem de cromatografie cu permeare a gelului de înaltă performanță. A series of standard dextran (Dextran P{{0}}, P-10, P-20, P-50, P-100, P-200, P-400 and P-800) and samples were dissolved in 0. 0 5 mol/l înainte de utilizare. Concentrația finală a fost de 5 mg/ml, vortexată de dizolvare și centrifugată la 12 0 00 r/min timp de 10 min. Supernatantul a fost aspirat și filtrat cu o membrană microporoasă de apă de 0,22 μm. După centrifugare de mare viteză, 0,05 mol/L NaCl a fost utilizat ca fază mobilă. Coloana cromatografică a fost BRT 105-103-101 (8 mm × 300 mm); debitul a fost de 0,7 ml /min; Temperatura coloanei: 40 grade; Volumul de injecție: 25 µl; detector: detector diferențial Rid -20 a; Timp de analiză: 62 min. Selectați metoda cromatografică de mai sus pentru analiză, obțineți timpul de retenție și trageți logaritmul greutății moleculare de vârf (MP) pe ordonat (LGMP) și timpul de retenție (RT) de pe abscis (LGMP-RT). Curba standard: Conform metodei de mai sus, Timpul de retenție de retenție LGMW-RT au fost făcute cu greutate moleculară cu greutate moleculară (Mn) Timp de retenție LGMW-RT și număr mediu de greutate moleculară (Mn) Curba standard LGMN-RT pentru obținerea greutății moleculare. Formula de calcul. Înlocuirea timpului de retenție a eșantionului în formulă, se poate obține greutatea moleculară (MP, MW, Mn).

1.2.3 Compoziție monosacharide

Compoziția monosacharide a fost determinată folosind cromatografie ionică. Luați cantități adecvate de 16 standarde de monosacharide (fucoză, ramnoză, arabinoză, galactoză, glucoză, xiloză, manoză, fructoză, riboză, acid galacturonic, acid glucuronic, clorhidrat de aminogalactoză) au fost adăugate cu acid de gluconic, acid mannuronic) ML de 3 mol/L acid trifluoroacetic (TFA), hidrolizat la 120 de grade timp de 3 ore, uscat cu azot și adăugat pentru a îndepărta vortexul apa deionizată pentru a amesteca bine și a pregăti soluția stoc standard. Luați fiecare soluție standard monosacharide și pregătiți cu exactitate standardul de concentrație ca standard mixt. Conform metodei de cuantificare absolută, s -au determinat masele de monosacharide diferite, iar raportul molar a fost calculat pe baza masei molare a monosacharidelor.
Adăugați 2 ml de 3 mol/l tfa la polizaharide și reacționați la gradul 12 0 pentru 3 ore. În timpul reacției, N2 a fost utilizat pentru protecție. Se dizolvă după evaporare sub presiune redusă. Adăugați 5 ml de apă și vortex pentru a se amesteca. Luați 5 0 µl și adăugați 950 ul de apă deionizată. Centrifugă la RPM timp de 5 minute. Supernatantul a fost filtrat printr -o membrană de microfiltrare de 0,22 um și analizată prin cromatografie ionică. Coloana a fost Dionex CarbopactM PA20 (3 mm × 150 mm); Faza mobilă a fost A: H2O; B: 15 mol/lnaoh; C: 15 mol/ L NaOH și 100 mol/ L NAAC; debit: 0,3 ml/min; Volumul de injecție: 25 ul; Temperatura coloanei: 30 de grade;. Detector: detector electrochimic; Gradient de eluție vezi Tabelul 1.

 

Tabelul 1 Tabelul de eluare a gradientului în faza mobilă

 

 

1.2.4 Detectarea spectrului infraroșu

Cântăriți 1 mg de polizaharidă uscată și pulbere KBR, macinați -le și amestecați -le într -un mortar și apăsați -le în foi subțiri folosind o presă de tabletă. Analiza a fost realizată folosind spectrometru infraroșu transformat Fourier în intervalul de număr de undă de 4500 ~ 400cm -1.

 

1.2.5 Efect protector al CDP-urilor asupra celulelor HK HK ridicate de glucoză -2 în nefropatie diabetică

1.2.5.1 hk -2 cultura celulară

După ce celulele HK {{0}} au fost reînviate, acestea au fost cultivate în mediu complet, conținând 10% ser bovin fetal și 1% anticorp dublu, iar celulele au fost plasate într -un incubator de cultură celulară la 37 de grade, 5% CO2 și umiditate saturată pentru a adera la perete. . Când celulele cresc la 80% până la 90%, acestea sunt digerate cu 0,25% tripsină și subculturate. Pentru experimentele ulterioare au fost utilizate celule HK -2} în faza de creștere logaritmică.

 

1.2.5.2 Prepararea soluției stoc CDPS și a concentrației de dozare.

Cântăriți cu exactitate 3 0 mg de CDPS, adăugați 6 ml de mediu complet cu glucoză mare pentru a pregăti o soluție de stoc CDP de 5 mg/ml și depozitați-l într-un frigider de 4 grade. Când utilizați, măsurați un anumit volum de soluție mamă CDPS, adăugați mediu de cultură, amestecați bine, sterilizați cu un filtru steril de 0,22 µm și pregătiți o soluție de probă de concentrație adecvată.

 

1.2.5.3 Efectele CDP -urilor asupra celulelor normale HK -2

Celulele hk -2 în faza de creștere logaritmică au fost însămânțate în plăci de puț 96- la o densitate de 3000 de celule/bine. Conform rezultatelor experimentale preliminare, celulele au fost împărțite într -un grup de control normal (grup de control, CON), concentrații diferite de masă (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/ml)
A fost înființat un grup gol care conține doar un mediu de cultură; După ce a cultivat cu mediu de cultură sau medicamente timp de 24 de ore și 48 de ore, s -au adăugat 100 µl de mediu de cultură conținând 10% CCK -8 la fiecare godeu și celulele au fost incubate la 37 de grade pentru a evita plecarea la lumină timp de 1,5 ore. Densitatea optică (OD) a fiecărui godeu a fost măsurată la o lungime de undă de 450 nm folosind un cititor de microplate, iar viabilitatea celulară (%) a fost calculată în funcție de formula „Viabilitatea celulară (%)=[(OD a fântânii medicamentului - od de puțuri goale) (OD a puțului de control / OD - OD al puțului)] × 100%” pentru a calcula rata de supraviețuire a celulelor și evaluarea la celulele normale.

1.2.5.4 HK -2 Timp de modelare a glucozei ridicate și screening de concentrare
Pregătiți soluția stoc de glucoză (glucoză, GLC) (10 mg/ml) și diluați -o cu mediu de cultură complet până la concentrații de modelare de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 și, respectiv, 80 mmol/L pentru utilizare. Celulele HK -2 în faza de creștere logaritmică au fost însămânțate în plăci de puț 96- la 3000/puț, iar CON, grup de model (model, mod) și, respectiv, grupul de ajustare necompletat și au dat, respectiv, mediu de cultură de cultură completă. , o cantitate egală de mediu de cultură complet, cultură timp de 24 de ore și 48 de ore și detectați viabilitatea celulelor conform metodei sub „1.2.5.3”.

 

1.2.5.5 Efectul CDP -urilor asupra ratei de supraviețuire a celulelor model

Conform rezultatelor experimentale ale „1.2.5.4”, celulele HK -2 în faza de creștere logaritmică au fost însămânțate în plăci de puț 96- la o densitate de 3000 de celule pe godeu. Celulele au fost împărțite în Con, mod și diferite concentrații de masă de 50, 100 și 200 de celule au fost cultivate la 400 ug/ml, 400 ug/ml și 800 UG/ml CDPS. A fost creată un grup de ajustare gol fără celule. Au fost adăugate grupuri de ajustare con și necompletate cu o cantitate egală de mediu complet. MOD și fiecare grup tratat cu medicamente au fost adăugate cu 60 mmol/L GLC și cultivate timp de 24 de ore. , aruncați mediul de cultură, adăugați mediul de cultură sau medicamentele și cultura corespunzătoare timp de 24 de ore și 48 de ore și detectați rata de supraviețuire a celulelor conform metodei sub „1.2.5.3”.

 

1.2.5.6 Efectele CDP -urilor asupra indicatorilor de stres oxidativ în celulele model

Conform rezultatelor experimentului din „1.2.5.5”, celulele au fost împărțite în grup CON, MOD, cu doză mare CDPS (CDPS-H, 400 mg/kg), grup CDPS cu doză medie (CDPS-M, 200 mg/kg), grupul CDPS cu doze mici (CDPS-L, 100 mg/kg) și dapagliflozin fără celule a fost amenajat în grupul, 10 μmol/L), și un grup fără celule S-a adăugat și cultivat grupul de ajustare zero, după modelare, mediu de cultură sau medicamente corespunzătoare timp de 24 de ore. Proteinele au fost colectate și lizații au fost normalizați la același nivel prin corecția concentrației de proteine. Conform instrucțiunilor fiecărui kit de indicatori, au fost detectate MDA, conținut GSH-PX și activitate SOD în fiecare grup de celule.

 

1.2.5.7 Detectarea ROS în celulele HK -2

Adăugați suspensia celulară într -o placă de puț 6- și așezați -o într -un incubator de cultură celulară până când celulele cresc într -un monostrat și primesc stimularea corespunzătoare. Spălați celulele de 3 ori cu PBS pre-răcite și diluați cu mediu MEM fără ser. Colorantul fluorescent DCF-DA a fost diluat la o concentrație finală de 10 µmol/L. Colorantul a fost adăugat la o placă de puț 6-, celulele au fost spălate de 3 ori cu PBS pre-răcite, iar colorantul fluorescent DCFH-DA a fost diluat la o concentrație finală de 10 µmol/L cu mediu MEM fără ser. µmol/L, colorantul a fost adăugat la o placă de puț 6-, colorantul a fost aruncat, celulele au fost spălate de trei ori cu mediu MEM fără ser, iar apoi imaginile au fost colectate la un microscop fluorescent.